专利名称：通过同源重组用于基因断裂的选择细胞的快速方法
背景技术：
发明领域本发明主要涉及以修饰遗传位点为目的的细胞控制，本发明具体涉及在细胞中用于产生遗传修饰的载体和方法。
背景技术：
为了各种目的，在不同实例中外源性遗传物质稳定介入原核生物和真核生物的基因组已成功完成，例如，外源基因的表达或内源基因座的断裂。其主要通过或随机基因组插入或位点特异性同源重组完成。随机整合包含线性DNA片段在大部分为非位点特异性的位置插入宿主细胞的基因组。这些插入倾向以多聚体或多联体存在，大多数不导致特殊基因座的断裂和失活。内源基因位点可以由于随机插入事件而断裂的可能性也是存在的，这样外源基因对转换细胞衍生的细胞或有机物的作用的分析具有困难。另外，依靠整合区域可以获得外源启动子活性的有效范围。
通过位点特异性同源重组，DNA插入宿主基因组，获得宿主基因组特殊区域的靶向以至外源DNA的单拷贝整合。同源重组涉及通过特异重组酶的作用，有效改变相似核苷酸序列。早期设计的试验以酵母为模型系统，用外源性DNA在以位点特异性的方式控制细胞内源性基因组DNA序列。重组在酵母基因组和通过在leu2.sup位点转化导入的外源质粒之间展示(Hinnen等人.(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，1929)。最近，哺乳动物细胞的同源重组潜力的利用已获得在细胞内源基因组DNA中特异突变DNA序列的形成。在干细胞和所述细胞(见后)生成的动物两者中已生成功能增加和功能丢失的等位基因。另外，正-负选择性载体和方法的应用促进了含突变DNA序列的细胞和动物的生成和研究(Capecchi等人.(1997)U.S.专利#5,631,153)。到目前为止，已设计的两种主要载体类型允许在靶向基因组的特异区用外源DNA序列替代内源序列。这些载体已证明在大量不同类型细胞足以产生各种靶向等位基因。
插入载体包含两个同源区域，侧于编码可选择标记的内核苷序列。该载体被线性置于同源区域之一。一个单独交换事件和同源重组导致基因序列的部分复制。染色体内的重组常导致内源性复制序列的排斥。这种类型的靶向载体的缺点是缺乏负性可选择标记，其通过消灭包含主链和载体序列的细胞可以有效增进正确的靶向。另外，在同源区域内的线性化减少了能用于同源重组的DNA序列的数量，这样就降低了链交换机会(Thomas等人.(1986)，Cell，44，49)。最终，染色体内的重组必须产生在限定区域或者可以发生位点的不稳定型有机物的再生。
替代载体通常包含两个侧于可选择的正标记的同源区域，例如编码新霉素转磷酸酶的基因。一个负的可选择标记常居于外侧但是毗邻于同源区域的某一个，通过灭活含有负性可选择序列盒的细胞以在整个群体中提供准确的靶向细胞的富集。通过同时或者逐步的正性和负性选择尾随替代载体导入细胞导致细胞分离，由于负性可选择标记的应用，进行区域特异的同源重组的可能性增加了8-12倍。或许，在哺乳动物细胞第一次成功的基因靶向试验，Capecchi等人展示了通过载体替代的应用靶向小鼠HPRT和int-2位点(Capecchi等人.，(1997)，U.S.专利#35,631,53)。从此，更多的位点被成功靶向，一些是通过插入载体，大多数是通过替代载体。这些载体中的多数包括了位于同源区域的一侧或两侧外部的负性可选择标记，其常导致靶向等位基因鉴别效率的提高。迄今不利因素的多少与替代载体和正-负选择的方法和利用有关。负性可选择盒的大量应用如HSV胸苷激酶需要加入一种抗生素或选择的试剂，例如更昔洛韦(gancyclovir)，其可以取消细胞的应激和不需要的或早熟的分化。另外，由于缺乏可选择标记而耐药，用负性可选择标记选择富集细胞要花费相当时间使细胞恢复。此外，用这种方法获得典型的富集因子至少是8-12倍之间。同样的，正-负选择载体的生产常有策略困难和时间消耗。
已经设计了可选择的正选择方法，其不包括正-负选择的利用。这些方法包括通过框内基因与靶基因融合和显性可选择标记的条件表达策略的应用。利用耐受标记新霉素转磷酸酶Sedivy等人展示多瘤中层T抗原(pmi)位点的成功基因靶向(Sedivy等人(1989)，国家科学院报告(Proc.Natl.Acard.Sci.)，86，227)。然而，一种药的可选择耐受标记的实施以检测位点介导的同源重组事件对经历选择的细胞是有侵袭性和有毒性的。本发明围绕这些问题描述了该技术。
通过位点特异性的同源重组，有特异突变位点的胚胎干细胞也已产生许多动物。这些动物包括来自于嵌合物的小鼠，其是通过在特异位点同源重组靶向的胚胎干细胞注射胚泡产生。有些例子包括p53和paraxis位点(Donehower等人.(1992)，自然，356，215；Burgess等人.(1996)，自然，384，570)。猪也可以来自包括猪的同源重组修饰的胚胎干细胞。(Butler等人.(2002)，自然，415，103)。
发明概述本发明提供在真核细胞通过用靶DNA同源重组载体DNA修饰基因组DNA序列的方法。本方法首先要求的是具备用载体进行同源重组能力的细胞的转化，此处是指负ATG荧光蛋白基因靶向载体(AMFP)含有大体与细胞的基因组中的序列相似的序列(
图1、2、3)。整合进宿主细胞基因组载体的大部分基本是随机形式发生，没有优先的基因组的特别区域。但是，有理由提示，通过位点特异性的同源重组，一定比例的AMFP基因靶向载体将整合进宿主细胞基因组。随后的细胞选择将获得已经成功进行位点特异性的同源重组的细胞的分离和鉴别(图4)。该选择是基于AMFT置换载体的结构和组成。
