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专利名称：马尾松针挥发油成分的气相色谱指纹图谱的建立方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药分析技术领域，用于松针药材的鉴别及成分比较，尤其涉及马尾松针挥发油成分的气相色谱(GC)指纹图谱的建立方法和应用。
背景技术：
马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是我国亚热带南部潮湿地区分布最广的树种。 干燥的马尾松针叶作为一味常用中药，《本草纲目》上记载“松针，气味苦、温，毒，久服令人不老，轻身益气，主治风湿疮，生毛发，安五脏，守中，不饥延年。”现代研究表明，松针具有镇静、镇痛抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，加之资源丰富，再生速度快，因而日益受到人们的重视。有研究从马尾松松针水煎液的正丁醇部位分离得到了 5个化合物(郑晓珂，冯卫生，王彦志，等.松针的化学成分研究[J].中国药学杂志，2004,39(11) 820).但有关不同产地松针的成分研究未见报道。本专利申报前期已通过药效实验筛选出了松针镇静催眠有效部位，并开展了松针药材的成分研究，已初步分析得到了马尾松针的挥发性成分谱。目前对马尾松针挥发油中的有效成分，中国药典2010年版一部尚无规定。鉴于药典(2010年版，一部)中未收载有关松针的标准；目前尚未见有关马尾松针挥发油成分GC分析的文献报道。故发明一项既能够快速准确地进行马尾松针挥发油成分分析的方法，同时在某种程度上能够反映药材的品质的分析方法，具有重要的学术研究价值及实际应用的价值。

发明内容
为了解决松针药材的鉴别及成分比较存在的技术问题，本发明的一个目的是提供马尾松针挥发油成分的气相色谱(GC)指纹图谱的建立方法，本发明的另外一个目的是提供采用上述的气相色谱(GC)指纹图谱对马尾松药材及其制剂进行鉴别和含量差异分析。 本发明的指纹图谱方法分析马尾松针中挥发油成分，以石竹烯为参照物，采用GC法，建立马尾松针挥发油的气相色谱指纹图谱，并对不同产地的马尾松针挥发油成分进行比较，为马尾松药材及其制剂的质量控制提供依据，达到准确使用药材，严格区分其他混淆品的目的。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，该方法包括以下的步骤1)对照品溶液的制备精密吸取石竹烯对照品，配制成石竹烯对照品溶液；2)供试品溶液制备鲜松针采集后，按照挥发油提取法，自测定器上端加水使充满刻度部分，连接回流冷凝管，加热蒸馏，放冷，分取挥发油层，读取体积数后脱水，定容，摇勻，即得供试品溶液；3)气相色谱分析采集不同产地的松针药材多批次，按照步骤2、制备得到供试品溶液，分别进样， 进行色谱分析，得到气相色谱图；4)松针挥发油气相指纹图谱中共有峰的标定通过对上述不同产地松针供试品溶液的气相色谱分析，对步骤4)所得气相色谱图进行分析，得到气相色谱图；结果显示各样品中大部分成分的色谱峰均出现在保留时间 5 20min之间，色谱峰分离良好，其中17个色谱峰为所有供试品所共有的特征峰，其中6 号为石竹烯，将其作为参比峰；5)松针挥发油气相指纹图谱分析结果通过对上述不同产地松针样品的气相色谱分析，松针指纹图谱特征如下上述样品的色谱图中均出现1-17号峰，其中6号与石竹烯对照品色谱图石竹烯的保留时间相同； 以石竹烯对照品保留时间为参照，计算各共有指纹峰的相对保留时间，相对保留时间的RSD 均小于1.0%，所有样品中，共有指纹峰峰面积之和占总峰面积之比值均大于69 %。作为优选的方法，上述的步骤1)中先将石竹烯对照品置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，摇勻，制得石竹烯储备溶液，再精密吸取上述石竹烯储备溶液，置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，摇勻，配制成质量浓度为1 μ g/mL的石竹烯对照品溶液。作为优选的方法，上述的步骤2、中鲜松针采集后，切成2cm长小段，阴干至含水量 8%以下，密封保存，精密称取松针小段，置挥发油提取器中，加水1L，浸泡10h，然后进行提取。作为优选的方法，上述的步骤幻中脱水采用无水硫酸钠脱水，挥发油溶解、定容
