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专利名称：同时分析多种有机磷的酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时适用于针对残留多种有机磷进行分析的酶联免疫吸附 测定试剂盒，该试剂盒主要适用于快速测定批量的水样、土壤等环境样品和中 毒样品及蔬菜等食品样品中的多种有机磷残留。属于残留农药检测领域。 背景技术：
农药及其代谢物传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)、高效液相 色谱(HPLC)、质谱(MS)等物理化学分析手段，但由于农药使用规模不断扩大， 农药残留造成环境影响和人类健康的慢性和长期效应曰益受到人们关注和担 忧，对农药残留的限制也越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、 指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准，但传统的理化分析方法通常繁 瑣复杂，工作量大，仪器昂贵，并要有熟练的技术人员及较长的分析周期。因 此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及廉价的检测技术能在野外和实验室 内进行大批量的检测应用。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管将免疫分析 用于农药残留分析的时间很短，仍然很快用于环境样品和食品样品中农药残留 的分析。
多数有机磷农药为广谱性高效杀虫剂，在世界范围内广泛应用于粮食、棉 花等经济作物的多种害虫防治，并且对地下害虫、家畜害虫以及卫生害虫也有 很好的防治效果。但是由于很多有机磷农药品种对人畜的毒性相当高，近年来， 因有机磷农药中毒的报道，仍然屡见不鲜。尤其是在作物和蔬菜上的大量使用， 对人体健康造成极大的�：Γ�这已引起人们的关注。因此，开发一种简单快速 适用于多种有机磷农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。
检测有机磷残留量常规方法为高效液相色谱法等，该方法的灵敏度受样品 的净化、浓缩等步骤的影响很大，且该方法需要昂贵的仪器，且过程繁瑣，不 适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为有机磷的残留检测提供了一个新的 分析检测途径。要将免疫分析方法运用到实际中，则需要将其制备成试剂盒。 现有技术公开了多种试剂盒，其中包括了检测多种有机磷残留物的试剂盒及其 制备方法。而现有技术中没有关于方便同时检测多种有机磷的酶联免疫吸附测 定试剂盒技术。
本发明正是针对这一空白，经过发明人长时间的实验和测试，得到了一种 适用于同时针对多种有机磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒。
发明内容要解决的问题本发明的目的是提供一种同时检测多种有机磷残留的酶联免疫吸附测定试 剂盒。
本发明的另一目的是提供一种具有高特异性、高灵敏度，操作方法简单快 速，并能用于大批量样品同时快速检测残留多种有机磷的试剂盒。对残留多种 有机磷如甲基对硫磷、杀螟硫磷、倍硫嫌、乙酰甲胺磷、乐果、马拉硫磷等农
药在蔬菜中的最低检出浓度分别为6.0、 10.0、 13.0 、 12.0、 10.0、 16.0ng/ml。技术方案
本发明涉及一种同时用于多种有机磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂 盒，它基于免疫反应和酶促反应，包括盒体、设在盒体内的酶标板和/或试管和 设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每个孔内含有抗多种有机磷通用 包被抗原，盒内试剂包含抗多种有机磷共同抗体、多种有机磷标准溶液、酶标 记抗多种有机磷共同抗体。盒内试剂还包含洗涤液、底物稀释液、底物溶液和 反应终止液。
在具体的实施方案中，本发明试剂盒包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔 酶标板/试管和设在盒体内的试剂。在所述酶标板的每个孔内，吸附着由包被液 包被能与抗多种有机磷共同抗体特异性结合反应的通用包被抗原，并用5%明胶 进行封闭，盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗多种有机磷共同抗体 (间接ELISA)、多种有机磷标准溶液、酶标多种有机磷共同抗体例如辣根过氧化 物酶标记羊抗兔共同抗体(适用于间接竟争ELISA法)或辣根过氧化物酶标记抗 多种有机磷兔共同抗体(适用于直接竟争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。
其中固相通用包被抗原的制备及盒体内试剂组成如下
将通用包被抗原用pH9.6， 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1 2g碳酸钠和 2-4g碳酸氢钠，双蒸水1L,即包被液)稀释成0.5~4ug/mL，点于96孔/40孔 酶标板上，100ug/孔，并用5%明胶封闭；其中通用包被抗原为例如N-(oc-萘乙 酰基)-6-氨基己酸与卵清蛋白的复合物；
洗涤液(稀释液)一瓶，40-80mL/瓶，组成比例为磷酸二氢钾0.1-0.3g、磷酸 氢二钠2-4g、氯化钾0.1-0.3g、吐温-20 0.5-3mL、双蒸水500ml-1000ml,为正常 使用的15-30倍浓缩液；
底物稀释液一瓶，30-50mL/瓶，配制如下柠檬酸3-6g,磷酸氢二钠l-3g， 双蒸水，为正常使用的5-10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，10-15mL/瓶和邻苯二胺固体粉末4』支，10-20mg/