载体组成为与宿主细胞基因内存在的序列明显同源的第一DNA序列。另外，载体包含第三DNA序列，其与宿主细胞基因组第一序列的下游或上游的其他序列明显同源。在这两个区域之间，载体含有第二DNA序列，其与宿主基因组存在的序列非明显同源，其赋予细胞鉴别载体序列整合进所述基因组的能力。第二DNA序列是有用的，它能鉴定经过内源序列进行载体同源重组的细胞。另外，通过实施和使用提供的步骤和载体，本发明包括具有特异遗传修饰细胞产生的细胞和生物。
在第一实施例中，本发明提供一种方法，鉴别利用AMFP基因靶向载体进行了位点特异性同源重组的转化细胞。该方法包括
a)用AMFP基因靶向载体转化细胞，该载体被设计进行位点特异性的同源重组，其中载体包括与宿主基因组内存在的内源基因组序列实质上同源的第一DNA序列；第二DNA序列，其缺乏足以驱动其表达的调节因子，在所述细胞编码缺乏编码初始蛋氨酸的核苷序列的荧光蛋白可选择标记，与细胞内源基因组序列为非同源，因此不能进行位点特异性的同源重组；第三DNA序列，其与存在于宿主基因组的内源基因组序列实质上同源，但不同于第一DNA序列。
其中通过有内源基因组靶序列的第一DNA序列和有内源基因组靶DNA序列的第三DNA序列之间的链交换，载体能进行细胞内位点特异性同源重组。
其中在AMFP载体中的DNA序列的结构是实质上与靶DNA序列同源的第一DNA序列，缺乏足以启动其表达并编码缺乏编码初始蛋氨酸的核苷序列的荧光蛋白可选择标记的调节因子的第二DNA序列，实质上与靶DNA序列同源的第三DNA序列；b)繁殖细胞以选择或富集用所述AMFP载体成功转化，并通过选择存在的所述第二DNA序列的功能性荧光蛋白可选择标记基因产物成功进行区域介导的同源重组的那些细胞，以及c)分离细胞，该细胞中所述的编码功能荧光蛋白可选择标记的第二DNA序列表达并翻译以使细胞中产生功能蛋白质产物，该可选择标记不含所述第二DNA序列或不能有效表达功能荧光蛋白产物。该方法还包括d)所述细胞的基因组DNA的特征是为区域特异的同源重组事件携带编码功能荧光蛋白可选择标记的第二DNA序列以修饰细胞靶DNA。
本发明的一个目的是提供位点特异性同源重组的方法以靶向真核细胞基因组的特异区域达到修饰内源核苷序列的目的。
本发明的另一个目的是提供选择和检测已进行位点特异性的同源重组的细胞的新方法。
本发明还有一个目的是提供应用于所述的方法的新载体。
本发明也还有一个目的是提供通过所述位点特异性同源重组的方法修饰的细胞。
本发明还有另一个实施方案提供通过位点特异性的同源重组被修饰的转基因动物和植物，和所述的检测方法。
附图简述图1.是在相同的外显子利用GFP围绕内在荧光蛋白可选择标记的靶外显子序列5’置换AMFP靶向理论上的基因位点的双交叉同源重组的简略描述图。
图2.是在外显子的下游利用GFP围绕内在正可选择标记的靶内含子序列5’置换AMFP靶向理论上的基因位点的双交叉同源重组的简略描述图。
图3.是置换AMFP靶向理论上基因位点的双交叉同源重组的简略描述图，其是利用内部正向可选择性标记的靶内含子和外显子序列5’和3’进行的，而内部正向可选择标记的GFP内部包裹在与同源剪切受体和剪切供体区域的内含子中。
图4.是通过AMFP基因靶向完成区域介导的同源重组的实施方法的流程描述。
图5.是置换AMFP靶向ptch2基因位点的双交叉同源重组的简略描述图。
图6.是置换AMFP靶向paraxis基因位点的单交叉同源重组的简略描述图。
发明详细描述本发明中描述的方法和载体是用于通过位点特异性同源重组对细胞内源基因组靶DNA序列介入修饰的目的。
术语“细胞内源性基因组DNA序列”，在本文是定义为在细胞基因组内存在的核苷酸序列，其能进行位点特异性同源重组，可以作为靶被本文描述的AMFP基因靶向载体修饰。包括在该定义的序列可以代表在细胞基因组中存在的特异基因的任何编码或非编码区域。编码这些蛋白质产物的基因如结构蛋白质、分泌蛋白质、激素、受体、酶，转录因子被包括在这个定义中。这些序列也代表调节因子，例如定义为启动子、增强子、或阻遏因子。细胞内源基因组靶DNA序列的结构与存在于AMFP基因靶向载体内的专一序列通常相似。这就是，它含有与AMFP基因靶向载体内存在的序列实质上同源的序列，其使得位点特异性同源重组发生。
术语“专一指令同源重组”意思是核苷酸成分实质相似的DNA序列之间链交换的交叉现象。这些交叉现象可以发生在AMFP基因靶向载体和细胞内源基因组DNA序列包含的序列之间。另外，在AMFP基因靶向载体和细胞内源基因组序列上存在的DNA序列之间可能发生不止一次的位点特异性同源重组事件，其可以导致置换事件，其中AMFP基因靶向载体中包含的DNA的序列置换了存在于细胞内源基因组序列的专一序列。同样的，在AMFP基因靶向载体和细胞内源基因组序列中存在的DNA序列之间可以发生单一位点特异性同源重组现象。其可以导致插入事件，在其中，大部分或全部AMFP基因靶向载体插入在细胞内源基因组序列的专一位置。
术语“第一DNA序列”意思是在AMFP基因靶向载体中存在的DNA序列，其实质上与细胞内源基因组序列同源。这些序列就是在其介入含有相似序列能进行所述重组的细胞时预测其能进行位点特异性同源重组。
