专利名称：乳酸传感器的制作方法
技术领域：
本公开涉及ー种含有乳酸氧化酶及媒介体的乳酸传感器。
背景技术：
已知乳酸是运动后在体内生成的疲劳物质。由此，为了掌握训练效果或训练状态，在竞技场或者现�。樗岽衅鞯玫焦惴旱氖褂茫硗舛云浠挂罂梢约虮愕丶觳�、计測。但是，由于乳酸传感器中所用的乳酸氧化酶与葡萄糖传感器中所用的葡萄糖氧化酶相比每个单元的单价更高，因此存在传感器的单价升高的问题。为此，为了解决该问题，例如提出了在反应层中为提高乳酸氧化酶的活性而包含磷酸盐的乳酸传感器(日本专利第3498105 号公报)等。另外，作为乳酸传感器等生物传感器的制造方法，例如有包括在具有电极的基板上表面形成至少包含媒介体、表面活性剤、缓冲剂及层状无机化合物的无机凝胶层的エ序的方法(日本专利第4088312号公报)。如上所述，由于乳酸是疲劳度的标志，因此乳酸传感器在运动领域的训练等中得到广泛的使用。另ー方面，在训练的情况下，需要迅速地计测疲劳度而确认疲劳度，以确定接下来的运动负荷。由此，要求有能够在短时间内精度优良地计测的乳酸传感器。但是，就以往的乳酸传感器而言，由于酶反应速度慢，因此测定中所需的时间长，要求进ー步缩短测定时间。
发明内容
所以，本公开，作为一个实施方式，提供一种可以在短时间内精度优良地測定乳酸浓度的乳酸传感器。本公开，作为一个实施方式，还涉及一种如下的乳酸传感器(以下也称作“本公开的乳酸传感器”)，即，具备绝缘性基板、配置于所述基板上的至少包括作用极和对电极的电极系、以及配置于所述电极系上的试剂层，所述试剂层含有乳酸氧化酶、媒介体、以及N-(2-こ酰胺基)-2-氨基こ磺酸(以下也称作“ACES”)。本公开，作为其他的实施方式，涉及ー种乳酸浓度的测定方法(以下也称作“本公开的乳酸浓度測定方法”)，即，包括使含有乳酸氧化酶、以及N-(2-こ酰胺基)-2-氨基こ磺酸的试剂与试样接触；以及借助媒介体电化学地測定所述试样中的乳酸与所述乳酸氧化酶的反应。本公开，作为另ー个其他的实施方式，涉及ー种乳酸传感器的制造方法(以下也称作“本公开的制造方法”)，即，包括在配置有至少包括作用极和对电极的电极系的绝缘性基板的所述电极系上，形成含有乳酸氧化酶、媒介体、以及N-(2-こ酰胺基)-2-氨基こ磺酸的试剂层。根据本公开，作为一个实施方式，可以提供能够在短时间内精度优良地測定乳酸浓度的乳酸传感器。
图1是说明乳酸传感器的制造方法的一个例子的示意图。图2是说明乳酸传感器的构成的一个例子的示意图，是图1F中所示的乳酸传感器的1-1剖面图。图3是表示在用实施例1及比较例I到6的乳酸传感器测定试样时检出的电流值的曲线图的ー个例子。图4是表示在用实施例1及2的乳酸传感器测定试样时检出的电流值与试样的乳酸(Lac)浓度的关系的曲线图的ー个例子。图5是表示在用实施例2及比较例7的乳酸传感器测定试样时检出的电流值与试样的乳酸浓度的关系的曲线图的ー个例子。
图6是表示在用实施例4中制作的乳酸传感器测定试样时检出的电流值与试样的乳酸浓度的关系的曲线图的ー个例子。
具体实施例方式本公开作为一个实施方式，基于如下的见解，S卩，就以往的乳酸传感器而言，由于酶反应速度慢，因此特别是在试样中的乳酸浓度高的情况下，在短时间的測定中无法获得足够的灵敏度。另外，本公开作为一个实施方式，还基于如下的见解，即，如果作为缓冲剂使用ACES，则可以提高乳酸氧化酶的酶反应速度，因此可以缩短反应所需的时间，优选即使在试样中的乳酸浓度高的情况下，也可以在短时间内精度优良地測定乳酸浓度。虽然对于通过使用ACES作为缓冲剂可以缩短反应所需的时间、可以在短时间内測定乳酸浓度的机理的详情并不清楚，然而可以如下所示地推定。即，因ACES使乳酸氧化酶的活性提高，而提高了试样中的乳酸与乳酸氧化酶的反应速度。由此可以认为，从酶反应开始到结束的时间被缩短，从而可以缩短反应所需的时间，另外，即使在试样中的乳酸浓度高的情况下，也可以在短时间内精度优良地測定乳酸浓度。然而，本公开也可以不被限定为这些机理地解释。而且，本说明书中，所谓“试样中的乳酸浓度高的情况下”，在ー个或多个的实施方式中，是指试样中的乳酸浓度为lOmmol/L以上、12mmol/L以上、或者20mmol/L以上。