支；
抗多种有机磷共同抗体(IgG)4瓶，100ml/瓶，工作浓度为1: 500-1000(间接ELISA法)；所述的抗多种有机磷共同抗体(IgG)为通过特殊有机磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔后产生的能与多种有机磷分子、多种有机磷包被原特异性结合的免疫球蛋白(IgG);
辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(直接ELISA法)或者辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)一瓶，200-400uL/瓶，为正常使用时800-1500倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗多种有机磷共同抗体为多种有机磷共同抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；
反应终止液一瓶，30-50ml/瓶，为2mol/L硫酸；
多种有机磷不同浓度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)标准液6瓶，l-4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释10倍。
本发明的同时适用于多种有机磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，能够同时检测水样、土壤、中毒样品、蔬菜等食品中多种有机磷的残留。试剂盒测定原理首先将有机磷农药类似分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为通用包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测农药和抗多种有机磷共同抗体(间接ELISA法)或酶标抗多种有机磷共同抗体(直接ELISA法)。通用包被抗原、待测农药与抗多种有机磷共同抗体(或酶标抗多种有机磷共同抗体)进行竟争反应，待测农药含量多，则被结合在通用包被抗原上的共同抗体少，最终酶促反应显色浅，反之结合在通用包被抗原的共同抗体(或酶标共同抗体)多，最终酶促反应显色深。上述通用包被抗原、待测农药、抗多种有机磷共同抗体或酶标抗多种有机磷共同抗体竟争结合反应后，再加入底物溶液出现显色反应加以测定(间接ELISA法，加底物溶液前不需再加入酶标2抗)。当共同抗体或酶标共同抗体量一定时，样品中的待测农药量越多，与通用包被抗原结合的酶标共同抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高；反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率，再根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，并推算出待测农药的浓度。抗多种有机磷共同抗体的制备
将人工合成的多种有机磷免疫原(即特殊有机磷人工半抗原与牛血清白蛋白结合形成的偶联物)多次注射家兔刺激其体的免疫系统产生能对多种有机磷农药分子或多种有机磷包被原(特殊有机磷人工半抗原与卵清蛋白人工合成的偶联物)特异性识别结合的免疫球蛋白(IgG)。
一、免疫原的选择和制备
1、选择特殊有机磷人工半抗原与载体蛋白结合比在40-50的偶联物作免疫原。2、 弗氏佐剂的制备石蜡油与羊毛脂3: 1混匀湿热高压灭菌得弗氏不完全佐剂。在弗氏不完全佐剂中按规2mg/ml加卡介苗冻干粉混匀得弗氏完全佐剂。
3、 佐剂免疫原的制备将免疫原溶液慢慢解冻，用生理盐水稀释至3mg/ml(以载体蛋白计)按免疫剂量吸入适当容积于注射器中，且免疫原与佐剂以1: 1(V/V)混合，后以用无菌橡胶管相连的两支5ml灭菌玻璃注射器(总体积不超过4ml)交替推动，使佐剂与免疫原溶液充分混合乳化，形成油包水乳液，直至滴入冰水中暂不扩散为止。
二、 免疫方案
选用健康纯白新西兰雄兔(体重约1.5kg左右)作为免疫动物。注射前耳静脉采血制备少时对照血清(l-2ml)，低温贮藏备用。然后将上述已制备好的佐剂免疫原用背部皮内多点注射法注射，以20-25点左右小剂量注射入兔体内，总共注射7次，时间间隔第一次与第二次为4个周，其后每次的时间间隔为2周。四免后7-10天，耳缘静脉釆血制备少量抗血清，以阴性血清作对照，用琼脂双扩散法和间接ELISA法检测血清效价。待琼扩散效价达1: 16以上，以间接ELISA法测定抗血清终点效价达大于10万，中点效价大于2万。颈动脉全采血(无菌)制备抗血清于-20'C冻存。
三、 共同抗体的纯化
1、 硫酸铵盐法(1)50ml烧杯中，X毫升血清+Xml生理盐水，置于电磁搅拌器上。(2)缓慢滴入2X毫升饱和硫酸铵(PH7.0)，使达到50%的饱和度。控制搅拌速度不出气泡。滴加完毕，继续搅拌5分钟。(3)室温放置30分钟。(4)离心3000转/分x 20分钟。(5)弃去上清液，沉淀物溶于2X毫升生理盐水，逐滴加饱和硫酸铵Xml使达33y。饱和度。(6)室温放置30分钟。(7)弃去上清液，将沉淀物溶于2亳升生理盐水，装透析袋，置4。C冰箱0.01MPH7.0PB缓冲液透析，换液数次，每次换液时用纳氏试剂检查NIT;至不出现黄色沉淀为止。
2、 DEAE纤维素柱层析法(l)DEAE预处理(2)装柱、加样和洗脱(3)合并、浓缩、测蛋白。
3、 免疫球蛋白(IgG)浓度的测定将纯化后的共同抗体溶液用生理盐水稀释
适当倍数后测OD28。，按下式计算兔IgG含量
OD280
IgG% = - x稀释倍数
13.5
