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专利名称：三聚氰胺快速检测试剂的制作方法
三聚氰胺快速检测试剂技术领域三聚氰胺快速检测试剂，应用免疫学原理，通过胶体金的免疫反应再借助 免疫层析技术达到检测三聚氰胺目的，应用于快速检测鲜乳、乳制品、大豆制 品、饲料、婴儿食品、宠物食品中的三聚氰胺。
技术背景由于三聚氰胺是一种化工原料，毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3 克/公斤体重。据1945年的一个实验报道将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔 和狗后没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿 系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安 全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三巻和国际化学 品安全卡片也只说明长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响， 导致产生结石。然而，2007年美国宠物食品污染事件的初步调查结果认为掺 杂了《6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉导致宠物食品中毒。动物实验结果表明，其 在动物体内代谢很快且不会存留，主要影响泌尿系统。三聚氰胺量剂和临床疾 病之间存在明显的量效关系。三聚氰胺在婴儿体内最大耐受量为每公斤奶粉15 毫克。专家对受污染婴幼儿配方奶粉进行的风险评估显示，以体重7公斤的婴 儿为例，假设每日摄入奶粉150克，其安全预值即最大耐受量为15毫克/公斤奶 粉。根据美国食物及药物管理局的标准，三聚氰胺每日可容忍摄入量为每日0.63 毫克/公斤体重。由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人 用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被人 称为"蛋白精"。蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16%左右，而 三聚氰胺的含氮量为66%左右。通用的蛋白质测试方法"凯氏定氮法"是通过 测出含氮量来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试 含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。有人估算在植物蛋白粉 和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白 原料的20%。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，所以掺 杂后不易被发现。三聚氰胺含氮量为66.6%，是牛奶的151倍，是奶粉的23倍。 每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质。检测方案 在现有奶粉检测的国家标准中，主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰 胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，所以现有标准不会包含相应内容。 亦即三聚氰胺检测目前并无国家标准。牛奶和奶粉添加三聚氰胺，主要是因为 它能冒充蛋白质。食品都是要按规定检测蛋白质含量的。要是蛋白质不够多， 说明牛奶兑水兑得太多，说明奶粉中有太多别的东西的粉。但是，蛋白质太不 容易检测，生化学家们就想出个间接的办法因为蛋白质是含氮的，所以只要 测出食品中的含氮量，就可以推算出其中的蛋白质含量。因此添加过三聚氰胺的奶粉就很难检测出其蛋白质不合格了这就是三聚氰胺的假蛋白。目前检测三聚氰胺的方法主要有3种，高效液相色谱(HPLC)、气相色谱质 谱联用法(GC-MS)和酶联免疫分析(ELISA)。存在的主要问题是设备投入大， 操作时间长，专业要求高，不适合现场快速检测的要求，不适合大批量样品检 测的要求。 发明内容三聚氰胺快速检测试剂，应用免疫学原理，通过胶体金的免疫反应再借助免 疫层析技术达到检测三聚氰胺目的，具有检测过程快速，操作方便，检测成本 低等明显优点。本发明方法是通过以下技术方案和工作原理实现的。特异性抗体(三聚氰胺 抗体)标记在指示剂颗粒上，标记物附着在聚酯膜上；将相应完全抗原(三聚 氰胺-BSA结合物)包被并固定层析膜的检测区(T)上，层析膜粘贴在底板上， 始端有供加样用的样品处理部分，末端有供助层析用的滤纸组成试条，或将试 条镶嵌入塑卡中，组成试剂。检测时，由于被测样本中相应抗原(三聚氰胺)和复 溶的金标记抗体发生了免疫反应，此时混合液层析到检测区上时包被抗原无法 竞争到标记抗体，检测区内没有出现反应线，即阳性，相反如被测样本没有被 测抗原(三聚氰胺)，则标记的抗体层析到检测区时和包被膜上的抗原结合形成 紫红线，即阴性。为了证明试剂有效性和易判读，分别在质控区(C)包被羊抗 兔IgG为质控线，所以不管结果怎样质控线C始终出现。三聚氰胺快速检测试剂，由下列部分组成层析膜、含指示剂颗粒的聚酯膜、 样品处理部分、滤纸和底板，检测鲜乳、乳制品、大豆制品、饲料、婴儿食品、 宠物食品中的三聚氰胺。