[试样]本公开的乳酸传感器及本公开的乳酸浓度测定方法中的测定对象试样在ー个或多个实施方式中，既可以是血液、体液、尿等生物试样，也可以是其他的液体试样。[乳酸传感器]本公开的乳酸传感器是如下的构成，S卩，具备绝缘性基板、至少包括作用极和对电极的电极系、以及试剂层，所述电极系配置于所述基板上，所述试剂层配置于所述电极系上。电极系在一个或多个实施方式中，只要至少包括作用极和对电极即可，此外也可以还包括參照极等。所述电极可以使用以往或今后开发的乳酸传感器或葡萄糖传感器等生物传感器中所用的电极，没有特别限制。作为作用极及对电极，没有特别限制，在一个或多个实施方式中，既可以使用碳电极，也可以使用金属电极。作为碳，在一个或多个实施方式中，可以举出热解石墨碳、玻璃碳、碳糊、以及全氟碳(PFC)等。作为金属,在ー个或多个实施方式中，可以举出钼、金、银、镍、以及钯等。參照极没有特别限制，可以应用在电化学实验中普遍使用的电极，在一个或多个实施方式中，可以举出饱和甘汞电极、银-氯化银电极等。电极系可以根据所要形成的电极的材质利用以往公知的方法来形成，没有特别限定，然而在ー个或多个实施方式中，可以利用光刻技术、蒸镀法、溅射法、以及印刷技术等来形成。作为印刷技术，在一个或多个实施方式中，可以举出丝网印刷、凹版印刷、以及柔版印刷等。绝缘性基板的材质可以使用以往或今后开发的生物传感器中所用的材料，没有特别限制，在一个或多个实施方式中，可以举出硅、玻璃、玻璃环氧树脂、陶瓷、聚对苯ニ甲酸こニ醇酯(PET)、聚苯こ烯、聚甲基丙烯酸酷、聚丙烯、丙烯酸树脂、聚氯こ烯、聚こ烯、聚丙烯、聚酷、以及聚酰亚胺等。本公开的乳酸传感器中，试剂层含有乳酸氧化酶、媒介体、以及ACES。
乳酸氧化酶没有特别限制，可以使用以往或今后开发的乳酸传感器中所用的公知的乳酸氧化酶或市售的乳酸氧化酶等。对于乳酸氧化酶在每I片乳酸传感器中的含量，在一个或多个实施方式中，可以是以往或今后开发的乳酸传感器中所配置的量，从生产性(成本)及检测灵敏度的维持的观点考虑，优选为1. 0 3. 0UU. 6 2. 4U、或1. 8 2. 2U。而且，本说明书中U是酶单位，IU是乳酸氧化酶将I U mo I的乳酸在30°C以I分钟氧化的酶量。本说明书中所说的“每I片乳酸传感器中的含量”，在一个或多个实施方式中，是指在具有I个至少包括作用极和对电极的电极系的乳酸传感器中所用的量，在进ー步的一个或多个实施方式中，是指配置于I个电极系上的试剂层中所含的量，在更进一歩的ー个或多个实施方式中，是指以包含在因添加试样时(使用吋)将试剂层利用试样溶解而形成的反应体系中的方式配置的量。另外，本说明书中说到“每I片乳酸传感器中的含量”时的乳酸传感器，在一个或多个实施方式中，是针对血液试样使用的通常的尺寸的传感器，所添加的血液试样例如是指0.1 5. OiU、或0. 3 1. OiU的试样。另外，乳酸传感器在进ー步的ー个或多个实施方式中，是指血液试样与试剂层接触而形成的反应体系的容量，例如为0.1 5. 0 Ii1、或0. 3 1. 0 Ii I的传感器。所以，对于“姆I片乳酸传感器中的含量”，在一个或多个实施方式中，可以根据电极系的数目、和/或试样或者反应体系的容量，适当地调节本说明书中公开的范围。ACES (N-(2-こ酰胺基)-2_氨基こ磺酸、C4HltlN2O4S)是Good’s缓冲剂之一，可以使用市售的材料。对于ACES在每I片乳酸传感器中的含量，在一个或多个实施方式中，从缩短测定时间及提高測定灵敏度的方面考虑，例如为0.1 10重量％、或0. 5 5. 0重量％。本公开的乳酸传感器中，也可以包含ACES以外的缓冲剂。在一个或多个实施方式中，从缩短测定时间及提高測定灵敏度的方面考虑，全部缓冲剂中的ACES的比例优选为50重量％以上、80重量％以上、或者实质上由ACES构成。作为媒介体，在一个或多个实施方式中，可以举出铁氰化钾、细胞色素C、吡咯喹啉醌(PQQ)、NAD+、NADP+、铜络合物、钌化合物、以及吩嗪硫酸甲酷及其衍生物等，它们既可以単独使用，也可以以2种以上并用。