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专利名称：用于结合行为分析的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析感测表面处的分子结合(bin ding)相互作用的方法，并且更具体地涉及使用生物传感器对分析物和配体之间的相互作用进行结合行为分析的方法。
背景技术：
可以实时监测分子(例如生物分子等)之间的相互作用的分析传感器系统正获得日益増加的关注。这些系统常常基于光学生物传感器并且通常称为相互作用分析传感器或生物特定相互作用分析传感器。代表性的这样的生物传感器系统是由Biacore AB(Uppsala, Sweden)销售的BIAC0RE 仪器,其使用表面等离振子共振(SPR)用于检测样品中分子之间的相互作用和固定在感测表面上的分子结构。当样品在传感器表面上通过时，结合的进度直接反映相互作用发生的速率。样品注入后接着是缓冲剂流，在其期间检测器响应反映复合物在表面上离解的速率。来自BIAC0RE 系统的典型输出是描述分子相互作用随时间的进度的图表或曲线，其包括缔合阶段部分和离解阶段部分。通常在计算机屏幕上显示的该结合曲线常常被称为“传感器图(sensorgram)”。利用BIAC0RE 系统(和类似的传感器系统)，从而不仅可能实时确定样品中特定分子(分析物)的存在和浓度，而且可能实时确定附加的相互作用參数，该相互作用參数包括分子相互作用中结合(缔合)和离解的动力学速率常数以及表面相互作用的亲和力，而不使用标签并且通常不牵涉物质的净化。缔合速率常数(ka)和离解速率常数(kd)可以通过将许多不同样品分析物浓度的结果动力学数据拟合到采用微分方程形式的相互作用模型的数学描述而获得。亲和カ(表达为亲和力常数Ka或离解常数Kd)可以从缔合速率和离解速率常数计算。然而，许多时候，可能难以获得明确的动力学数据，并且因此通过平衡结合分析来测量亲和カ通常是更可靠的，平衡结合分析牵涉对一系列分析物浓度确定平衡或稳定状态时的结合水平，假定该平衡或稳定状态在结合相互作用的缔合阶段结束时或临近结束时已经达到。为了确保结合曲线的缔合阶段确实可能已经达到稳定状态，人们通常提前确定对于结合分析物在意于被用于亲和カ测量的条件下达到平衡所必需的样品注入时间长度(即，样品与传感器芯片表面的接触时间)。因为达到平衡花费的时间和分析物离解花费的时间两者主要由离解速率常数支配，近似的注入时间也可从离解常数估计。

发明内容
本发明的目的是提供使用生物传感器对分析物和配体之间的相互作用进行结合行为分析的新方法和生物传感器系统，该方法和生物传感器系统克服现有技术的ー个或多个缺点。这通过如在独立权利要求中限定的方法和生物传感器系统来实现。当频繁评估大数据集时预期结合行为标记是非常有用的工具，显著提高评估吞吐量并且由此提高总筛选呑吐量。本发明的更完整理解以及其另外的特征和优势将通过參考以下详细描述和图而获得。


图1是基于SPR的生物传感器系统的示意侧视图。图2是其中结合曲线具有明显的缔合和离解阶段的代表性传感器图。图3是根据本发明的方法的示意框图。图4示出药物分子片段的典型结合行为。图5示出ー图，其中根据本发明，与满足ー结合行为准则的响应曲线有关的相互作用參数在图形上可区别于与满足另一个结合行为准则或不满足结合行为准则的响应曲线有关的相互作用參数。图6示出显示注入期间的渐增响应的响应曲线的示例。图7不出在注入后具有升闻的基线的响应曲线的不例。
具体实施例方式除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与由涉及本发明的领域内的技术人员所通常理解的相同的含义。同样，除非另外说明，単数形式“一”和“该”意味着包括多个指代物。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他參考通过引用整体结合于此。如上文提到的，本发明涉及对来自相互作用的多个数据集的、分子结合相互作用的稳态结合数据进行评估，以确定该相互作用的ー个或多个相互作用參数，其中除稳态结合数据以外的、来自数据集的其他相互作用数据用于估计数据集的稳态结合数据的可靠性。典型地，实验性的结合数据由基于传感器的技术获得，该技术研究分子相互作用并且当相互作用进行时实时呈现结果。然而，在更详细地描述本发明之前，将描述本发明意于在其中使用的一般上下文。