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中药肝炎灵注射液及其原料药材的指纹图谱检测方法
【专利摘要】本发明公开了中药肝炎灵注射液及其原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，该方法包括供试品溶液的制备、对照指纹图谱的建立和供试液指纹图谱的测定。本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的中药肝炎灵注射液及其原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价肝炎灵注射液的质量，可以为肝炎灵注射液从源头上保证原料药材的安全，有效，为保证临床疗效具有重要意义。
【专利说明】检测和评价肝炎灵注射液质量的指纹图谱
匕术的不足，提供一种肝炎灵注射液及其原笔观、全面、准确的评价肝炎灵注射液的质量和保证临床疗效具有重要意义。
曼明采取的技术方案为:
&，包括以下步骤:
I稀释后，用微孔滤膜滤过，得到供试品溶
的对照指纹图谱:取10批以上肝炎灵注射(肝炎灵注射液的指纹图谱，以这些指纹图肝炎灵注射液对照指纹图谱；
I纹图谱:取步骤(1)肝炎灵注射液供试品品溶液的指纹图谱；:图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相相:体积比为4:1的0.2%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃，柱温30°C，检测波长为205nm。
[0014]本发明提供的中药肝炎灵注射液原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，包括以下步骤:
[0015](I)供试品溶液制备:取山豆根药材进行适当处理，得到供试品溶液；
[0016](2)高效液相色谱法测定山豆根药材的对照指纹图谱:取10批以上山豆根药材供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次山豆根药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为山豆根药材对照指纹图谱；
[0017](3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱:将待测山豆根药材供试品溶液按步骤(4)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
[0018](4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
[0019]以上所述的中药肝炎灵注射液原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，步骤(1)所述的供试品溶液制备方法为:取山豆根药材粉末(过三号筛)0.5g，置圆底烧瓶中，精密加水50ml，称定重量，置电热套中加热煮沸4小时，放冷，用水补足减失的重量，用滤纸滤过后，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，即得。
[0020]以上所述的中药肝炎灵注射液原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，步骤(2)和步骤(3)所述的色谱条件为:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为4:1的0.2%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃为流动相，柱温30~40°C，检测波长为200~220nm。
[0021]作为优选方案，以上所述的`中药肝炎灵注射液原料药材山豆根的指纹图谱检
测方法，步骤(2 )和步骤(3 )所述的色谱条件为:以规格为5 μ m，SUPELCO Discovcry^
25cmX4.6mm为色谱柱，以体积比为4:1的0.2%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃为流动相，柱温30°C，检测波长为205nm。
[0022]本发明所述的中药肝炎灵注射液指纹图谱检测方法在评价肝炎灵注射液成品质量中的应用。
[0023]本发明所述的中药肝炎灵注射液原料药材指纹图谱检测方法在评价肝炎灵注射液原料药材质量中的应用。
[0024]本发明将供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度评价软件(选用中国药典委推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004A版”)计算，获得指纹图谱相似度数值，依据相似度数值，应用于肝炎灵注射液的质量控制，以指纹图谱相似度应大于
0.90为检验质控标准；应用于肝炎灵注射液原料药材山豆根的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.85为检验质控标准。本发明提供的肝炎灵注射液及其原料药材的指纹图谱检测方法用于生产检验质量控制，所得产品具有较高的质量稳定性，可确保产品安全有效。
[0025]采用本发明优选方案提供的中药肝炎灵注射液指纹图谱检测方法检测出有4个共有峰，以3号峰为标记，有明显的吸收峰，为苦参碱化合物，可作为标准参照物。
[0026]采用本发明优选方案提供的中药肝炎灵注射液原料药材山豆根指纹图谱检测方法检测出有5个共有峰，以3号峰为标记，有明显的吸收峰，为苦参碱化合物，可作为标准参照物。
[0027]本发明提供的肝炎灵注射液原料药材的指纹图谱检测方法，选择与肝炎灵注射液指纹图谱测定方法相同的检测条件进行药材指纹图谱考察，便于更好的考察药材指纹图谱与制剂指纹图谱的相关性，也有利于比较各药材产地的差异，为保证肝炎灵注射液的安全稳定的原料药材来源提供保证。
[0028]本发明提供的肝炎灵注射液及其原料药材指纹图谱检测方法的最佳条件筛选过程:
[0029]1、仪器与试剂
[0030]仪器:AgilentllOO液相色谱仪。
