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专利名称：联合检测多种肿瘤标志物的化学发光免疫分析试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型提供了 一种联合检测多种肿瘤标志物的化学发光免疫分析试剂盒。
背景技术：
肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的恶性疾病，2002年世界卫生组织(WHO) 公布全世界每年新增1000万癌症病例，目前世界上死亡人数中有12%死于癌症。因 此，WHO指出及早诊断和治疗是对抗癌症的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决 定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物(Tumor marker, TM)作为一项重要指标， 在肿瘤早期诊断当中发挥着越来越重要的作用。TM是由肿瘤组织产生，存在于肿瘤 组织本身、或分泌至血液或其他体液、或因肺瘤组织刺激由宿主细胞产生的而含 量明显高于正常参考值的一类物质。TM在肿瘤的治疗监测和预后方面具有一定的 应用价值。目前发现的肿瘤标志物已经有一百多种，由于大多数情况下体内肿瘤 标志物的含量都非常低， 一般的检测方法很难对其进行精确的定量。过去对肿瘤 标志物的检测主要用放射免疫分析法，这种方法存在诸多缺点，如操作复杂、测 定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等。因此，亟待发展一 种新的检测方法对血液中TM进行精确的定量分析。
化学发光免疫分析技术的出现使检测特异性不断提高，肿瘤诊断研究不断向 深入发展。过去主要是对单个肿瘤标志物检测，由于交叉反应与标志物特异性存 在一定的差异，因此在实际应用中受到了限制。近年来，人们通过多种TM同时检 测，联合应用以期达到准确诊断肿瘤的目的。
与传统检测方法相比，本实用新型可以同时对一份样本进行多个指标的检测； 具有极高的灵敏度和可靠性；检测成本低，利于大规模推广应用。本实用新型的 反应与传统化学发光法几乎一模一样，应用表面特殊处理的标准不透明96孔微孔板作为基质，保证了反应的方便性与快捷性，兼容市场上通用的所有型号洗板机
或全/半自动板式化学发光免疫分析系统；解决了其它基于玻片或膜等的生物芯片 反应步骤的手工操作过多且操作复杂、可重复性差、均一性差等问题。 发明内容
本实用新型的目的是提供了简便、快捷、准确的联合检测多种肿瘤标志物的 化学发光免疫分析试剂盒。
本实用新型是由96孔位的支撑架及放置其上的可拆卸的不透明微孔板条组 成，其中，每12孔为一个反应条，每个反应条负载相同的抗体，检测同一个肿瘤 标志物，可以联合检测3-8种肺瘤标志物。
本实用新型精心设计的96孔板化学发光免疫分析试剂盒，高度灵敏和特异， 操作简便快速，可在短时间内同时检测3-8种肿瘤标志物的含量，费用低廉，适用 于肿瘤高危人群或肿瘤高发地区体检时多种肿瘤的辅助性初筛。它具有特异性高、 准确性高、灵敏、简便快速等优点。本实用新型特别适合肿瘤医院推广使用， 为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。
本实用新型的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光 信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性， 而灵敏度大大提高，比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，并且多种 肿瘤联合检测，提高了肿瘤诊断的特异性和准确性，可为肿瘤疾病的诊断提供更 为特异、快速、可靠的依据。

图l本实用新型实施例l、 2的结构示意图。 图2本实用新型实施例3-8的结构示意图。 图3本实用新型实施例9、 IO的结构示意图。
具体实施方式

实施例1制备联合检测前列腺癌的化学发光免疫分析试剂盒一、 酶标记物制备
用改良的过碘酸钠氧化法标记前列腺特异性抗原(PSA )、复合前列腺特异性 抗原(cPSA)、游离前列腺特异性抗原(fPSA)三种单克隆抗体。
酶标记物稀释液配制称量12. 12g的Tris , 5g BSA和lmL Proclin 300 , 将上述试剂称量好^t入洁净容器中，加双蒸水至1L,溶解混匀。
分别采用棋盘实验选择三种酶标记物的工作浓度。每个产品分装一瓶，共分 装三瓶。
二、 肿瘤标志物复合校准品的制备
用前列腺特异性抗原(PSA )、细胞角蛋白19( Cyfra21-1 )、曱胎蛋白(AFP )、 癌胚抗原(CEA )、神经元特异性烯醇化酶(NSE )、胂瘤相关抗原19-9 (CA19-9 )、 肿瘤相关抗原153 (CA15-3)、肿瘤相关抗原72-4 (CA72-4)、肿瘤相关抗原125 (CA125 )、肿瘤相关抗原50( CA50 )、胃泌素释放肽前体(ProGRP )、铁蛋白(Fer )、 组织多肽特异性抗原(TPS)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)纯品配制成肿瘤标 志物复合校准品，分装低、高两个浓度，2mL/瓶。
三、 固相反应条的制备
如图1所示，在反应条1-3上的反应孔中包被上PSA单克隆抗体 四、化学发光底物液
A液是在双蒸水中加入Tris和浓HC1配成0.1M pH为8.5的Tris-HCl 緩沖液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对多典苯酚。
B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6 的柠檬酸緩冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。
五、 2Q倍洗涤液
称量9. 9g NaH2P04 . 2H20， 56. 0g的NaH2P04 . 12H20 , 116g NaCl于洁净容器 中，加双蒸水至1L,溶解混匀，调整PH至7. 4 。
六、 半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度 及稳定性检定合格才能组装成联合检测前列腺癌的化学发光免疫分析试剂盒。組 装成试剂盒后需抽检合格后才能出厂。