术语“第二DNA序列”意思指编码荧光蛋白可选择标记的序列，其缺乏编码初始蛋氨酸的核苷酸序列，并不含驱动所述荧光蛋白可选择标记表达的启动子或调节因子。可选择标记居于第一和与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的第三DNA序列之间。可选择标记与细胞内源基因组DNA序列是非同源的，因此与这些序列没有位点特异性同源重组能力。
术语“第三DNA序列”意思是存在AMFP基因靶向载体中的DNA序列，其与细胞内源基因组序列实质上同源，也可以不同源，但可能邻近或在相当靠近第一DNA序列的这些序列中。这些序列就是在其引入含有相似序列能进行所述重组的细胞时预测其能进行位点特异性同源重组的序列。
在AMFP基因靶向载体置换中，第一、第二和第三DNA序列结构是这样的编码缺乏编码初始蛋氨酸的核苷酸序列的荧光蛋白可选择标记的第二DNA序列，其居于第一和第三DNA序列之间。图1、2和3描述了利用位点特异性的同源重组的三种不同类型的AMFP基因靶向载体的结构。
上游通常指载体中第一和第三DNA序列的5’，而下游是3’侧，载体第一和第三DNA序列都与细胞内源基因组序列的方向相似。这阐明5’和3’分别指第一和第三DNA序列。这种结构代表一种置换载体。另外，与细胞靶DNA相似序列比较，AMFP基因靶向载体的第一和第三序列的部分有可能互相之间相关转位。这种结构类型代表一种插入载体。插入载体常是将载体序列的大部分在位点特异性的同源重组的基础上引入细胞基因组。
在插入AMFP基因靶向载体中，第一、第二和第三序列的结构是这样的第三序列具有与载体线性后的第一序列相关的相反的5’到3’的方向。所述相反方向使得载体在位点特异性区域在AMFP基因靶向载体和细胞内源基因组DNA序列之间插入位点特异性同源重组后。在大多数例子中，整个载体将被插入，实质上同源DNA序列部分被复制。
AMFP基因靶向载体的长度依据荧光蛋白可选择标记的选择而变化，第一和第三DNA序列的长度要求合适的同源重组，基础载体的长度和细菌中质粒载体的筛选的选择例如氨苄青霉素耐药和质粒骨架复制启始的大小。然而，依据已知质�：驼裳≡癖昙堑拇笮。欣碛赏撇庹鲈靥宄ざ戎辽倩崾羌盖Ъ罨�。
术语“功能”在此的定义，与荧光蛋白可选择标记有关，赋予标记能够检测和分离含有编码荧光蛋白可选择标记的DNA的细胞的能力，允许这些细胞从既不包含荧光蛋白可选择标记，也不包含与第一荧光蛋白可选择标记比较是独特的荧光蛋白可选择标记的细胞中分化。在本发明中，如果相应的编码缺乏序列编码初始蛋氨酸的核苷酸序列，荧光蛋白可选择标记被认为是非功能性的。只是在与内源基因组靶序列重组时，获得编码初始蛋氨酸的核苷酸序列和获得能驱使荧光蛋白可选择标记表达和转化的调节因子，这才使得荧光蛋白可选择标记有功能。
表1.利用在AMFP载体的荧光蛋白可选择标记荧光蛋白质标记检测方法GFP 荧光标记CFP 荧光标记YFP 荧光标记RFP 荧光标记DsRED 荧光标记HcRED 荧光标记AMFP基因靶向载体包括两个同源区域，DNA序列一和三，其与宿主基因组的区域实质上同源。典型的，载体的与第一和第三DNA序列同源的长度为大约50和50,000碱基对之间。它也包括第二DNA序列，其编码荧光蛋白可选择标记，以在宿主细胞内基因组内鉴定是否存在完整或部分的AMFP载体。第二DNA序列编码荧光蛋白可选择标记，其缺乏编码初始蛋氨酸的序列，例如但不限于氰荧光蛋白质(cyan fluorescent proein CFP)，并位于两同源区域之间，因此它被包括在宿主基因组整体中，整合发生在位点特异性的同源重组上。筛选方法涉及通过显微镜或通过FACS细胞分类装置使细胞分类，该分类能使包含编码功能性荧光蛋白可选择标记的第二DNA序列的细胞同时或分别从在有功能容量上不包含所述标记的细胞分离。随后细胞可以在组织培养中繁殖并进行基因分型以校正位点特异性同源重组基因靶向结果(图4)。假定所述AMFP基因靶向方法无侵袭的属性，利用荧光蛋白可选择标记分离细胞实质上改善了靶向基因的现存的方法学，这些细胞经过了位点特异性的同源重组。
在本发明中利用的AMFP基因靶向载体是这样的结构使编码缺乏编码初始蛋氨酸的序列的荧光蛋白可选择标记的第二DNA序列可操作位于两同源区域之间。第二DNA序列有可能打乱或替代基因组内源区域的外显子或编码序列，其中可以发生位点特异性的同源重组，这样内源位点无活性，并因此无功能(图1)。
一方面，第二DNA序列可以是这样的位置，其替代或插入基因组的位置，不是在外显子或编码序列，如内含子、外显子的非翻译区或调节因子区如启动子。在这个方案中，选择在没有活性的特殊位点进行了位点特异性同源重组的细胞是可能的(图3)。
本发明也包括按照此文所述AMFP基因靶向载体和鉴别方法进行位点特异性同源重组的细胞。
另外，本发明包括转基因非人类动物，其来自利用此文所述的AMFP基因靶向载体和方法进行位点特异性同源重组的细胞。
也包括转基因植物，其来自利用此文所述的AMFP基因靶向载体和方法进行位点特异性同源重组的细胞。以前已经描述，经过位点特异性的同源重组的植物以及通过正反选择的基因靶向，因此可以补充此文所述的AMFP基因靶向载体和方法(Siebert等人.(2002)，植物细胞，14，1121；Hanin等人.(2001)，植物杂志(Plant J.)，28，671；Xiaohui等人.(2001)，基因，272，249)。