它们当中，从缩短测定时间及提高測定灵敏度的方面考虑，优选钌化合物、或者钌化合物与吩嗪硫酸甲酷或其衍生物的并用。作为钌化合物，可以使用在生物传感器中一直作为媒介体使用的或者今后所要使用的钌化合物。钌化合物在一个或多个实施方式中，优选为能够作为氧化型的钌络合物存在于所述反应体系中的化合物。作为所述钌络合物，在一个或多个实施方式中，只要是作为媒介体(电子传递体)发挥作用，其配体的种类就没有特别限定，然而氧化型的配体优选使用以下述化学式表示的配体。[Ru(NH3)5X]11+作为所述化学式中的X，在一个或多个实施方式中，可以举出NH3、卤素离子、CN、批啶、烟酰胺、或H2O等，它们当中优选NH3或卤素离子(例如Cl—、F—、Br—、I—)。所述化学式中的n+表示氧化型钌(III)络合物的价数，可以根据X的种类适当地确定。对于钌化合物在每I片乳酸传感器中的含量，在一个或多个实施方式中，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，优选为0.1 100 i! g、l 80 i! g、或者10 50 i! g。作为吩嗪硫酸甲酷及其衍生物(以下也称作“PMS”)，在一个或多个实施方式中，可以举出吩嗪硫酸甲酯及1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐(1-甲氧基PMS)等，从试剂 稳定性的观点考虑，优选1-甲氧基PMS。对于PMS在姆I片乳酸传感器中的含量,在一个或多个实施方式中，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，优选为I 2000pmol、10 lOOOpmol、或者100 500pmol。试剂层在一个或多个实施方式中，从进一歩提高测定灵敏度的观点考虑，优选包含多糖类和/或寡糖(以下也简称为“糖”)。本说明书中所谓“多糖类”，是指结合了 10个以上的单糖的物质，在一个或多个实施方式中，可以举出葡聚糖、环糊精、糊精、淀粉、纤维素、以及琼脂糖等。本说明书中所谓“寡糖”，是指结合了小于10个的单糖的物质，在ー个或多个实施方式中，可以举出结合了 2个单糖的ニ糖类、结合了 3个单糖的三糖类、以及结合了 4个单糖的四糖类等。作为ニ糖类，在一个或多个实施方式中，可以举出麦芽糖、以及蔗糖等。作为糖，尤其是从提高低温下的測定中的測定灵敏度的观点考虑，优选葡聚糖、以及麦芽糖，从提高低温下的测定以及试样中的乳酸浓度高时的测定灵敏度的观点考虑，更优选葡聚糖。如果是试剂层含有葡聚糖的形态的乳酸传感器，则在试样中的乳酸浓度高的情况下、或测定时的气氛温度低的情况下可以进一歩提高测定灵敏度，因此在冬季运动等领域的训练等中十分有用。葡聚糖没有特别限制，在一个或多个实施方式中，可以使用作为增稠剂使用的公知的葡聚糖。葡聚糖的分子量没有特别限制，在一个或多个实施方式中，为100 20000，从溶解性的方面考虑，优选为1000 20000。对于葡聚糖在每I片乳酸传感器中的含量，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，优选为0.1 10 ii g、0. 5 5. 0 ii g、或1. 0 g。而且，本说明书中所谓“低温下的測定”，在一个或多个实施方式中，是指使用乳酸传感器进行测定时的气氛温度的上限为10°C以下、或5°C以下，其下限为_5°C以上、(TC以上、或1°C以上。在所述试剂层中，从提高测定灵敏度的观点考虑，在一个或多个实施方式中，也可以还含有层状无机化合物、和/或表面活性剂等。作为层状无机化合物，可以使用以往或今后开发的生物传感器中所用的化合物，没有特别限制，然而从相同的观点考虑，优选具有离子交換能力的膨润性粘土矿物。在膨润性粘土矿物当中，从相同的观点考虑，优选膨润土、蒙脱石、蛭石、合成氟云母等，更优选合成水辉石或合成皂石等合成蒙脱石；合成氟云母等膨润性合成云母；Na型云母等合成云母(天然的云母通常是非膨润性的粘土矿物)等。这些层状无机化合物既可以単独使用，也可以并用2种以上。
