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专利名称：8-氧代脱氧鸟苷的检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，尤其是涉及一种8-氧代脱氧鸟苷的 检测方法。
背景技术：
机体在细胞中的线粒体、微粒体、质膜和胞质中的酶系统和非酶系统在代谢过程中，可以产生活性氧自由基。同时机体在受到外源化学物质和电离辐射等条件下也可能产生活性氧自由基。所述活性氧自由基可以与DNA的碱基形成加合物如脱氧鸟苷，所述脱氧鸟苷加合物在羟化酶的作用下，形成羟基脱氧核苷，其中8-氧代脱氧鸟苷(8-oxo-dG)是羟基脱氧核苷羟中的主要一种，全名为8-羟基-2、-脱氧鸟苷(8-oxo-dG)，其化学结构如图1 所示。8-oxo-dG可直接引起基因突变和癌基因表达。如Kuchino等报道8_羟基脱氧鸟嘌呤具有同任何碱基配对的能力。脱氧鸟嘌呤的C8被羟基化后，脱氧鸟嘌呤同胞嘧啶特异性配对的能力丧失，导致DNA复制时碱基的错配，从而出现多种基因突变的形式。Wood等曾证实在大肠杆菌中，8-氧代脱氧鸟苷具有诱导G — T置换的能力。Cheng等也报道8_氧代脱氧鸟苷可以引起G —T和A —C置换。8-氧代脱氧鸟苷可以引起突变，ras基因激活的主要原因为点突变。Kamiya等M证实用人工合成的第12位密码子碱基G置换的原癌基因 c-Ha-ras转染NTS3T3细胞，可使部分细胞发生恶性转化。在已知的大约20种DNA的加合物中，8-oxo-dG易于检出，且8-oxo-dG与基因突变明显相关，8-oxo-dG已成为研究最多的 DNA碱基氧化损伤修复产物，成为研究DNA损伤修复最常用的生物学标志物(Biomarker)。8-oxo-dG作为内源性或外源性因素对DNA氧化损伤作用的生物标志物，是一种极有前景的生物标志，通过8-oxo-dG的检测可以评估体内氧化损伤和修复的程度。氧化应激与DNA损伤的相互关系，对研究退行性疾病、衰老机制、癌发生机制、环境毒物与氧化应激的关系等具有重要意义，也可以用来评价抗氧化剂治疗DNA氧化损伤的效果。目前8-oxo-dG的检测方法主要有32P后标记法、免疫荧光组织化学检测法、酶联免疫吸附 (ELISA)法、高效液相色谱-电化学法、气质联用分析法和高效毛细管电泳等。32P后标记法，32P后标记技术是20世纪90年代后发展起来的，具有灵敏度高、样品用量少、应用范围广等优点。其操作过程包括DNA的消化、标记、层析分离、放射自显影。 但该方法的特异性有待提高，且容易造成放射性污染。酶联免疫吸附(ELISA)法，应用单克隆抗体的ELISA法具有很高的灵敏度和很好的重复性。抗8-oxo-dG多克隆抗体的发展和单克隆抗体的使用为免疫亲和柱的发展提供了条件，可以用于分析生物样品，尤其是尿中DNA和RNA的氧化损伤产物。该方法法不用对 DNA进行分解处理，不需使用昂贵的仪器，测定时间短，样本预处理程序简单，是一种很有应用价值的方法。高效液相色谱-电化学检测器分析(HPLC-EOT)法，是将DNA的酶水解样品通过 HPLC分离后，使用E⑶进行测定。该方法是Floyd等提出的一种定量测定8-0X0-dG的有效方法。HPLC-ECD在检测8-oxo-dG中得到广泛应用，具有较高的灵敏度，其最低检测限大约为1/50核苷，所需样品量少，对机体不会产生损伤性、且选择性好，对组织细胞DNA及尿中 8-oxo-dG均可检测，是目前应用广泛、较为成熟的方法。气质联用分析法(GC-MQ，是一种将气相色谱仪与质谱仪联合使用检测方法，可为 DNA损伤中的氧化产物的鉴定提供可靠而明确的数据，其检测下限为1/50核苷。然而由于质谱仪价格昂贵，无法广泛应用于实验室的检测。