化学传感器或生物传感器典型地基于检测传感器表面的性质(例如固定层的质量、折射率或厚度)上的变化的无标签技术，但也存在依赖于某种标签的传感器。典型的传感器检测技术包括但不限于诸如光学、热光和压电或声波方法(其包括例如表面声波(SAW)和石英晶体微天平(QCM)方法)之类的质量检测方法，以及诸如电位计、电导计、安培计和电容/阻抗方法之类的电化学方法。关于光学检测方法，代表性的方法包括检测质量表面浓度的那些方法，诸如反射光学方法等，其包括采用角度、波长、偏振或相位分辨的外部反射方法和内部反射方法，例如两者都可包括经由表面等离振子共振(SPR)的衰减场增强的衰减波椭圆光度法和衰减波光谱学(EWS，或内部反射光谱学)、布鲁斯特角屈光计检查法(refractometry)、临界角屈光计检查法、受抑全反射(FTR)、散射全内反射(STIR)(其可包括散射增强标签)、光学波导传感器；外部反射成像、基于衰减波的成像(诸如临界角分辨成像、布鲁斯特角分辨成像、SPR角分辨成像等)。此外，可能提到基于例如表面增强拉曼光谱学(SERS)、表面增强共振拉曼光谱学(SERRS)、衰减波荧光(TIRF)和磷光的光度计和成像/显微镜检查方法(“自身”或与反射方法結合)，以及波导干涉仪、波导泄漏模式光谱学、反射干涉光谱学(RIfS)、透射干渉量度学、全息光谱学和原子力显微镜检查法(AFR)。商业上可获得的生物传感器包括前面提到的BIAC0RE 系统仪器(由Biacore AB,Uppsala, Sweden制造和营销),其基于表面等离振子共振(SPR)并且准许在结合的配体和感兴趣的分析物之间实时监测表面结合相互作用。在该上下文中，“配体”是对于给定分析物具有已知或未知亲和カ的分子并且包括固定在表面上的任何捕捉或捕获试剂，而“分析物”包括对于配体的任何特定的结合配偶体(partner )。尽管在接下来的详细描述和示例中，在SPR光谱学(并且更具体地BIAC0RE 系统)的上下文中说明本发明，但要理解的是，本发明不限于该检测方法。相反，可采用任何基于亲和カ的检测方法，在该检测方法中分析物结合到固定在感测表面上的配体，给定可以测量在感测表面处的变化，该变化是分析物与该感测表面上的固定配体的结合的定量指示。SPR现象是众所周知的，可以说当光在某些条件下在不同折射率的两种介质之间的界面处反射、并且该界面涂敷有金属(典型地为银或金)膜吋，SPR就出现。在BIAC0RE 仪器中，介质是样品和通过微流体流动系统与样品 接触的传感器芯片的玻璃。该金属膜是在芯片表面上的薄金层。SPR使反射光的強度在特定反射角处降低。该最小反射光強度的角度随靠近在与反射光相反的侧(BIAC0RE 系统中的样品侧)上的表面的折射率变化。BIAC0RE 系统的示意图在图I中示出。传感器芯片I具有支撑例如抗体的捕捉分子(配体)3的金膜2,其暴露于通过流通道(flow channel)5的具有例如抗原的分析物4的样品流。来自光源7 (LED)的单色P偏振光6由棱镜8稱合于玻璃/金属界面9,光在这里被全反射。该反射光束10的強度由光学检测单元11 (光电检测器阵列)检测。BIAC0RE 仪器和SPR现象的技术方面的详细论述可在美国专利号5，313，264中找到。关于生物传感器感测表面的基体涂层的更详细信息在例如美国专利号5，242，828和5，436，161中给出。另外，与BIAC0RE 仪器连同使用的生物传感器芯片的技术方面的详细论述可在美国专利号5，492，840中找到。当样品中的分子结合到传感器芯片表面上的捕捉分子时，表面处的浓度变化以及因而表面处的折射率变化，并且检测到SPR响应。绘制相互作用过程期间响应对时间的图，将提供相互作用进度的量化測量。这样的图，或动力学曲线或结合曲线(结合等温线)通常叫做传感器图，有时在本领域内也称为“亲和カ迹线(affinity trace)”或“亲和カ图(affinogram)”。在BIAC0RE 系统中，SPR响应值采用共振单位(RU)表达。ー个RU表示最小反射光強度的角度上的O. 0001°的变化，该变化对于大多数蛋白质和其他生物分子对应于传感器表面上大约lpg/mm2的浓度上的变化。当包含分析物的样品接触传感器表面吋，结合到传感器表面的捕捉分子(配体)在称为“缔合”的步骤中与该分析物相互作用。该步骤在传感器图上由当样品最初处于与传感器表面接触时RU中的増加来指示。相反地，一般当样品流由例如缓冲剂流代替时发生“离解”。该步骤在传感器图上由当分析物从表面结合的配体离解时RU中随时间的下降来指示。