作为所述表面活性剂，可以使用以往或今后开发的生物传感器中所用的材料，没有特别限制，然而可以适当地使用非离子性、阴离子性、阳离子性、两性的表面活性剂。它们当中，从提高测定灵敏度的观点考虑，优选两性表面活性剂。作为两性表面活性剂，在一个或多个实施方式中，可以举出羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、以及磷酸酯甜菜碱等，从相同的观点考虑，优选磺基甜菜碱。作为磺基甜菜碱，在一个或多个实施方式中，可以举出CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]丙磺酸)、CHAPSO(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐)、以及烷基羟基磺基甜菜碱等，从相同的方面考虑，优选CHAPS0所述试剂层既可以是包含全部的试剂的单层结构，也可以是多层的层叠结构。在一个或多个实施方式中，也可以是通过形成含有媒介体的第一试剂层、并在其上形成含有乳酸氧化酶以及ACES的第二试剂层而形成的构成的试剂层。另外，在媒介体并用了钌化合物和PMS的情况下，在一个或多个实施方式中，也可以是通过形成含有钌化合物的第一试 剂层、并在其上形成含有乳酸氧化酶、ACES以及PMS的第二试剂层而形成的构成的试剂层。在试剂层含有多糖类等糖的情况下，优选第二试剂层含有多糖类等糖。从保存稳定性的观点考虑，优选将乳酸传感器中的试剂层以干燥状态配置于电极系上。本公开的乳酸传感器的大小没有特别限制，可以根据所供给的试样的量等适当地设定，在一个或多个实施方式中，也可以是整体长度为5 50mm,整体宽度为I 50mm,最大厚度为2000 500 μ m,最小厚度为50 500 μ m。而且，所谓“长度”是指乳酸传感器的长边方向的长度，所谓“宽度”是指乳酸传感器的宽度方向的长度。本公开的乳酸传感器在一个或多个实施方式中，可以与具备以某个一定的时间施加给定的电压的单元、测定从乳酸传感器传递的电信号的单元、将所述电信号运算为测定对象物浓度的运算单元等各种单元的测定机器组合使用。[乳酸传感器的制造方法]本公开作为另一个其他的方式，涉及一种乳酸传感器的制造方法，其包括在配置有至少包括作用极和对电极的电极系的绝缘性基板的所述电极系上，形成含有乳酸氧化酶、媒介体、以及ACES的试剂层。根据本公开的制造方法，能够制造本公开的乳酸传感器。作为乳酸氧化酶、媒介体、以及ACES，可以使用与本公开的乳酸传感器相同的物质。在一个或多个实施方式中，试剂层可以通过将试剂液配置在电极系上而形成。对于试剂液中的ACES的含量，在一个或多个实施方式中，从缩短测定时间及提高测定灵敏度的方面考虑，例如为O.1 10重量％、或O. 5 5. O重量％。对于试剂液中的乳酸氧化酶的含量，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，例如为O. 5 10kU/mL、或I 5U/mL。在本公开的制造方法的其他的实施方式中，对于媒介体，从缩短测定时间及提高测定灵敏度的方面考虑，优选钌化合物、或者钌化合物与吩嗪硫酸甲酯或其衍生物的并用。对于试剂液中的钌化合物的含量，在一个或多个实施方式中，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，例如为1. O 15重量％、或5. O 10重量％。对于试剂液中的PMS的含量，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，例如为10 lOOOpmol、或100 500pmol。在本公开的制造方法的其他的实施方式中，对于所述试剂液，从制造提高了测定灵敏度的乳酸传感器的观点考虑，优选含有多糖类等糖，从制造提高了低温下的测定及试样中的乳酸浓度高时的测定灵敏度的乳酸传感器的观点考虑，更优选含有葡聚糖。作为葡聚糖可以使用与上述的本公开的乳酸传感器相同的物质。对于试剂液中的葡聚糖的含量，在一个或多个实施方式中，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，例如为0.01 I重量％、或O. 05 O.1重量％。