4、 共同抗体的纯度鉴定快速染色聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为6.5%。酶标共同抗体的制备(采用改良过碘酸钠法)
具体搡作如下称5-10mgHRP溶解于lml蒸馏水中，于上液中加入0.2-0.4mL 新配的0.1mol/LNalO4溶液，室温下避光搅拌15-30分钟。将上述溶液装入透析 袋中，用lmmol/LpH4.4的醋酸盐缓冲液透析，4'C过夜。加20-40uL0.2mol/LpH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入l-2ml含 有10-20mg纯化共同抗体的0.01mol/L碳酸盐缓冲液，室温避光轻轻搅拌2-3 小时。力口 0.14).2mL新配的4mg/mLNaBH4液，混匀，再置4°C2-3小时。将反 应液装入透析袋中，用0.15mol/LpH7.4PBS透析，4'C过夜。在搅拌下逐滴加入 等体积饱和硫酸铵溶液，置4。Cl-2小时。3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀 物用半饱和硫酸铵溶液洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/LpH7.4X:的PBS 中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15mol/LpH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除 铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000-12,000rpm离心30分钟，上清液即为酶结合 物，用等量甘油分装后，分别于-4。C、 -20^保存。经直接ELISA法(E-Ab法)测 定，效价为64000。
多种有机磷通用人工抗原(和通用包被原)合成与鉴定
分别称取芳基硫代磷酸酯人工半抗原、直连硫代磷酸酯人工半抗各50mg溶 于6ml无水DMF,开启搅拌，加入160uL三正丁胺，冰浴下缓慢滴加同2ml无 水DMF溶解的氯甲酸异酯80uL，加毕，4'C搅拌反应1小时，然后于室温反应 1.5小时。
称取BSA、 OVA各100mg,分别溶于8ml0.05mol/L、 pH8.7的硼酸盐缓冲 液，将上述反应液分为二等分，分别用滴管缓慢滴加到不同蛋白质溶液中，每 种蛋白质溶液中加一份，保持反温度15。C左右。加毕，室温搅拌反应12小时。
将反应液置透析袋中，于4。C下对0.01mol/L、 pH7.4PB透析，每6小时换一 次缓冲液，直至透析液中测不出多种有机磷人工半抗原的紫外吸收为止。精确 计量透析袋内偶联物溶液的体积。
将所得偶联物溶液稀释适当倍数，使其OD293约为0.4-0.8。配制多种有机磷 人工半抗原溶液使其浓度为20ug/ml左右。另配制相应载体蛋白溶液使其浓度为 0.5mg/ml。分别对多种有机磷人工半抗原溶液、载体蛋白溶液和偶联物溶液进行 紫外线吸收光谱扫描，扫描波长范围240-320nm,根据扫描图谱定性确定半抗原
是否与载体蛋白发生了偶联。然后根据OD292,分别计算各自的摩尔吸光数S 292。
按下式计算多种有机磷人工半抗原与载体蛋白的结合比。
s292 (偶联物)-s292 (载体蛋白)
结合比二 -
s292 (CBRH)芳基硫代磷酸酯人工半抗原的合成
甲基对硫磷7.6mmol溶于20ml乙醚中，用冷的1 %Na2CO32*10ml洗涤，乙 醚层加入醋酸/盐酸(9/1),三口瓶中搅拌加热，加入4克锌粉，回流反应1小 时。滤去残渣。CCl43*10ml洗涤滤渣，合并。蒸馏水洗涤4*25ml,有机层用 1MNaON调至中性，水层乙醚^25ml提取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，减 压蒸馏除去溶剂得橙红色油状物，得氨基化甲基对硫磷粗品。
氨基化甲基对硫磷粗品中加入蒸馏水，2%盐酸调节PH=1~2,分去不容 物，用正己烷2*20ml洗涤水相。水相用10。/。NaON调至PH-10 11,出现橘 红色油状物，用三氯甲烷2f20ml提取水相，无水硫酸钠干燥，加压蒸馏除去有 机溶剂，得橘红色油状物 1.2克。该橘红色油状物即为芳基硫代磷酸酯人工半 抗原。
H，-NMR 5 (ppm)( TMS、 CDC13): 3.57 ( s，2H，-NH2 )， 3.88 ( s,3H,-CH3 )， 3.85 (s，3H，-CH3 )， 6.65 ~ 7.00 (m，4H，Ar-H )。 直连硫代磷酸酯人工半抗原的合成
6-氨基己酸1.3克(O.Olmol)溶于2.5M的NaOH，于0~ IO'C滴加二甲氧 基硫代磷酰氯2克(0.0075mol )，冰浴冷却，搅拌下滴加2.5M的NaOH4ml。逐 渐升温至5-15X:,搅拌反应4.5小时。加入适量蒸馏水，用2.5M的NaOH调 整PH-2，有白色絮状物生成，用乙醚提取3*301111，合并乙醚，无水硫酸钠千 燥，脱溶得油状物 2.5克。NMR鉴定结构。
H，-画R5(ppm)(TMS、 CDC13): 1.38 (m，2H，-CHr) ,1.55(m,2H,-CH2-)， 1.69(m，2H，-CH2-)，2.38(t，2H，-CH2COO-)，2.95(m，2H,-CH2N-),3.18( s,lH，-NH- )， 3.71 (d,6H，-OCH3 )。 包被酶标板的制备
通用包被抗原用pH9.6,0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含l-2g碳酸钠和2-4g 碳酸氩钠，双蒸水IL)稀释成0.5-4ug/ml,在酶标板的每孔加lOOuL， 4'C下包被 过夜或37'C包被2h,倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加 入150uL5。/。明胶，放入37。C温箱中0.4-1小时后用PBST洗涤3次，拍干后干 燥保存。