同时DNA碱基必须首先进行衍生化反应， 这一过程容易导致副产物的形成，从而容易产生假阳性的显示结果。高效毛细管电泳(HPCE)是利用8-oxo-dG与其他脱氧鸟苷在电场中泳动方向和速率的不同而进行分离，应用保留时间而进行定性，通过外标法来进行定量。其优点是进样量小、分离效率高、保留时间短，比HPLC分离更为迅速，使用紫外检测器灵敏度较低，应用电化学检测器则大大提高灵敏度。上述的多种检测方法中，都存在某些缺陷，如利用效液相色谱-电化学法检测的过程中，存在酶解不完全、生存副产物、放射性污染、检测周期长，且检测成本高，只能局限于很小范围的临床应用。ELISA免疫学方法相比HPLC法存在交叉反应使测定结果偏高。从现有的上述检测方法可知，将8-0X0-dG与其他干扰物质分离，检测仪器对 8-oxo-dG的特异性响应的灵敏度还有待提高。

发明内容
本发明的主要目的在于提供一种8-氧代脱氧鸟苷的检测方法，避免免疫检测的非特异性交叉，简化检测步骤。本发明提出一种8-氧代脱氧鸟苷的检测方法，包括步骤将含8-oxo-dG的待测物加入到固相载体中；向固相载体中加入抗8-oxo-dG抗体，使8-oxo-dG与抗8-oxo-dG抗体反应形成特异性结合物；向固相载体中加入抗鼠IgG-HRP多聚物，使抗鼠IgG-HRP多聚物与所述特异性结合物反应形成8-oxo-dG、抗8-oxo-dG抗体和抗鼠IgG-HRP多聚物的三元复合物；向固相载体中加入ECL化学发光底物，所述ECL化学发光底物在所述三元复合物的作用下发光；检测ECL化学发光底物的发光强度，根据发光强度计算待测物中8-oxo-dG的含量。优选地，所述8-氧代脱氧鸟苷的检测方法，所述固相载体为DE81膜。本发明提供的8-氧代脱氧鸟苷的检测方法，相对现有检测方法，其回收率高、检测限低、交叉反应低、操作简单，检测时间短(不超过3. 5小时)、无需对样本进行复杂的前期处理，以及无需采用贵重仪器，检测成本低。


图1是8-羟基-2、-脱氧鸟苷的化学结构图；图2是本发明的8-oxo-dG含量检测原理示意图；图3是本发明根据标准样本浓度及其对应的灰度值，拟合而成的标准曲线图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行进一步的说明。参见图2，本发明检测8-oxo-dG的原理如下将8-oxo-dG与抗8-0X0_dG抗体反应形成特异性结合物；向特异性结合物加入抗鼠-HR多聚物，使抗鼠-HR多聚物与所述特异性结合物反应形成8-oxo-dG、抗8-oxo-dG抗体和抗鼠-HR多聚物的三元复合物；然后向三元复合物中加入ECL化学发光底物，所述ECL化学发光底物在所述三元复合物的作用下发光；然后检测ECL化学发光底物的发光强度，根据发光强度计算待测物中8-oxo-dG的含量。实施例1 :8-oxo-dG含量的检测

本发明采用上述检测方法检测待测物中8-oxo-dG的含量，根据标准品测量结果做出的标准曲线计算出待测物中8-oxo-dG的含量。制作标准曲线需用到8-oxo-dG标准样本浓度包括20ng/ml、10ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml 共 6 个不同浓度的标准液。该6各不同浓度的标准样本是通过PBS缓冲液(磷酸二氢钠0. 01M/L,NaCl 0. 15M/L， PH 7. 4)对8-oxo-dG标准品稀释成的。制作标准曲线、检测待测物中8-oxo-dG含量，以及分析特异性的具体过程如下Si、将内含DE81膜的模板平放在干净滤纸上，将浓度为0ng/ml、0. 5ng/mlUng/ ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml 的标准液依次点样 DE81 膜中编号为 Al、A2、A3、A4、 八54647孔内，每孔点样3111。