许多编码优选荧光蛋白可选择标记核苷酸序列存在第二DNA序列(表1)。这些序列得以选择携带荧光蛋白可选择标记的细胞，是为了从没有携带荧光蛋白可选择标记的细胞，或没有有效表达荧光标记可选择标记蛋白质产物功能译本的细胞区别开来。或许，用作第二DNA序列的最广泛利用的荧光蛋白可选择标记编码绿荧光标记蛋白质基因产物(Prascher等人.(1992)，基因，15，229)。其他适合第二DNA序列的荧光蛋白可选择标记，包括编码红荧光蛋白(RFP)、氰荧光蛋白(CFP)和黄荧光蛋白(YFP)的这些标记，但是并不限于此。这些荧光蛋白可选择标记中的几个也可以用于使用位点特异性同源重组的AMFP基因靶向载体的植物。
“突变中DNA序列”在此是指任何改变了细胞内源基因组DNA序列的序列。这样的改变可导致细胞DNA序列功能容量的失活。这样的改变也可增强细胞序列DNA的功能容量或对细胞DNA序列的功能容量无影响。
“突变的DNA序列”在此是指任何可在使用AMFP基因靶向载体的过程中接受改变的细胞内源基因组DNA序列。一般预测突变的DNA序列将在AMFP基因靶向载体和细胞内源基因组DNA序列之间的位点特异性同源重组作用下而产生。
“突变的靶细胞”是能够接受位点特异性性同源重组的细胞，它含有通过使用如在此所公开的存在于AMFP基因靶向载体中的突变DNA序列在细胞基因组内建立的突变DNA序列。
术语“实质上非同源的DNA”是指不含有与靶DNA序列相似并足以发生位点特异性同源重组过程的核苷酸序列的DNA序列。不相似序列的这种不能接受与靶DNA序列的位点特异性同源重组的能力的原因是两条序列之间碱基对组成的不匹配。
在细胞基因组中建立突变的DNA序列具有许多应用上的益处。例如X-连锁基因可用来分析组织培养中的功能关系，如果由AMFP基因靶向载体靶向的特定细胞类型是雄性来源的话。另外，采用AMFP基因靶向载体对胚胎干细胞的操作可建立研究人类疾病的动物模型。例如p53位点，已经成功的采用正-负选择技术在鼠胚胎干细胞中被灭活，这些细胞已被用于建立这个位点编码的蛋白产物缺陷的小鼠(Donehower等人，(1992)，Nature，356，215)。这些小鼠在发育上是正常的，但易于发生特发性肿瘤。AMFP基因靶向载体和技术可在胚胎干细胞和由所述细胞建立的动物中产生相似的基因修饰。AMFP基因靶向载体和技术的其他应用包括产生获取功能的等位基因，可研究许多细胞和生理现象。许多原癌基因已经被当作获取功能的等位基因来分析，包括c-myc，细胞周期蛋白D1和ErbB-2(综述见Hutchinson等人，(2000)，Oncogene，19，130)。使用AMFP基因靶向载体和在此所描述的方法可有效地进行胚胎干细胞和来自这些细胞的转基因动物的丧失和获取功能的研究。
AMFP基因靶向载体和方法可用于建立和鉴定已接受载体和细胞内源基因组靶序列之间位点特异性同源重组的细胞。载体实质上可富集鉴定接受所述过程的细胞。“实质上富集”是指明显增加鉴定接受载体和细胞DNA序列之间位点特异性同源重组的细胞可能性的能力。可能性的明显增加是当与非特异插入或整合事件相比，至少两倍的同源重组事件，优选至少10倍，更优选至少100倍，甚至更优选10,000倍。使用AMFP基因靶向载体获得的实质上富集的细胞群包括大约1％，更优选10％，甚至更优选99％的分离细胞接受了在AMFP基因靶向载体序列与细胞内源基因组靶序列之间的位点特异性同源重组。
在此所述的AMFP基因靶向载体和技术被用于纠正人体中的特异基因缺陷。例如，可能通过AMFP基因靶向载体和细胞内源基因组DNA序列之间的位点特异性同源重组在人干细胞中产生突变的DNA序列，随后将这些细胞移植到病人体内，以纠正特异的基因疾患或补充特异基因产物。基因灭活的其他潜在应用是细胞表面上蛋白受体的破坏。例如其中已经采用适当的AMFP基因靶向载体破坏了假定病毒受体表达的细胞系或生物体进行病毒检测，以证实受体实际上参与了病毒的感染。进一步，适当的AMFP基因靶向载体被用于产生特异基因缺陷的转基因动物模型。例如，许多基因缺陷已经通过特异基因不能表达功能基因产物而被定性，如α和β地中海贫血，血友�。咝�(Gaucher’s disease)和影响α1-抗胰蛋白酶，ADA，PNP，苯丙酮尿症，家族性高胆固醇血症和视网膜母细胞瘤产生的缺陷。含有一个或多个与这些疾病状态或编码特异基因缺陷的修饰作用有关的等位基因被破坏的转基因动物可用作治疗的模型。对于出生时成活的这些动物，可以进行实验性治疗。但当基因缺陷影响生存时，转基因动物的适当后代(如F0，F1)可用于研究基因治疗的体内技术。
AMFP基因靶向载体被设计特别用来在细胞的内源基因组DNA中突变DNA序列，所述细胞能够接受位点特异性性同源重组。AMFP基因靶向载体的成分包括至少一个与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的DNA区，一个使人能够从在与内源性基因组靶向序列位点特异性的同源重组上不含有编码荧光蛋白可选择标记的序列的细胞中鉴别含有荧光蛋白可选择标记的细胞的编码缺乏调节元件的荧光蛋白可选择标记或编码初始蛋氨酸的核苷酸序列的DNA序列。(图1)另外，优选的是，AMFP基因靶向载体在被导入细胞中突变细胞内源基因组DNA序列之前被线性化，因为线性化载体可较环状载体表现明显更高的靶向频率(Thomas等人，(1986)，Cell，44，49)。但是，可能不需要线性化就可使用AMFP基因靶向载体达到这些目的。