在本公开的制造方法的其他的实施方式中，所述试剂也可以还包括层状无机化合物和/或表面活性剂。作为层状无机化合物及表面活性剂，在一个或多个实施方式中，可以使用与上述的本公开的乳酸传感器相同的物质。在本公开的制造方法的其他的实施方式中，所述试剂层的形成例如也可以通过如下操作来进行，即，在所述电极系上配置含有钌化合物的第一试剂液而形成第一试剂层，以及在所述第一试剂层上配置含有乳酸氧化酶、PMS、及ACES的第二试剂液而形成第二试剂层。该情况下，优选第一试剂液还含有层状无机化合物和/或表面活性剂，所述第二试剂液还含有多糖类等糖。对于第一试剂液中的钌化合物的含量，在一个或多个实施方式中，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，例如为O. 05 1. O重量％、或O.1 O. 5重量％。对于第二试剂液中的ACES的含量，在一个或多个实施方式中，从缩短测定时间及提高测定灵敏度的方面考虑，例如为O.1 10重量％、或O. 5 5. O重量％。对于第二试剂液中的PMS的含量，在一个或多个实施方式中，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，例如为10 lOOOpmol、或100 500pmol。对于第二试剂液中的乳酸氧化酶的含量，在一个或多个实施方式中，从生产性(成本)及检测灵敏度的观点考虑，例如为O. 5 10kU/mL、或I 5U/mL。[乳酸浓度的测定方法]本公开在其他的方式中，涉及一种乳酸浓度的测定方法，其包括使含有乳酸氧化酶及ACES的试剂与试样接触；以及借助媒介体电化学地测定所述试样中的乳酸与所述乳酸氧化酶的反应。根据本公开的乳酸浓度测定方法，由于可以缩短反应中所需的时间，因此能够实现短时间内的测定，优选即使在试样中的乳酸浓度高的情况下，也可以在短时间内精度优良地测定乳酸浓度。作为本公开的乳酸浓度测定方法的一个实施方式，可以举出使用了本公开的乳酸传感器的乳酸浓度测定方法。本说明书所谓“电化学地测定”，是指应用电化学的测定手法的测定，在一个或多个实施方式中，可以举出电流测定法、电位差测定法、电量分析法等，其中特别优选利用电流测定法来测定因对被还原了的电子传递物质施加电压而受到氧化时所产生的电流值的方法。本公开的乳酸浓度测定方法在其他的实施方式中，也可以包括在与所述试剂接触后对所述电极系施加电压、测定所述施加时所发出的响应电流值、以及基于所述响应电流值算出所述试样中的乳酸浓度。作为所施加的电压没有特别限制，然而在一个或多个实施方式中，优选为10 700mV、50 500mV、或100 400mV。本公开的乳酸浓度测定方法在其他的实施方式中，既可以在与所述试剂接触后以非施加的状态保持给定的时间后对电极系施加电压，也可以在与所述试剂接触的同时对电极系施加电压。作为以非施加的状态保持的时间，在一个或多个实施方式中，是超过O秒且在30秒以下、或超过O秒且在10秒以下。本公开的乳酸浓度测定方法中的对电极系的电压的施加、响应电流值的测定、以及乳酸浓度的算出可以使用以往或今后开发的乳酸浓度测定装置等恰当地进行。
[乳酸浓度测定系统]本公开作为另一个其他的方式，涉及一种用于测定试样中的乳酸浓度的乳酸浓度测定系统，包括本公开的乳酸传感器、对所述乳酸传感器的电极系施加电压的单元、和用于测定电极系中的电流的单元。根据本公开的乳酸浓度测定系统，由于使用本公开的乳酸传感器来测定试样中的乳酸浓度，因此可以缩短反应中所需的时间，从而可以实现短时间内的测定。本公开的乳酸浓度测定系统在一个或多个实施方式中，即使在试样中的乳酸浓度高的情况下或测定时的气氛温度是低温，也可以在短时间内精度优良地测定乳酸浓度。作为施加单元，只要与乳酸传感器的电极系导通，可以施加电压，就没有特别限制，可以使用公知的施加单元。作为施加单元，在一个或多个实施方式中，可以包括能够与乳酸传感器的电极系接触的触头、以及直流电源等电源等。