将浓度为15ng/ml的待检样本点样到DE81膜中编号为A8、 A9孔内，每个孔点样3μ1 ；浓度为1.5ng/ml的待检样本点样到AlO和All孔内，每个孔点样 3 μ 1。将浓度为lOng/ml的dG干扰样本点样到编号为A12和A13孔内，每个孔点样3 μ 1。 将PBS缓冲液点样到编号为Α14至Α23孔内，每个孔内点样3μ 1。将4ng/ml的标准样本点样的编号为A24孔内，点样3μ1。S2、将所述模板置于室温下30 60分钟使DE81膜干透至自然翘起。S3、打开模板将DE81膜放入反应盒内，用去离子水振摇洗膜2次，每次1分钟，倒掉洗涤后的去离子水，然后加入封闭液(1%BSA，用PBS稀释，BSA要求使用片段5，纯度 95%以上)，将反应盒置于37°C的恒温箱内振摇封闭20分钟。S4、倒掉封闭液，加入通过PBS稀释的抗8-oxo-dG抗体，并将反应盒置于37°C的恒温箱内振摇孵育60分钟。S5、倒掉多余的抗8-oxo-dG抗体液，并用洗涤液(PBS，0. 1 % Tween-20)振摇洗涤 3次，每次洗涤5分钟。S6、加入通过PBS稀释的抗鼠IgG-HRP聚合物，并将反应盒置于37°C的恒温箱内振摇孵育10分钟。S7、用洗涤液(PBS，0. 1 % Tween-20)振摇洗涤3次，每次洗涤5分钟。加入ECL底物液液，反应盒中的DE81膜过膜浸湿，开始计时，精确反应1分钟后，用吸水纸将DE81膜吸干，然后将DE81膜放入压膜透明胶片内，挤干剩余的溶液。S8、6分钟后将DE81膜放入化学发光数字成像分析仪内拍摄并分析，得到相应的
灰度值。编号为Al至A24孔内对应样品的灰度值。ECL试剂从反应开始6分钟后达到峰值，此时拍摄获取的灰度值比较准确。
其中，7个不同浓度的标准样本对应的灰度值如下表1。表 权利要求
1.一种8-氧代脱氧鸟苷的检测方法，包括步骤 将含8-oxo-dG的待测物加入到固相载体中；向固相载体中加入抗8-oxo-dG抗体，使8-oxo-dG与抗8-oxo-dG抗体反应形成特异性结合物；向固相载体中加入抗鼠IgG-HRP多聚物，使抗鼠IgG-HRP多聚物与所述特异性结合物反应形成8-oxo-dG、抗8-oxo-dG抗体和抗鼠IgG-HRP多聚物的三元复合物；向固相载体中加入ECL化学发光底物，所述ECL化学发光底物在所述三元复合物的作用下发光；检测ECL化学发光底物的发光强度，根据发光强度计算待测物中8-oxo-dG的含量。
2.根据权利要求1所述的8-氧代脱氧鸟苷的检测方法，其特征在于，所述固相载体为 DE81 膜。
全文摘要
本发明公开了8-氧代脱氧鸟苷的检测方法，包括将含8-oxo-dG待测物加入到固相载体；加入抗8-oxo-dG抗体，使8-oxo-dG与抗8-oxo-dG抗体反应形成特异性结合物；加入抗鼠IgG-HRP多聚物，使抗鼠IgG-HRP多聚物与特异性结合物反应形成8-oxo-dG、抗8-oxo-dG抗体和抗鼠IgG-HRP多聚物的三元复合物；加入ECL化学发光底物，ECL化学发光底物在三元复合物作用下发光；检测ECL化学发光底物的发光强度，根据发光强度计算待测物中8-oxo-dG的含量。本发明的方法，回收率高、检测限低、交叉反应低、操作简单，检测时间短、无需复杂的前期处理和采用贵重仪器，检测成本低。
文档编号G01N33/53GK102169118SQ201110095478
公开日2011年8月31日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者周际, 施艾马克.华科奥斯特, 李 远 申请人:华瑞同康生物技术(深圳)有限公司