采用二氯甲烷。作为优选的方法，上述的步骤3)中气相色谱条件如下氢火焰离子化检测器FID，HP-5ms色谱柱，30mX0. 32mmX0. 25 μ m，载气为恒流流速的高纯He 1. OmL/min，燃气为H2 :250mL/min，助燃气为空气250mL/min ；采用分流进样方式，分流比为50 1 ；进样量为1. 0μ L ；气化室温度为280°C ；柱温程序升温初温为50°C，停留2min，以10°C /min升至170°C，保持8min，以 50C /min 升至 250°C，保持 2min ；氢火焰离子化检测器的检测温度为300°C。作为优选的方法，上述的步骤3)中采用8 15批次不同产地的松针药材。作为最优选的方法，上述的步骤幻中采用10批次不同产地的松针药材。作为优选的方法，上述的步骤4)中1-17号色谱峰分别为色谱图中保留时间 7. 426min、8. 118min、8. 916min、10. 758min、ll. 406min、14. 083min、14. 556min、14. 823min、 15. 023minU5. 288minU5. 413minU6. 656minU7. 299minU7. 826minU8. 422min> 18. 798min、25. 699min 的色谱峰。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案马尾松药材及其制剂的鉴别方法，该方法采用上述任意一项技术方案所述的方法建立的气相色谱-指纹图谱。马尾松药材及其制剂的含量差异分析方法，该方法采用上述任意一项技术方案所述的方法建立的气相色谱-指纹图谱。本发明由于采用了上述的技术方案，优点在于1、中国药典2010年版一部中未收载马尾松，其他国家及地方标准均无马尾松针药材标准的内容；马尾松针作为近年来广泛应用的药材资源，有必要研究并制订其质量标准，马尾松针的挥发油GC指纹图谱作为马尾松的鉴别及含量差异分析方法，是其质量标准的重要内容。本发明与及文献方法相比，方法快速，简便，重现性和稳定性均很好，特征性强，能够作为松针鉴别的依据，并为马尾松药材及其制剂的质量控制提供依据。2、本发明方法先进，采用GC法，建立了马尾松挥发油的气相色谱指纹图谱。3、本发明方法操作简单，所使用的仪器设备和材料普及性好，便于药材种植、加工及销售企业推广应用。


图1为产地为浙江临安的松针挥发油色谱图，图中6号峰为石竹烯。图2为石竹烯对照品色谱图。图3为10批不同产地松针样品挥发油的GC色谱叠加图。
具体实施例方式实施例1马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，该方法包括以下的步骤1)精密吸取并称量0. 05mg竹烯对照品，置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度， 摇勻，制得石竹烯储备溶液，再精密吸取石竹烯储备溶液0. 5mL，置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，摇勻，即制备得到质量浓度为1 μ g/mL的石竹烯对照品溶液；2)采集松针(产地浙江临安)，切成2cm小段后阴干，精密称取松针小段50g，置挥发油提取器中，加水1L，浸泡10h，按照挥发油提取法O010版中国药典一部附录》))，自测定器上端加水使充满刻度部分，连接回流冷凝管，加热蒸馏2.证，放冷，分取挥发油层，读取体积数为0. 30mL，加0. 2g无水硫酸钠脱水，通过脱脂棉滤过，挥发油用二氯甲烷溶解，脱脂棉用二氯甲烷洗涤2次，洗涤液并入挥发油溶液中，并定容至10mL，摇勻，即得到以松针药材计，质量浓度为5g/mL的供试品溶液；;3)GC 条件氢火焰离子化检测器FID，HP-5ms色谱柱(30mX 0. 32mmX 0. 25 μ m)，载气为恒流流速的高纯He :1. OmL/min，燃气为H2 :250mL/min，助燃气为空气250mL/min ；采用分流进样方式，分流比为50 1;进样量为1.(^1^。气化室温度为280°C ；柱温程序升温初温为 50°C，停留 2min，以 10°C /min 升至 170°C (保持 8min)，以 5°C /min 升至 250°C (保持 2min)；氢火焰离子化检测器的检测温度为300°C ；4) GC 分析取步骤2)的供试品溶液，按步骤3)的条件进行测定。得到GC图谱见图1 ；其中1-17号色谱峰分别为色谱图中保留时间7. 426min、8. 118min、8. 916min、10. 758min、 11. 406minU4. 083minU4. 556minU4. 823minU5. 023minU5. 288minU5. 413min>16. 656min、17. 299min、17. 826min、18. 422min、18. 798min、25. 699min 的色谱峰；17 个特征峰的峰面积之和占总峰面积之比为84. 75%。实施例2采集不同产地的松针药材10批次，按照上述的方法得到气相色谱图，然后进行GC 分析。表1为10批松针共有指纹峰的相对保留时间；表2为10批松针共有指纹峰的相对峰面积。
权利要求