[0031]试剂:乙腈、四氢呋喃，色谱纯；其他试剂均为分析纯。
[0032]对照品:苦参碱、氧化苦参碱，由中国药品生物制品检定所提供。
[0033]2、流动相种类的筛选
[0034]①乙腈-无水乙醇-水(80:10:10，磷酸调ρΗ2.0)；
[0035]②乙腈-0.2mol/L 磷酸二氢钠(23:77)；
[0036]③甲醇-水-三乙胺(50:50:0.05);
[0037]④甲醇-水-三乙胺(50:50:0.2);
[0038]⑤乙腈-0.0257mol/L 硫酸铵-SDS (40:60:0.6)硫酸调 ρΗ3.0
[0039]⑥0.2%十二烷基硫酸钠(10%磷酸调ρΗ3.0)-四氢呋喃(4:1)
[0040]采用上述流动相进行测定，其中①、②、③需在氨基柱上进行测定，虽可取得较好的分离效果，但保留时间不稳定，经软件计算，相似度结果不理想、⑤的流动相为文献报道测定苦参碱含量的方法，经试验，分离效果不理想，不能将山豆根中的生物碱类成分分离完全，影响监测的准确性，并不适合用于建立指纹图谱。因此，本发明通过大量实验反复摸索流动相组成，最终确定⑥0.2%十二烷基硫酸钠(10%磷酸调ρΗ3.0)-四氢呋喃(4:1)为流动相，采用该流动相组成，各色谱峰分离很好，保留时间适宜，达到指纹图谱信息最大化原则，且重现性合稳定性优。
[0041]3、检测波长的选择
[0042]苦参碱对照品溶液在200?400nm波长范围内无明显吸收峰，经对比实验表明，在205?220nm处，尤其是在205nm处，肝炎灵注射液各成分具有明显的吸收峰，因此，本发明优选205nm作为测定波长，可得到理想的色谱图。
[0043]4、柱温的选择
[0044]本发明分别在25°C、30°C、35°C和40°C柱温下分析肝炎灵注射液，对比各柱温下的色谱图，实验结果表明，在30-40°C柱温条件下，色谱峰能够分离，在30°C柱温条件下，色谱峰分离情况最好，柱压也较低，因此，将30°C为最佳柱温条件。
[0045]5、色谱柱的选择
[0046]本发明通过大量实验筛选了不同的色谱柱，采用以下型号的色谱柱进行测定:
[0047]①氨基柱:1nertsilNH25u250mmX4.6mmCat #:22871SN:3K150166
[0048]②Alltech C18 柱，5 μ m，4.6mmX 250mm
[0049]③SUPELCO Discovery 6: 25cmX 4.6mm，5 μ m，Col: 50497154938-02
[0050]④CAPCELL PAK C18M.G5u250mmX4.6mmCat.No:90104Col.N0.03169
[0051 ]⑤ Agilent Z0RBAX*80A Extend — C184.6X250mm5uPN:770450-902SN:USHR003183[0052]⑥SUPELCO Discovcry ^ 25cmX 4.6mm, 5 μ m, Col: 50497163280-05
[0053]⑦SUPELCO Discovery?: 25cmX4.6mm，5 μ m，Col: 50497163486-01
[0054]因本品有效成分为生物碱类成分，文献报道可采用氨基柱测定其含量。经实验，氨基柱虽然可取得较好的分离效果，但保留时间不稳定，造成指纹图谱相似度不理想，因此不能建立良好的指纹图谱来检测肝炎灵注射液及其原料药材的质量。本发明通过大量实验筛选，确定采用C18柱进行分离。共考察了四种不同厂家的6根C18色谱柱的分离效果，除其中②、④的分离效果不理想外，另四根色谱柱均可将样品达到基线分离。经色谱图比较，优选
米用SUPELCO Discovcry pl 25cmX4.6mm, 5 μ m柱作为本品指纹图谱的分析柱,各色谱峰分离
良好，重现性和稳定性好，可以建立稳定的指纹图谱。
[0055]6、指纹图谱的精密度与稳定性考察
[0056]取同一肝炎灵注射液供试品溶液，在24小时内进样6次，以第一次分析所得指纹图谱为对照，其余5次分析所得指纹图谱的相似度计算结果分别为:1.000、1.000,0.999、
1.000、1.000、1.000，采用以上优选的色谱条件分析，制备得到的指纹图谱的精密度与稳定性优。
[0057]7、重现性考察
[0058]取同一批肝炎灵注射液6支，采用以上优选的色谱条件分析，以其中一次分析所得指纹图谱为对照，则其它5次分析所得指纹图谱与其相似度分别为:0.992,0.996，0.993，0.997，0.995 ;表明采用本发明优选得到的色谱条件的指纹图谱分析方法，具有良好的重现性。
[0059]经过上述大量实验筛选，本发明优选得到的最佳色谱条件为:以规格为5 μ m,SUPELCO Discovcry R 25cmX4.6mm为色谱柱，以体积比为4:1的0.2%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃为流动相，柱温30°C，检测波长为205nm。
[0060]有益效果:本发明提供的中药肝炎灵注射液及其原料药材的指纹图谱检测方法具有以下优点:
[0061]1、本发明针对现有技术检测方法的诸多不足，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的检测方法，可建立良好的指纹图谱。采用本发明提供的中药肝炎灵注射液指纹图谱检测方法，可以同时检测中药肝炎灵注射液中的多种活性成分，从而可以全面、客观、准确的检测和评价肝炎灵注射液的质量，为保证临床疗效具有重要意义。
[0062]2、本发明提供的山豆根指纹图谱检测方法，能够准确测定和评价山豆根药材的质量，为肝炎灵注射液从源头上保证原料药材的安全，有效，把好质量关具有重要的意义。
【专利附图】

【附图说明】 [0063]图1为肝炎灵注射液对照指纹图谱。
[0064]图2为肝炎灵注射液供试品指纹图谱。
[0065]图3为山豆根药材对照指纹图谱。
[0066]图4为山豆根药材供试品指纹图谱。【具体实施方式】
[0067]下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0068]实施例1肝炎灵注射液对照指纹图谱的建立及应用
[0069]1、中药肝炎灵注射液的指纹图谱检测方法，包括以下步骤:
[0070](I)供试品溶液制备方法:精密量取肝炎灵注射液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，即得。