附图1是本发明实施例的结构示意图。图中1.硝酸纤维素膜、2.滤纸、3.样品处理部分、4.底板、5.含胶体金颗 粒的聚酯膜、6.试剂外壳。附图2是本发明实施例的阳性结果示意图。附图3是本发明实施例的阴性结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 实施例，三聚氰胺快速检测试剂盒。在图1中，包被有三聚氰胺-BSA结合物的硝酸纤维素膜(1)粘贴在底板 (4)中间，其顶端粘贴有滤纸(2)，其底端粘贴样品处理部分(3)。标记的抗 三聚氰胺的抗体胶体金颗粒附着在聚酯膜上(5)。粘贴有硝酸纤维素膜(1)、 吸水纸(2)和滤样垫玻纤(3)的底板(4)放置在试剂外壳(6)，试剂外壳(6) 盖紧。1.将一定浓度的三聚氰胺-BSA结合物和羊抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜上 的检测线和控制线的位置。2. 将制得的硝酸纤维素膜与样品处理部分、滤纸一起依次粘贴在底板上。3. 将此底板装配在试剂外壳底内，合上试剂外壳盖组装而成。4. 抗三聚氰胺抗体标记胶体金制备用柠檬酸三钠还原四氯化金制备粒径 40 60nm胶体金，调节pH后每毫升胶体金和10-15 ug抗三聚氰胺抗体混合进 行标记并在450nm下测OD。5. 将10-20ul的2-3 OD抗三聚氰胺抗体标记的胶体金加到聚酯膜上并烘 干，聚酯膜上即附着上经标记的胶体金颗粒。6. 检测步骤a. 吸取一定量的牛奶7000rpm离心脱脂，即得待检样品。b. 取出试剂盒，平放在桌面上。c. 用吸管吸取混合均匀的样品，滴加2-3滴于加样孔中，并开始计时。d. 在5分钟内读取结果。e. 结果判定图2为阳性结果(控制线C位置出现红色线条，而检测线T 位置不显示红色线条时，判为阳性)；图3为阴性结果(检测线T位置出现红色 线条，控制线C位置也出现红色线条，判为阴性)。7. 性能指标灵敏度应用本实施例，三聚氰胺浓度在1000ng/ml以上为阳性。根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发 明所要求保护的内容进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对 本发明进行详细描述，但并不是构成对本发明的限制。本领域的熟练技术人员 用相似替代物或改造，或用某些在化学相似的试剂替代在此描述的试剂，如用 彩色乳胶代替胶体金，或对本发明的有关内容进行变动，但不超出本发明的精 神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。
权利要求
1.三聚氰胺快速检测试剂，其特征是，采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析技术，通过抗体竞争结合三聚氰胺-BSA偶联物和样品中可能含有的三聚氰胺的原理，达到快速检测样品中的三聚氰胺。
2. 三聚氰胺快速检测试剂，其特征是，检测试剂由下列部分组成层析膜、含 指示剂颗粒的聚酯膜、样品处理部分、滤纸和底板。
3. 根据权利1要求所述的试剂，其特征是，层析膜是硝酸纤维素膜、醋酸纤维 素膜中的一种。
4. 根据权利1要求所述的试剂，其特征是，指示剂颗粒是胶体金颗粒、胶体银 颗粒、荧光颗粒、磁性颗粒中的一种。
5. 根据权利1要求所述的试剂，其特征是，样品处理部分是玻璃纤维、聚酯膜、 玻璃纤维加聚酯膜、玻璃纤维加滤纸、聚酯膜加滤纸、玻璃纤维加聚酯膜加 滤纸中的——禾中。
6. 根据权利1要求所述的试剂，其特征是将羊抗兔和兔抗包被并固定层析膜上。
7. 根据权利1要求所述的试剂，其特征是，含指示剂颗粒的聚酯膜是将抗三聚 氰胺抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜。
8. 根据权利1要求所述的试剂，其特征是样品处理部分用缓冲液处理过用于调 整样品pH值。
9. 根据权利1要求所述的试剂，其特征是，检测的样品是鲜乳、乳制品、大豆 制品、饲料、婴儿食品、宠物食品中的一种。
全文摘要
三聚氰胺快速检测试剂采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析技术，达到快速检测样品中的三聚氰胺之目的。本试剂具有操作简便和快速等优点，应用于养殖、饲养、牧业、食品加工等生产领域现场快速检测食品和饲料中的三聚氰胺，也为家庭食品安检提供了简便手段。
文档编号G01N33/544GK101403756SQ20081020260
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月12日 优先权日2008年11月12日
发明者吉 冯, 杜森垚, 王学生, 琳 顾 申请人:上�？炝樯�物科技有限公司