测定单元是用于测定施加电压时产生的电极系中的电流的单元，在一个或多个实施方式中，只要是可以测定与从乳酸传感器的试剂层的媒介体中放出的电子的量相关的响应电流值的单元即可，可以使用以往或今后开发的乳酸传感器中所用的单元。对于本公开的乳酸传感器及制造方法的一个实施方式，基于图1及2进行说明。图1的A F是表示出制造本实施方式的乳酸传感器的一连串的工序的立体图。另外，图2是图1的F中所示的乳酸传感器的1-1方向剖面图。而且，在图1的A F及图2中，对于同一部位使用同一符号。但是，以下的说明只不过是一个例子而已，本公开当然并不限定于此。如图1的F及图2所示，乳酸传感器具备绝缘性基板11、由具有引线部12a的作用极12和具有引线部13a的对电极13构成的电极系、绝缘层14、第一试剂层16、第二试剂层17、具有开口部的间隔件18及具有贯穿孔20的外罩19。电极系形成于绝缘性基板11上。绝缘层14为电极系的上部，且形成于除去形成有电极系的引线部12a、13b及后述的第一试剂层16的部分以外的绝缘性基板11上。第一试剂层16及第二试剂层17在作用极12及对电极13上，依次形成于没有形成绝缘层14的部分。该形成有第一试剂层16及第二试剂层17的部分成为检测部15。间隔件18配置于绝缘层14上，与第二试剂层17及外罩19的贯穿孔20对应的部位成为开口部。外罩19配置于间隔件18上。如图1的B所示，在乳酸传感器中，属于间隔件18的开口部的空间部分并且由第二试剂层17及绝缘层14与外罩19夹持的空间部分成为毛细管结构的试样供给部21，外罩19的贯穿孔20成为用于将试样利用毛细管现象吸入的空气孔。作为绝缘层14的材质，在一个或多个实施方式中，可以举出绝缘性树脂。作为绝缘性树脂，在一个或多个实施方式中，可以举出聚酯、缩丁醛树脂、以及酚醛树脂等。作为间隔件18的材质，在一个或多个实施方式中，可以举出树脂薄膜或胶带等。作为外罩19的材质，没有特别限制，在一个或多个实施方式中，可以使用各种塑料等，优选为透明树脂，更优选为PET。第一试剂层16及第二试剂层17中所含的试剂的构成没有特别限定，然而在一个或多个实施方式中，也可以是如下的构成，即，第一试剂层16含有钌化合物以及层状无机化合物，第二试剂层17含有乳酸氧化酶、PMS、表面活性剂、以及ACES。本实施方式的乳酸传感器例如可以如下所示地制造。首先，如图1的A所示，准备形成有由具有引线部12a的作用极12和具有引线部13a的对电极13构成的电极系的绝缘性基板11。既可以使用形成有电极系的市售的绝缘性基板，也可以在绝缘性基板11中形成电极系。绝缘性基板的材质、电极的材质以及电极的形成方法如上所述。然后，如图1的B所示，在形成有电极系的绝缘基板11上形成绝缘层14。对于绝缘层14，在一个或多个实施方式中，可以通过将在溶剂中溶解了绝缘性树脂的绝缘糊剂印刷在绝缘性基板11上、然后进行加热或紫外线处理来形成。作为溶剂，在一个或多个实施方式中，可以举出卡必醇乙酸酯、二元酸酯系混合溶剂(DBE溶剂)等。然后，如图1的C及D所示，在没有形成绝缘层14的检测部15的电极系上以及绝缘性基板11上依次形成第一试剂层16及第二试剂层17。第一试剂层16及第二试剂层17可以通过分注包含各个层中所含有的试剂的试剂液、并使之干燥来形成。试剂液的浓度如上所述。然后，如图1的E及F所示，在绝缘层14上依次配置间隔件18及外罩19。对使用了本实施方式的乳酸传感器的乳酸的测定方法的一个例子进行说明。但是，以下的说明只不过是一个例子而已，本公开当然并不限定于此。首先，使全血试样接触乳酸传感器的试样供给部21的一端。该试样供给部21如前所述为毛细管结构，与其另一端对应的外罩19的开口部20为空气孔，因此所述试样因毛细管现象而被向乳酸传感器的内部抽吸。受到抽吸的试样向第二试剂层17渗透，将第二试剂层17中的乳酸氧化酶及ACES等溶解，继而到达作为第二试剂层17的下层的第一试剂层16表面。此后，到达表面的试样中的乳酸、乳酸氧化酶、PMS和钌化合物在ACES存在下发生反应。具体来说，作为测定对象物的乳酸被乳酸氧化酶氧化，因该氧化反应而移动了的电子经由PMS向钌化合物传递，形成还原型钌(II)络合物。此后，在还原了的还原型钌(II)络合物与位于第一试剂层16之下的电极系之间进行电子授受，由此就可以测定乳酸浓度。