实施例2制备联合检测大肠癌的化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过^舆酸钠氧化法标记CEA、 CA19-9、 CA72-4三种单克隆抗体作 为酶标记物、如图1所示，在反应条1-3上的反应孔中依次分别包被上CEA单克 隆抗体、CA19-9单克隆抗体、CA72-4单克隆抗体外，其余均以与实施例l相 同的方法制备该试剂盒。
实施例3制备联合检测肺癌的化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过》典酸钠氧化法标记Cyfra21-l、 NSE、 CEA、 ProGRP四种单克 隆抗体作为酶标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上 Cyfra21-1单克隆抗体、NSE单克隆抗体、CEA单克隆抗体、ProGRP单克隆抗体 外，其余均以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。
实施例4制备联合检测胃癌的化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记CEA、 CA19-9、 CA72-4、 Cyfra21-1四种单 克隆抗体作为酶标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被 上CEA单克隆抗体、CA19-9单克隆抗体、CA72-4单克隆抗体、Cyfra21-1单克隆 抗体外，其余均以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。 实施例5制备联合检测肝癌的化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记AFP、 CA19-9、 Fer、 GPC3四种单克隆抗体作 为酶标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上AFP单克 隆抗体、CA19-9单克隆抗体、Fer单克隆抗体、GPC3单克隆抗体外，其余均以 与实施例1相同的方法制备该试剂盒。
实施例6制备联合检测胰腺癌的化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过硤酸钠氧化法标记CEA、 CA19-9、 CA242、 CA50四种单克隆抗体作为酶标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上CEA 单克隆抗体、CA19-9单克隆抗体、CA242单克隆抗体、CA50单克隆抗体外，其 余均以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。
实施例7制备联合检测卵巢癌的化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过石典酸钠氧化法标记CA125、 CA153、 CA72-4、 AFP四种单克隆抗 体作为酶标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上CA125 单克隆抗体、CA153单克隆抗体、CA72-4单克隆抗体、AFP单克隆抗体外，其 余均以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。
实施例8制备联合检测乳腺癌的化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记CA153、 CEA、 CA72-4、 TPS四种单克隆抗体 作为酶标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上CA153 单克隆抗体、CEA单克隆抗体、CA72-4单克隆抗体、TPS单克隆抗体外，其余 均以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。
实施例9制备联合检测男性8项的肿瘤标志物化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记Cyfra21-l、 AFP、 CEA、 NSE、 CA19-9、 PSA、 CA72-4、 CA125八种单克隆抗体作为酶标记物、如图3所示，在反应条1-8上的 反应孔中依次分别包被上Cyfra21-1单克隆抗体、AFP单克隆抗体、CEA单克隆 抗体、NSE单克隆抗体、CA19-9单克隆抗体、PSA单克隆抗体、CA724单克隆 抗体、CA125单克隆抗体外，其余均以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。 实施例10制备联合检测女性8项的肿瘤标志物化学发光免疫分析试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记Cyfra21-1、 AFP、 CEA、 NSE、 CA19-9、 CA153、 CA72-4、 CA125八种单克隆抗体作为酶标记物、如图3所示，在反应条1-8上的 反应孔中依次分别包被上Cyfra21-1单克隆抗体、AFP单克隆抗体、CEA单克隆 抗体、NSE单克隆抗体、CA19-9单克隆抗体、CA153单克隆抗体、CA72-4单克隆 抗体、CA125单克隆抗体外，其余均以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。
权利要求1、一种联合检测多种肿瘤标志物的化学发光免疫分析试剂盒，它是由96孔位的支撑架及放置其上的可拆卸的不透明微孔板条组成，在每个可拆卸的不透明反应条上设置反应孔，在每个反应孔上包被有相应的抗体，其特征在于每12孔为一个反应条，每个反应条负载相同的抗体。
专利摘要本实用新型提供了一种联合检测多种肿瘤标志物的化学发光免疫分析试剂盒。本实用新型是由可拆卸的不透明微孔板组成，在每个可拆卸的不透明反应条上设置反应孔。在每个反应孔上包被相应的抗体。其特征在于每12孔为一个反应条，每个反应条负载相同的抗体，检测同一个肿瘤标志物，可以联合检测3-8种肿瘤标志物。本实用新型能简便、快速、准确的联合检测多种肿瘤标志物，它使同时检测多种肿瘤标志物的费用降低。
文档编号G01N33/574GK201237593SQ200820079989
公开日2009年5月13日 申请日期2008年4月16日 优先权日2008年4月16日
发明者唐宝军, 宋胜利, 应希堂, 坤 张, 胡国茂, 郑金来 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司