1.马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1)对照品溶液的制备精密吸取石竹烯对照品，配制成石竹烯对照品溶液；2)供试品溶液制备鲜松针采集后，按照挥发油提取法，自测定器上端加水使充满刻度部分，连接回流冷凝管，加热蒸馏，放冷，分取挥发油层，读取体积数后脱水，定容，摇勻，即得供试品溶液；3)气相色谱分析采集不同产地的松针药材多批次，按照步骤2)制备得到供试品溶液，分别进样，进行色谱分析，得到气相色谱图；4)松针挥发油气相指纹图谱中共有峰的标定通过对上述不同产地松针供试品溶液的气相色谱分析，对步骤4)所得气相色谱图进行分析，得到气相色谱图；结果显示各样品中大部分成分的色谱峰均出现在保留时间5 20min之间，色谱峰分离良好，其中17个色谱峰为所有供试品所共有的特征峰，其中6号为石竹烯，将其作为参比峰；5)松针挥发油气相指纹图谱分析结果通过对上述不同产地松针样品的气相色谱分析，松针指纹图谱特征如下上述样品的色谱图中均出现1-17号峰，其中6号与石竹烯对照品色谱图石竹烯的保留时间相同；以石竹烯对照品保留时间为参照，计算各共有指纹峰的相对保留时间，相对保留时间的RSD均小于1. 0%，所有样品中，共有指纹峰峰面积之和占总峰面积之比值均大于69%。
2.根据权利要求1所述的马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤1)中先将石竹烯对照品置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，摇勻，制得石竹烯储备溶液，再精密吸取上述石竹烯储备溶液，置于5mL的容量瓶中，加二氯甲烷至刻度，摇勻，配制成质量浓度为1 Pg/mL的石竹烯对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤2)中鲜松针采集后，切成2cm长小段，阴干至含水量8%以下，密封保存，精密称取松针小段，置挥发油提取器中，加水1L，浸泡10h，然后进行提取。
4.根据权利要求1所述的马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤2)中脱水采用无水硫酸钠脱水，挥发油溶解、定容采用二氯甲烷。
5.根据权利要求1所述的马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤3)中气相色谱条件如下氢火焰离子化检测器FID，HP-5ms色谱柱，30mX0. 32mmX0. 25Mm，载气为恒流流速的高纯 He 1. OmL/min，燃气为 H2 :250mL/min，助燃气为空气250mL/min ；采用分流进样方式，分流比为50:1 ；进样量为1. Ομ ；气化室温度为280°C ；柱温程序升温初温为50°C，停留2min，以10°C /min升至170°C，保持8min，以5°C / min 升至 250°C，保持 2min ；氢火焰离子化检测器的检测温度为300°C。
6.根据权利要求1所述的马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤3)中采用8 15批次不同产地的松针药材。
7.根据权利要求6所述的马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤3)中采用10批次不同产地的松针药材。
8.根据权利要求1所述的马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法， 其特征在于步骤4)中1-17号色谱峰分别为色谱图中保留时间7. 426min、8. 118min、 8. 916minU0. 758minUl. 406minU4. 083minU4. 556minU4. 823min >15. 023min> 15. 288minU5. 413min 、16. 656min> 17. 299min> 17. 826min> 18. 422min> 18. 798min 、 25. 699min的色谱峰。
9.马尾松药材及其制剂的鉴别方法，其特征在于该方法采用权利要求1 8任意一项权利要求所述的方法建立的气相色谱-指纹图谱。
10.马尾松药材及其制剂的含量差异分析方法，其特征在于该方法采用权利要求1 8 任意一项权利要求所述的方法建立的气相色谱-指纹图谱。
全文摘要
本发明属于中药分析技术领域，用于松针药材的鉴别及成分比较，尤其涉及马尾松针挥发油成分的气相色谱(GC)指纹图谱的建立方法和应用。马尾松针挥发油成分的气相色谱-指纹图谱的建立方法，该方法包括以下的步骤1)对照品溶液的制备；2)供试品溶液制备；3)气相色谱分析；4)松针挥发油气相指纹图谱中共有峰的标定；5)松针挥发油气相指纹图谱分析结果。本发明与及文献方法相比，方法快速，简便，重现性和稳定性均很好，特征性强，能够作为松针鉴别的依据，并为马尾松药材及其制剂的质量控制提供依据。
文档编号G01N30/88GK102175807SQ20111002262
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者俞忠明, 寿旦, 张扬, 李洪玉, 章建民 申请人:浙江省中医药研究院