本发明可以涉及以下的一个或多个实施方式[I] 一种乳酸传感器，其具备绝缘性基板、配置于所述基板上的至少包含作用极和对电极的电极系、以及配置于所述电极系上的试剂层，所述试剂层含有乳酸氧化酶、媒介体、以及N-(2-乙酰胺基)-2_氨基乙磺酸。[2]如[I]所述的乳酸传感器，其中，所述试剂层还包含选自由寡糖及多糖类组成的组的糖。[3]如[2]所述的乳酸传感器，其中，所述糖为葡聚糖或麦芽糖，优选为葡聚糖。[4]如[I]至[3]中任一项所述的乳酸传感器，其中，所述试剂层还包含层状无机化合物和/或表面活性剂。[5]如[I]至[4]中任一项所述的乳酸传感器，其中，所述媒介体选自由铁氰化钾、细胞色素C、吡咯喹啉醌、NAD+、NADP+、铜络合物、钌化合物、以及吩嗪硫酸甲酯及其衍生物组成的组。[6]如[5]所述的乳酸传感器，其中，所述媒介体是钌化合物，或者，钌化合物和吩嗪硫酸甲酯或其衍生物。[7]如[5]或[6]所述的乳酸传感器，其中，所述吩嗪硫酸甲酯的衍生物是1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐。[8] 一种乳酸浓度的测定方法，其包括
使含有乳酸氧化酶、以及N-(2-乙酰胺基)-2_氨基乙磺酸的试剂与试样接触；以及借助媒介体电化学地测定所述试样中的乳酸与所述乳酸氧化酶的反应。[9]如[8]所述的测定方法，其中，所述试剂还包含选自由寡糖及多糖类组成的组的糖。[10]如[9]所述的测定方法，其中，所述糖为葡聚糖或麦芽糖，优选为葡聚糖。[11]如[8]至[10]中任一项所述的测定方法，其中，使用[I]至[7]中任一项所述的乳酸传感器来进行。[12]如[8]至[11]中任一项所述的测定方法，其中，包括在所述接触后对所述电极系施加电压、测定所述施加时发出的响应电流值、以及基于所述响应电流值算出所述试样中的乳酸浓度。 [13] 一种乳酸传感器的制造方法，其包括在配置有至少包含作用极和对电极的电极系的绝缘性基板的所述电极系上，形成含有乳酸氧化酶、媒介体、以及N-(2-乙酰胺基)-2_氨基乙磺酸的试剂层。[14]如[13]所述的制造方法，其中，所述试剂层还包含选自寡糖及多糖类中的糖。[15]如[14]所述的制造方法，其中，所述糖为葡聚糖或麦芽糖，优选为葡聚糖。[16] 一种用于测定试样中的乳酸浓度的乳酸浓度测定系统，其包括[I]至[7]中任一项所述的乳酸传感器、对所述乳酸传感器的电极系施加电压的单元、用于测定电极系的电流的单元。下面，使用实施例及比较例对本公开进行进一步说明。但是，本公开并不限定于以下的实施例地解释。实施例[实施例1]如下所示地制作出与图1所示的乳酸传感器相同的结构的实施例1的乳酸传感器。首先，作为乳酸传感器的绝缘性基板11，准备PET制基板(长50mm、宽6mm、厚250m)，在其一方的表面，利用丝网印刷，形成由分别具有引线部12a、13a的作用极12及对电极13构成的碳电极系。然后，如下所示地在电极系上形成绝缘层14。首先，以使浓度达到75重量％的方式将绝缘性树脂聚酯溶解于溶剂卡必醇乙酸酯中而制备绝缘性糊剂，将其丝网印刷到所述电极系上。印刷条件是300目丝网、刮刀压力40kg，印刷的量是每Icm2的电极面积中设为0.002mL。而且，在检测部15上和引线部12a、13a上，未进行丝网印刷。此后，通过将绝缘性糊剂在90°C下加热处理60分钟而形成绝缘层14。接下来，在未形成绝缘层14的检测部15中，如下所示地形成第一试剂层16。首先，制备出含有合成蒙脱石(商品名“Lucentite SWN”、C0_0PChemical公司制)O. 3重量％、钌化合物([仙(順3)6](13、同仁化学研究所公司制)6. O重量％、乙酸钠、以及琥珀酸的第一试剂液(PH7. 5)。将该第一试剂液1. O μ L分注到检测部15中。检测部15的表面积约为O.1cm2，检测部15中的作用极12及对电极13的表面积约为O. 12cm2。此后，将其在30°C下干燥，形成第一试剂层16。此外，在第一试剂层16上，形成第二试剂层17。首先，制备出含有乳酸氧化酶(商品名“LC0301”、束洋纺公司制)2U、1-甲氧基PMS(同仁化学研究所公司制)25重量％、ACES缓冲液(PH7.5)以及表面活性剂的第二试剂液。将该第二试剂液1. OyL分注到第一试剂层16上，在30°C下干燥而形成第二试剂层17。最后，将具有开口部的间隔件18配置在绝缘层14上，再在间隔件18上配置具有成为空气孔的贯穿孔20的外罩19而制作出实施例1的乳酸传感器。将由外罩19与绝缘层14夹持的间隔件18的开口部的空间设为试样供给部21。[比较例I 6]