为了靶向不同的等位基因，可能需要利用不同的荧光蛋白可选择标记。通过控制荧光蛋白可选择标记不同等位基因的鉴定，可以或同时或分别成功的靶向不同的等位基因。
成功进行位点特异性同源重组所需要的AMFP基因靶向载体的长度是重要的参数，经常依赖于建立突变DNA序列所要靶向的特异基因。载体的长度也依赖于几种因素。编码荧光蛋白可选择标记的DNA序列的选择将影响总的载体长度，因为序列组成是根据不同的标记物而变化的。另外，在置换型载体中，第一条和第三条DNA序列的长度是重要的参数，为了进行成功的基因靶向必须被正确确定，两条序列与细胞内源基因组靶DNA序列实质上是同源的。一般来说，一个同源区可小至25bp(Ayares等人，(1986)，Genetics，83，5199)，尽管推荐使用明显更大的区域。直至一个特定的长度，在AMFP基因靶向载体同源性数量的增加可增加靶向的效率(Zhang等人，(1994)，Mol.Cell Biol.，14，2404)。在大多数情况下，整个载体的长度最小为1kb，通常最大不超过500kb，尽管载体长度也可依赖于用来构建载体的技术。例如，可能用粘粒，细菌人工染色体(BAC)，或酵母人工染色体(YAC)构建AMFP基因靶向载体，作为两个实质上的同源区的供给者，因此产生了一个明显很大的载体(Ananvoranich等人，(1997)，BioTechniques，23，812；Cocchia等人.，(2000)，Nucleic Acids Res.，28，E81)。载体的长度也包括质粒主链序列，如编码复制起始点的序列，以及细菌药物抗性产物如氨苄青霉素，如果它们在用载体转化细胞前没有被移除的话。
与细胞内源基因组DNA序列实质上同源的，并接受位点特异性同源重组以在细胞靶标中建立突变DNA序列的AMFP基因靶向载体DNA序列优选与细胞的对应部分具有明显高的同源性。在位点特异性性同源重组的遗传交叉和链交换过程中，高同源性可进行有效的碱基配对。在AMFP基因靶向和细胞DNA序列之间的碱基配对不匹配都可影响重组反应。例如，优选在AMFP基因靶向置换载体中的第一条和第三条DNA序列与细胞内源基因组DNA序列是100％同源的，次优选的是80％的同源，更次优选的是50％的同源。编码荧光蛋白可选择标记的第二条DNA序列一般对细胞内源基因组DNA序列是非同源的，因此含有这些序列就不能接受位点特异性性同源重组。
来自在特定的情况下，在发生在AMFP基因靶向载体和细胞内源基因组靶DNA序列之间的位点特异性同源重组过程中，去除已经掺入至细胞基因组中的编码荧光蛋白可选择标记的DNA序列是有益的。这是由于荧光蛋白可选择标记的表达可潜在的负面影响细胞或生物体的活力和生存。去除编码荧光蛋白可选择标记的序列可能通过许多方法。Cre-Lox技术可成功地用于经AMFP基因靶向载体和技术去除已导入细胞内源基因组DNA中的特异序列(Cre-Lox的综述见Ryding等人，(2001)，J.Endocrinol.，171，1)。例如，编码荧光蛋白可选择标记的在细胞转化前可侧向位于AMFP基因靶向载体的Lox P重组位点。将这些序列导入宿主细胞基因组中后，Cre重组酶的暂时或稳定表达将可以去除一个Lox P位点和所有定位在Lox P位点之间的所有序列。存在许多去除序列的Cre-Lox技术的应用实例。Kaartinen等人已经证明经腺病毒感染16细胞期桑椹胚通过暂时表达Cre可去除侧向lox P位点的新霉素磷酸转移酶基因盒(Kaartinen等人，(2001)，Genesis，31，126)。Xu等人通过在Ella启动子控制下与表达Cre小鼠的杂交以及对含有Cre表达质粒的基因盒的细胞进行前核注射，可成功地去除侧向于新霉素磷酸转移酶基因盒的lox P(Xu等人(2001)，Genesis，30，1)。因此，如果AMFP基因靶向载体被配置以置换或纠正缺陷的细胞外显序列，如为了进行人体基因治疗，荧光蛋白可选择标记的可在完成AMFP基因靶向载体和宿主DNA之间的位点特异性同源重组后被去除。在此公开的AMFP基因靶向载体和方法可用于在植物中突变DNA序列。实际上，存在有植物谱系中的几个同源重组的实例(Siebert等人，(2002)，PlantCell，14，1121，综述见Schaefer，(2002)，Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol Biol.，53，477)。另外，所述的同源重组已经使用正-负选择技术被用来靶向几种植物位点，包括乙醇脱氢酶和原卟啉原氧化酶(PPO)位点(Xiaohui等人，(2001)，Gene，272，249；Hanin等人，(2001)，Plant J.，28，671)。假定有许多荧光蛋白标记物，它们可用来实施AMFP基因靶向方法，以经位点特异性性同源重组产生突变的DNA序列(表1)。在使用AMFP基因靶向载体和方法建立的植物中的突变通过导入外源调控元件，可在内源位点表达水平上包括丧失功能，获得功能或修饰。丧失功能或获得功能的突变可通过去除特异的内源DNA序列或改变序列而产生，所述的序列改变可改变特异植物基因编码的氨基酸组成。另外，“敲入”(knock-in)实验可在植物中实施，通过使用AMFP基因靶向载体和方法将外源基因或编码区导入到一个内源位点中。