检测样品的前处理
水样过滤后即可取样进行ELISA分析。
土样取10g土壤用20-40mL丙酮提取三次，合并提取液，浓缩，然后用 PBST稀释定容至10mL,进行ELISA分析。
蔬菜样品取蔬菜样品用粉碎机绞碎后称取10g， 20-40mL丙酮提取三次，合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL,取样进行ELISA分析。 血液取人体血液，加抗凝素后直接用ELISA法进行分析。 洗胃液(2%碳酸氢钠溶液》取10mL洗胃液，用稀HC1调pH值到中性后
即可用ELISA法进行分析。
呕吐物取样品研碎，离心取上清用ELISA法进行分析。
试剂盒操作过程
1) 直接竟争ELISA法取出一块包被有多种有机磷通用包被抗原酶标板， 恢复到室温后备用；加入50uL标样或处理好的样品到各自孔中，标样和样品做 2-4个重复；加入50uL稀释的酶标共同抗体，37'C孵育l-2小时；倒出孔中的 液体，将微板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200uL稀 释好的PBST洗2-6次，拍干；然后每孔加入100uL底物液，轻微振匀，并在 37'C暗处孵育15-25分钟进行显色反应；加入50uL反应终止液，混合好后，测
定OD45tom值或者OD49。nm值。
2) 间接竞争ELISA法取出一块包被有多种有机磷通用包被抗原酶标板，
恢复到室温后备用；加入50uL标样或处理好的样品到各自孔中，标样和样品做
2-4个重复；加入50uL稀释的共同抗体，37'C孵育l-2小时倒出孔中的液体，
将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200uL稀释好
的PBST洗2-6次；加入100uL稀释好酶标二抗，37'C孵育l-2小时；倒出孔中
的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200uL
稀释好的PBST洗2-6次；然后每孔加入100uL底物液与显色物质的混和液，轻
微振匀，并在37'C暗处孵育15-25分钟进行显色反应；加入.50uL反应终止液，
混合好后，测定OD45。nm值或者OD49。nm值。
以所获得的标样和样品吸光值的平均值计算各孔的吸光值的抑制率
(ODmax陽ODmin)-(ODx-ODmin;)
抑制率(％) = - x 100%
(ODmax-ODmin)
OD皿为不加药时的吸光值，ODx为农药X时的吸光值，ODmin为空白对照
孔的吸光值。
计算的标样值绘成一个对应多种有机磷浓度(mS几)的半对数坐标系统曲线 图，直接竟争ELISA法的校正曲线在0.01~10mg/L范围内为线性；间接竟争 ELISA法的校正曲线在0.005-1 Omg/L，范围内为线性，对应样品浓度可从校正曲 线读出，也可根据标样的浓度与抑制率求出线性方程，然后求出对应样品的浓 度。有益效果
本发明的优点是能同时用于水样、土壤、中毒样品、蔬菜等食品中多种有 机磷(如甲基对硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、乙酰甲胺磷、乐果、马拉硫磷等) 残留的检测，样品的前处理过程简单，能同时检测批量的样品，样品检测成本 远低于传统的检测方法。试剂盒釆用强特异性、高效价的共同抗体，提高检测
的灵敏度、准确度、精密度。试剂盒的保存期超过12个月。本发明简单快速， 适用于农药残留现场监控的痕量分析方法，具有重要的现实意义。 具体实施例方式
在下面实施例中更详细地描述本发明，并非对本发明的限制，其中比例和 百分比在没有特别说明的情况下均为重量/重量比。 实施例1
本发明试剂盒产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂。 试剂盒中采用特殊有机磷人工半抗原与卵清蛋白的复合物作为通用包被抗 原，将其用pH为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液(含lg碳酸钠和4g碳酸氢钠， 双蒸水1L)稀释成4ug/mL，点于96孔/40孔酶标板上，100ug/孔，并用5%明胶 封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗多种有机磷共同抗体(间 接ELISA)、多种有机磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(适用于 间接竟争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(适用于直 接竞争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。配制方法如下
洗涤液(稀释液)40mL,组成比例为磷酸二氢钾O.lg、磷酸氢二钠4g、氯化 钾O.lg、吐温-20 3mL、双蒸水1000ml，为正常使用的15-30倍浓缩液；
底物稀释液50mL,配制如下柠檬酸3g，磷酸氢二钠lg,双蒸水，为正 常使用的5~10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，15mL和邻苯二胺固体粉末40mg;
特殊有机磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔 后产生的能与多种有机磷分子、多种有机磷通用包被原特异性结合的免疫球蛋 白(IgG)，抗多种有机磷共同抗体(IgG)400ml，工作浓度为1: IOOO(间接ELISA
法)；
辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(直接ELISA法)或者辣根过 氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)200uL，为正常使用时800-1500 倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗多种有机磷共同抗体为多种有机磷共同抗 体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；反应终止液为2mol/L的硫酸30mL;
多种有机磷不同浓度系列(0.1、0.5、2、 10、 50、 100mg/L)标准液6瓶，l-4mL/ 瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释10倍。 实施例2
本发明试剂盒产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂。
试刑盆甲米用特殊有机磷人工半抗与卵清蛋白的复合物作为通用包被抗原 (CBRH-OVA)，将其用pH为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液(含2g碳酸钠和 2g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5ug/mL，点于96孔/40孔酶标板上，100ug/ 孔，并用5%明胶封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗多种有机磷共同抗体(间 接ELISA)、多种有机磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(适用于 间接竟争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(适用于直 接竞争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。配制方法如下
洗涤液(稀释液)80mL，组成比例为磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠2g、氯化 钾0.3g、吐温-200.5mL、双蒸水500ml,为正常使用的15-30倍浓缩液；
底物稀释液30mL，配制如下狞檬酸6g,磷酸氩二钠lg，双蒸水，为正 常使用的5-10倍浓縮液；
酶底物为30%过氧化氢，lOmL和邻苯二胺固体粉末120mg;
特殊有机磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔 后产生的能与多种有机磷分子、多种有机磷通用包被原特异性结合的免疫球蛋 白(IgG),抗多种有机磷共同抗体(IgG)400ml，工作浓度为1: 500(间接ELISA 法)；
辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(直接ELISA法)或者辣根过 氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)400uL，为正常使用时800-1500 倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗多种有机磷共同抗体为多种有机磷共同抗 体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；
反应终止液为2mol/L的硫酸50mL;
多种有机磷不同浓度系列(0.1、0.5、2、 10、 50、 100mg/L)标准液6瓶，l-4mL/ 瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释10倍。 实施例3
本发明试剂盒产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂。 试剂盒中采用特殊有机磷人工半抗与卵清蛋白的复合物作为通用包被抗原 (CBRH-OVA)，将其用pH为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液(含2g碳酸钠和2g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5ug/ml，点于96孔/40孔酶标板上，100ug/ 孔，并用5%明胶封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗多种有机磷共同抗体(间 接ELISA)、多种有机磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(适用于 间接竞争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(适用于直 接竟争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。配制方法如下
洗涤液(稀释液)60mL，组成比例为磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化 钾0.2g、吐温-20 1.5mL、双蒸水750ml，为正常使用的15-30倍浓缩液；
底物稀释液45mL，配制如下柠檬酸4g,磷酸氢二钠2g,双蒸水，为正 常使用的5~10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，12mL和邻苯二胺固体粉末90mg;
特殊有机磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔 后产生的能与多种有机磷分子、多种有机磷包被原特异性结合的免凌球蛋白 (IgG),抗多种有机磷共同抗体(IgG)400ml，工作浓度为1: 750(间接ELISA法)；
辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(直接ELISA法)或者辣根过 氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)300uL,为正常使用时800-1500 倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标抗多种有机磷共同抗体为多种有机磷共同抗 体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；
反应终止液为2mol/L的硫酸40mL;
多种有机磷不同浓度系列(0.1、0.5、2、 10、 50、 100mg/L)标准液6瓶,l-4mL/ 瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释10倍。 实施例4
本发明试剂盒产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂。 试剂盒中釆用特殊有机磷人工半抗与卵清蛋白的复合物作为通用包被抗 原，将其用pH为9.6的0.05rpol/L碳酸盐缓冲溶液(含2g碳酸钠和2g碳酸氢钠， 双蒸水1L)稀释成0.5ug/mL，点于96孔/4(h -L酶标板上,100ug/孔,并用5% 明胶封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗多种有机磷共同抗体(间 接ELISA)、多种有机磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(适用于 间接竟争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(适用于直 接竟争ELISA法)、底物溶液和反应终止液。配制方法如下
洗涤液(稀释液)70mL,组成比例为磷酸二氢钾O.lg、磷酸氢二钠4g、氯化 钾0.15g、吐温-205.5mL、双蒸水1000ml，为正常使用的15-30倍浓缩液;底物稀释液45mL，配制如下柠檬酸3g,磷酸氢二钠2.5g,双蒸水，为正 常使用的5-10倍浓缩液；
酶底物为30%过氧化氢，14mL和邻苯二胺固体粉末120mg;
特殊有机磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔 后产生的能与多种有机磷分子、多种有机磷通用包被原特异性结合的免疫球蛋 白(IgG)，抗多种有机磷共同抗体(IgG)400ml，工作浓度为1: 700(间接ELISA 法)；
辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同抗体(直接ELISA法)或者辣根过 氧化物酶标记羊抗兔共同抗体(间接ELISA法)200uL,为正常使用时800-1500 倍浓缩液;上述辣根过氧化物酶标抗多种有机磷共同抗体为多种有机磷共同抗 体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；
反应终止液为2mol/L的硫酸350mL;
多种有机磷不同浓度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)标准液6瓶，l-4mL/ 瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释io倍。
权利要求
1. 一种同时使用于多种有机磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的酶标板和/或试管和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内含有抗多种有机磷通用包被抗原，盒内试剂包含抗多种有机磷抗体、多种有机磷标准溶液、酶标记抗多种有机磷共同抗体。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述抗多种有机磷共同抗体为通过 特殊有机磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫源注射家兔后产 生的能与多种有机磷分子、多种有机磷通用包被原特异性结合的免疫球蛋白 (IgG)。
3. 根据权利要求l所述的试剂盒，其中，所述酶标抗多种有机磷共同抗体为 多种有机磷共同抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述的酶标抗多种有机磷共同抗体 是辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体和辣根过氧化物酶标记抗多种有机磷兔共同 抗体。
全文摘要
本发明公开了一种适同时用于多种有机磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的酶标板/试管及设在盒体内的试剂。在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗多种有机磷共同抗体特异性合反应的通用包被抗原，并用明胶进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、多种有机磷标准溶液、抗多种有机磷抗体、酶标抗多种有机磷抗体、底物、显色物质和反应终止液。本发明能用于水、土壤、蔬菜等食品中及中毒样品中多种有机磷残留的同时快速检测，样品的前处理过程简单，能同时检测批量的样品，样品检测成本低于传统的检测方法。
文档编号G01N33/543GK101477118SQ20081018348
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者孙家隆 申请人:孙家隆