传感器芯片表面处的可逆相互作用的代表性传感器图(结合曲线)在图2中呈现，具有固定捕捉分子或配体(例如抗体)的感测表面因此在样品中与其结合配偶体或分析物相互作用。由生物传感器系统基于上文提到的其他检测原理产生的结合曲线将具有相似的外观。垂直轴(y轴)指示响应(这里采用共振単位，RU)，并且水平轴(X轴)指示时间(这里采用秒)。最初，缓冲剂在感测表面上通过，给出传感器图中的基线响应Δ。在样品注入期间，由于分析物的结合而观察到信号中的増加。结合曲线的该部分S通常称为“缔合阶段”。最終，在该缔合阶段结束时或临近结束时达到稳态状况，其中共振信号在￡达到平稳状态(然而，该状态不总是可达到)。要注意本文中术语“稳态”与术语“平衡”同义使用(在其他上下文中术语“平衡”可被保留以描述理想相互作用模型，因为实践中结合可以是随时间恒定的，即使系统不处于平衡中)。在样品注入结束时，用缓冲剂的连续流代替样品，并且信号中的減少反映分析物从表面的离解或释放。结合曲线的该部分2通常称为“离解阶段”。分析通过再生步骤结束，其中能够将结合分析物从表面移除同时(理想地)維持配体的活性的溶液注入传感器表面之上。这在传感器图的部分￡中指示。缓冲剂的注入恢复基线Δ并且表面现在准备好进行新分析。分别从缔合和离解阶段U和2的轮廓，获得关于结合动力学和离解动力学的信息，并且共振信号在￡的高度表示亲和カ(产生于相互作用的响应与表面上的质量浓度上的变化有夫)。现在将在下文更详细地对其进行解释。表面结合率
假设分析物A和表面结合(固定)捕捉分子或配体B之间的可逆反应，其不受扩散或质量传递限制并且遵守伪第一级动力学
权利要求
1.ー种方法，使用生物传感器评估多个分析物和配体之间的相互作用的相互作用參数，所述方法包括步骤 A :提供传感器表面，其上固定有所述配体， B :使所述传感器表面与所述多个分析物接触， C :为所述多个分析物中的每ー个记录传感器响应曲线， D :从每个传感器响应曲线中提取相互作用參数， E :根据ー个或多个结合行为准则评估每个传感器响应曲线， F :在图中显示所述相互作用參数，其中与满足ー结合行为准则的响应曲线有关的相互作用參数在图形上可区别于与满足另一个结合行为准则或不满足结合行为准则的响应曲线有关的相互作用參数。
2.如权利要求I所述的方法，其中与满足两个或更多结合行为准则的响应曲线有关的相互作用參数在图形上可区别于与不满足或满足ー个结合行为准则的响应曲线有关的相互作用參数。
3.如权利要求I所述的方法，其中一个结合行为准则是所述记录的响应在分析物接触时间期间以超过预定速率的速率増加。
4.如权利要求I所述的方法，其中一个结合行为准则是所述记录的响应在所述分析物已与所述传感器表面接触后超过预定值。
5.如权利要求I所述的方法，其中一个结合行为准则是所述记录的最大响应超过所述分析物相互作用的预定值。
6.如权利要求I所述的方法，其中所述传感器表面在每个分析物之间再生。
7.ー种分析系统，用于检测分子结合相互作用，包括 (i)生物传感器，其包括至少ー个感测表面，用于检测在所述至少一个感测表面处的分子结合相互作用的检测单元，以及用于产生表示结合曲线的检测数据的単元，其中每个曲线表示结合相互作用随时间的进度，以及 (ii)数据处理単元，其用于执行如在权利要求I至6的任一项中所限定的那样的、权利要求I的步骤A至H。
8.一种计算机程序，其包括程序代码单元，所述程序代码单元用于当所述程序在计算机上运行时根据权利要求I至6的任一项确定分析物和配体之间的相互作用的ー个或多个相互作用參数。
全文摘要
本发明“用于结合行为分析的方法和系统”。一种方法，其使用生物传感器评估多个分析物和配体之间的相互作用的相互作用参数，该方法包括步骤A提供传感器表面，其上固定有配体，B使该传感器表面与多个分析物接触，C为多个分析物中的每一个记录传感器响应曲线，D从每个传感器响应曲线提取相互作用参数，E根据一个或多个结合行为准则评估每个传感器响应曲线，F在图中显示相互作用参数，其中与满足一结合行为准则的响应曲线有关的相互作用参数在图形上可区别于与满足另一个结合行为准则或不满足结合行为准则的响应曲线有关的相互作用参数。
文档编号G01N21/55GK102667447SQ201080053944
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月29日 优先权日2009年11月30日
发明者O.卡尔森 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司