AMFP基因靶向载体导入植物细胞中，可通过许多方法实现，包括以前在将外源DNA插入原生质体中时所建立的方法(Hain等人，(1985)，Mol.Gen.Genet.，199，161；Negrutiu等人，(1987)，Plant Mol.Biol.，8，363；Paszkowski等人，(1984)，EMBO J.，3，2717)。微注射也可成功地将AMFP基因靶向载体导入植物细胞中(De la Pena等人，(1987)，Nature，325，274；Crossway等人(1986)，Mol.Gen.Genet.，202，179)。另外，可能经脂质体介导的转染将AMFP基因靶向载体导入植物细胞中(Deshayes等人，(1985)，EMBO J.，4，2731)。在成功地将AMFP基因靶向载体导入植物细胞的过程中，位点特异性性同源重组可根据AMFP基因靶向载体的构建和组成形式突变细胞内源基因组DNA序列。
在本发明中所述的细胞分离策略包括通过使用FACStar PlusTM细胞分选仪来进行细胞分�。约叭斯し掷爰际酰痉⒚鞑幌抻谡庵忠瞧骰蚱渌掷爰际�(图1)。其他的细胞分选仪器也可用来有效的分离表达一种可选择标记对另一种可选择标记或没有可选择标记的表达的细胞。这些包括但不限于FACS Vantage SE I，和FACS Vantage SE 11或能够基于本发明中所描述的方法进行分选细胞的任何仪器。
AMFP基因靶向载体用于AMFP基因靶向法，用来筛选含有正选择标记物的转化靶细胞。这样的ATG-负荧光蛋白基因靶向步骤实质上可富集那些已发生同源重组的转化靶细胞。如在此所使用的，“实质上的富集作用”是指相比于同源转化体与非同源转化体中的比例，至少富集两倍的转化靶细胞，优选10倍的富集，更优选的1000倍的富集，最优选的10,000倍富集，也就是转化靶细胞与转化细胞的比例。在一些情况下，同源重组与随机整合相比的频率是大约1000中出现1次，在某些情况下，低于10,000个转化细胞中出现1次。通过AMFP基因靶向载体和本发明的方法获得的实质上的富集作用经�？刹恍┫赴海渲写笤�1％，更优选大约20％，最优选大约95％的收获细胞群含有转化的靶细胞，其中在转化的靶细胞中AMFP基因靶向载体已经被同源整合。这种实质上富集的转化靶细胞群然后被用于随后的基因操作，细胞培养实验或产生转基因生物体，如转基因动物或植物。
下面理论上的实施例作为实施例而被展示，并不能解释为对本发明范围的一种限制。
实施例实施例1采用FPIC基因靶向载体在胚胎干细胞中灭活ptch2位点1.ptch2靶向载体的构建ptch2是一个跨膜功能区受体，据推测在胚胎发育和出生后的过程中参与刺猬的信号转导的调控(Motoyama等人，(1998)，Nat.Genet.，18，104；Carpenter等人，PNAS，95，13630，每一篇在此都合并作为参考文献)。ptch2靶向载体可从λ噬菌体小鼠基因组DNA文库中，采用噬菌体克隆而构建，所述的噬菌体含有横跨外显子5至11的基因组序列，这个区域包含ptch2受体的跨膜区2至8(图5)。简言之，1.7kb的同源区3’区域可从ptch2噬菌体克隆中分离的基因组DNA通过PCR扩增，并侧向于Kpn1和Not1位点。然后该片段可被亚克隆进pPOLYLINKER质粒，该质粒此后称为pPolylinkerl.7。同源区的5’区域含有外显子5，6以及外显子7的大多数5’区域可用限制性酶BamH1和Nco1从基因组克隆中去除，用Klenow片段DNA聚合酶填平，并将平端亚克隆进pPolylinkerl.7的Hpa1位点。编码缺乏编码初始蛋氨酸序列的绿荧光蛋白(GFP)的DNA片段被插入同源区5’和3’区域之间，以取代跨膜功能区2、3和4的编码区，从而使受体灭活，并产生被称为P2的质粒。
2.用ptch2靶向载体转化胚胎干细胞存在于靶向载体的3’末端和同源区3’端下游的Not1位点可用来在胚胎干细胞(ES)进行细胞转化前进行线性化。100μg AMFP基因靶向载体被线性化，苯酚/氯仿提�。掖汲恋恚⒃谂咛ジ上赴爸匦谖蘧袅笏校ǘ任�1μg/μl。干细胞在明胶包被的10cm培养板，于M15培养基中在37℃，5％CO2增殖至大约50％融合，所述的培养基在Dulbecco′s最小限制性培养基(DMEM)中含有15％FCS，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，10-4M β-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，50μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素，1000U/ml LIF。细胞在无介质DMEM中冲洗，并以每个10cm培养板的胚胎干细胞，用8μg线性化载体采用Lipofectamine试剂通过脂质转染技术根据生产厂商的说明书(Invitrogen Inc.)引入细胞。在转染后24至48小时，细胞或者被收获在FACStar Plus细胞分选仪中分离。细胞的收获包括在无菌蒸馏磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冲洗两次，然后用1ml 0.05％胰蛋白酶/EDTA，在每个10cm培养板中胰蛋白酶消化15分钟。去除剩余的胰蛋白酶，细胞重新悬浮在细胞分选缓冲液中，缓冲液PBS中含有1mM EDTA，25mMHEPES，pH7.0和1％透析的FCS，细胞密度为10×106细胞/毫升。在分选之前细胞在5％CO2中保持在冰上。