作为比较例I 6，除了代替ACES而使用了下述表I中所示的缓冲剂以外，与实施例I相同地制作出乳酸传感器。使用实施例1及比较例I到6的乳酸传感器进行了试样中的乳酸的测定。作为试样使用了 2mmol/L乳酸调合液，测定装置使用了乳酸测定夹具。测定是通过如下操作来进行的，即，在设定为25°C的环境试验室内，在向乳酸传感器提供试样后，将样品检测后10秒设为不施加，在从10秒后到15秒后的5秒施加200mV的电压。将其结果表不于表I及图3的曲线图中。[表 I]
权利要求
1.一种乳酸传感器，具备绝缘性基板、配置于所述基板上的至少包括作用极和对电极的电极系、以及配置于所述电极系上的试剂层，所述试剂层含有乳酸氧化酶、媒介体、以及N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸。
2.如权利要求1所述的乳酸传感器，所述试剂层还包含选自由寡糖及多糖类组成的组的糖。
3.如权利要求2所述的乳酸传感器，所述糖为葡聚糖。
4.如权利要求1所述的乳酸传感器，所述试剂层还包含层状无机化合物和/或表面活性剂。
5.如权利要求1到4中任一项所述的乳酸传感器，所述媒介体选自由铁氰化钾、细胞色素C、吡咯喹啉醌、NAD+、NADP+、铜络合物、钌化合物、以及吩嗪硫酸甲酯及其衍生物组成的组。
6.如权利要求5所述的乳酸传感器，所述媒介体是钌化合物，或者，钌化合物与吩嗪硫酸甲酯或其衍生物。
7.如权利要求5所述的乳酸传感器，所述吩嗪硫酸甲酯的衍生物是1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯盐。
8.一种乳酸浓度的测定方法，包括使含有乳酸氧化酶、以及N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸的试剂与试样接触；以及借助媒介体电化学地测定所述试样中的乳酸与所述乳酸氧化酶的反应。
9.如权利要求8所述的测定方法，使用权利要求1到7中任一项所述的乳酸传感器来进行。
10.如权利要求9所述的测定方法，包括在所述接触后对所述电极系施加电压、测定所述施加时发出的响应电流值、以及基于所述响应电流值算出所述试样中的乳酸浓度。
11.一种乳酸传感器的制造方法，包括在配置有至少包括作用极和对电极的电极系的绝缘性基板的所述电极系上，形成含有乳酸氧化酶、媒介体、以及N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸的试剂层。
12.一种用于测定试样中的乳酸浓度的乳酸浓度测定系统，包括权利要求1到7中任一项所述的乳酸传感器、对所述乳酸传感器的电极系施加电压的单元、和用于测定电极系中的电流的单元。
全文摘要
本发明涉及一种乳酸传感器。具体地，本发明提供一种可以在短时间内精度优良地测定乳酸浓度的乳酸传感器。乳酸传感器具备绝缘性基板、配置于所述基板上的至少包括作用极和对电极的电极系、以及配置于所述电极系上的试剂层。试剂层含有乳酸氧化酶、媒介体、以及N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸。
文档编号G01N27/26GK103018291SQ201210377539
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者兼田悠, 山口武广 申请人:爱科来株式会社
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