3.ptch2靶向ES细胞和非ptch2靶向ES细胞的分离用AMFP基因靶向载体转染的ES细胞可以选择10-12天、可以如上所述被收获，在FACStar加细胞分类器中大体分类，以从不能表达它的那些细胞中选择表达GFP的细胞(图4)。被分类的含有GFP的细胞群再放入10*106细胞/10cm板密度和为了DNA和基因型的随后的分离繁殖到80％融合(图4)。
4.通过位点特异性性同源重组对ptch2突变进行基因型确认基因组DNA可从分选的胚胎干细胞群和/或未分选的阴性对照细胞中通过下面的方法分离。细胞在10cm培养板中生长至大约80％融合，在培养板中直接加入1ml含有100mM氯化钠，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA和0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)的裂解缓冲液。细胞在室温下孵育15分钟，转移至1.5ml Eppendorf管中，并在55℃轻轻振摇孵育过夜。裂解物用等容积的1∶1苯酚/氯仿提取两次，用氯仿提取一次。用等容积的异丙醇沉淀基因组DNA。在15000×g离心后，基因组DNA沉淀物重悬浮在300μl无菌蒸馏水中。
每个样品中的基因组DNA可以通过PCR进行基因定型，采用对GFP编码区序列特异的寡核苷酸引物和对正在同源区3’端下游的序列特异的寡核苷酸引物(图5)。20pmole每种寡核苷酸与100ng基因组DNA在终浓度为200μM的每种dNTP，2.5mM MgCl2，IX PCR缓冲液和1U Taq DNA聚合酶(Invitrogen Inc.)存在下混合在一起。通过使用下列的循环参数进行扩增94.0℃ 2分钟，然后进行35个循环的96℃ 30秒，58℃ 30秒和72℃ 2.5分钟。反应产物和1kb的梯度分子量标准品一起在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶用溴化乙锭染色以进行PCR产物的紫外线检测。利用来自被分类在成功的位点-介导的同源重组上含有GFP的样本群的DNA检测到1.7kb PCR产物。
位点特异性实施例2通过采用AMFP载体和方法体灭活胚胎干细胞中的paraxis位点1.paraxis靶向载体的构建paraxis是一个碱性的螺旋-转角-螺旋转录因子，涉及控制哺乳动物胚胎发育过程中的体节形成(Burgess等人，(1995)，168，296；Burgess等人，(1996)，Nature，384，570；Barnes等人，(1997)，Devel.Biol.，189，95)。paraxis靶向载体的构建以前已经有所描述(Burgess等人，见前，1996)。paraxis基因组组成形式包括被一个5kb内含子分隔的两个外显子。第一个外显子含有起始蛋氨酸密码子和可进行DNA结合和二聚化的碱性螺旋-转角-螺旋(bHLH)功能区。缺乏编码初始蛋氨酸序列的绿荧光蛋白(GFP)可以被用来置换多数的外显子1以及内含子1的5‘区域(图6)。
2.用paraxis靶向载体转化胚胎干细胞胚胎干细胞生长至大约50％融合，用4μg线性化的AMFP靶向载体转染。如上所述根据生产厂商的说明书(Invitrogen Corp.)经脂质转染法完成转染。转染后10-12天细胞可以收获，在FACStar加细胞分类器中大体分类以从表达它的细胞中区别不表达GFP的细胞。分类的表达GFP的细胞群，再放入密度为10*106细胞/10cm板和繁殖到80％融合以分离DNA和基因型(图4)。
3.通过位点特异性性同源重组对paraxis突变进行基因型确认基因组DNA从分选的胚胎干细胞群或未分选的阴性对照细胞被分离。这些样品中的基因组DNA，通过PCR使用寡核苷酸引物进行基因定型，所述的引物对GFP的3‘区域和正在同源区3’端下游和外部的序列特异的寡核苷酸是特异的(图6)。反应体积和条件如上所述，除此之外，引物退火温度为55℃。反应产物与1kb梯度分子量标准品一起在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶用溴化乙锭染色以进行PCR产物的紫外线检测。使用来自样品细胞群的DNA检测到的被分选包含GFP表达的1.5kb PCR产物显示有位点特异性性同源重组和成功的基因靶向作用。
在描述完本发明优选的实施方案后，对本领域技术人员来说显而易见的是关于公开的实施方案可以有多种修改，而这些修改的本意都位于本发明的范围之内。虽然本发明已经参考上述实施例进行了描述，可以理解的是，多种修饰和变化都囊括在本发明的精神和范围之内。因此，本发明只受下列权利要求的限制。
权利要求
1.一种鉴定转化细胞的方法，该转化细胞经过利用AMFP载体进行了位点特异性同源重组，所述的方法包含a)设计用AMFP载体转化的细胞以进行位点特异的同源/重组，其中所述的载体包括实质上与宿主基因组的内源基因组序列同源的第一DNA序列；第二DNA序列，该序列编码在所述细胞中编码特征性缺乏调节因子和编码初始蛋氨酸的序列的荧光蛋白选择，并且与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能进行位点特异性同源重组。实质上与宿主基因组的内源基因组序列同源，并且与第一DNA序列不同的第三DNA序列；b)通过选择存在所述第二DNA序列的功能性荧光蛋白可选择标记的基因产物，繁殖细胞以选择或富集那些用所述AMFP载体转化的细胞。c)从没有所述第二DNA序列的细胞中分离具有所述编码功能性荧光蛋白可选择标记的第二DNA序列的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括d)所述的细胞的基因组DNA的特征在于携带编码功能性荧光蛋白可选择标记的第二DNA序列用于位点特异性同源重组事件，以允许细胞靶DNA的修饰。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述AMFP载体包括可以通过荧光发射被被检测的可选择标记。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光蛋白可选择标记使得含编码一种标记的DNA的细胞与含编码另一种或两种标记的DNA的细胞分离。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞能同源重组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞来自多细胞生物体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞来自植物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为了内源性细胞基因组的多修饰的目的进行了多轮位点特异性同源重组。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞可用于产生多细胞有机体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是胚胎干细胞。
11.一种用于在能进行同源重组的细胞中位点特异性同源重组的分离的AMFP基因靶向载体，该载体包含与细胞内源性基因组序列实质上同源并能在所述细胞进行同源重组的第一DNA序列，第二DNA序列，其与细胞内源性基因组序列不同源，不能在所述细胞进行同源重组，不含调节因子，编码缺乏编码初始蛋氨酸的序列的荧光蛋白可选择标记，能鉴别含所述正可选择标记的细胞，实质上与细胞内源性基因组序列同源并能在所述细胞进行同源重组的第三DNA序列，其中在5’至3’方向的所述AMFP基因靶向载体的构成包括与细胞内源性基因组DNA序列实质上同源的第一DNA序列，不含调节因子，编码缺乏编码初始蛋氨酸序列的荧光蛋白可选择标记的第二DNA序列，实质上与细胞内源性基因组序列同源的第三DNA序列，其中所述的载体能进行位点特异性同源重组导致细胞内源性靶基因组DNA序列的修饰。
12.根据权利要求11所述的AMFP基因靶向载体，其中所述细胞内源性基因组靶向DNA包含外显子和内含子。
13.根据权利要求11所述的AMFP基因靶向载体，其中所述载体包含实质上与细胞靶基因组DNA序列同源的所有或部分外显子和内含子。
14.根据权利要求11所述的AMFP基因靶向载体，其中所述载体包含实质上与细胞靶基因组DNA序列同源的调节因子部分。
15.根据权利要求11所述的AMFP基因靶向载体，其中所述载体包含序列的改变，该序列实质上与含有缺失、替代、添加或点突变的细胞靶基因组DNA序列同源。
16.根据权利要求11所述的AMFP基因靶向载体，其中由所述第二DNA序列编码的所述荧光蛋白可选择标记选自编码荧光蛋白的DNA序列，包括GFP，CFP，YFP，RFP，dsRED或HcRED。
17.根据权利要求11所述的AMFP基因靶向载体，其中所述载体与所述第一和第三DNA序列同源的长度在大约50bp和50,000碱基对之间。
18.根据权利要求11所述的AMFP基因靶向载体，其中所述载体导致细胞内源性基因组靶DNA序列的修饰。
19.根据权利要求11所述的AMFP基因靶向载体，其中所述载体把外源性调节因子导入细胞内源基因组靶DNA序列。
20.通过按照根据权利要求1所述的方法生成的细胞富集群，其中所述细胞进行了位点特异性同源重组。
21.根据权利要求1所述的方法生成的非人类转基因动物，其中所述动物生成于经过位点特异性同源重组的细胞。
22.根据权利要求1所述的方法生成的转基因植物，其中所述植物生成于经过位点特异性同源重组的细胞。
全文摘要
本发明提供了用于真核细胞特别基因组位点的特异性改变的方法和载体。一种方法包含利用负－ATG(ATG－minus)荧光标记蛋白质基因靶向(AMFP)DNA载体，目的是为了产生和鉴别经过位点特异性同源重组把载体序列整合进宿主细胞基因组的细胞。该方法也包含利用编码体内可发现标记的序列，鉴别经过位点特异性同源重组或是非同源重组或是插入而把外源载体序列整合进了宿主细胞的基因组的细胞。本发明也包括在真核细胞内产生修饰的载体。另外，本发明包括通过实施和使用提供的方法和载体，从具备特异性遗传改变的细胞生成的细胞和有机体。
文档编号G01N33/58GK1533436SQ03800140
公开日2004年9月29日 申请日期2003年1月14日 优先权日2002年1月14日
发明者R·M·小伯吉斯, P·A·施奈德, R M 小伯吉斯, 施奈德 申请人:基因组生物科学有限公司
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