[0071](2)高效液相色谱法测定肝炎灵注射液的对照指纹图谱:取13批肝炎灵注射液供试品按下列色谱条件测得各批次肝炎灵注射液的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为肝炎灵注射液对照指纹图谱。指纹图谱中共检测到4个共有指纹峰，具体保留时间(min)分别为I号峰:16.74min、2号峰:28.3min、3号峰:29.9min、4号峰:32.9min。对照指纹图谱如图1所示。
[0072]色谱条件为:以规格为5 μ m, SUPELCO Discovcry 25cmX 4.6mm为色谱柱，以体积
比为4:1的0.2%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃为流动相，柱温30°C，检测波长为205nm。
[0073](3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱:取13批按步骤(1)所得的肝炎灵注射液供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱，如图2所
/Jn ο
[0074](4)将步骤(3)得到的供试`品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。具体实验结果如表1所示:
[0075]表1肝炎灵注射液样品及相似度评价结果
[0076]
【权利要求】
1.中药肝炎灵注射液的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)供试品溶液制备:将肝炎灵注射液稀释后，用微孔滤膜滤过，得到供试品溶液； (2)高效液相色谱法测定肝炎灵注射液的对照指纹图谱:取10批以上肝炎灵注射液供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次肝炎灵注射液的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为肝炎灵注射液对照指纹图谱； (3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱:取步骤(1)肝炎灵注射液供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱； (4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
2.根据权利要求1所述的中药肝炎灵注射液的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(4)中用相似度软件评价4个共有指纹峰，具体保留时间分别为I号峰:16.74min、2号峰:28.3min、3 号峰:29.9min、4 号峰:32.9min,且相似度大于 0.9。
3.根据权利要求1所述的中药肝炎灵注射液的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(I)中供试品溶液制备方法为:精密量取肝炎灵注射液I~2ml，置50~100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μ m的微孔滤膜滤过，即得。
4.根据权利要求3所述的中药肝炎灵注射液的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(1)中供试品溶液制备方法为:精密量取肝炎灵注射液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μ m的微孔滤膜滤过，即得。
5.根据权利要求1所述的中药肝炎灵注射液的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)中色谱条件为:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相:体积比为4:1的0.2%~01%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃，柱温为30~40°C，检测波长为200~220nm。
6.根据权利要求5所述的中药肝炎灵注射液的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)中色谱条件为:以规格为5μηι,SUPELCO Discovcryfi 25cmX4.6mm为色谱柱,流动相:体积比为4:1的0.2%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃，柱温30°C，检测波长为205nm。
7.中药肝炎灵注射液原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)供试品溶液制备:取山豆根药材进行适当处理，得到供试品溶液； (2)高效液相色谱法测定山豆根药材的对照指纹图谱:取10批以上山豆根药材供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次山豆根药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为山豆根药材对照指纹图谱； (3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱:取步骤(1)山豆根药材供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱； (4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
8.根据权利要求7所述的中药肝炎灵注射液原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(1)中供试品溶液制备方法为:取山豆根药材粉末0.5~lg，置圆底烧瓶中，精密加水50~100ml，称定重量，置电热套中加热煮沸I~4小时，放冷，用水补足减失的重量，用滤纸滤过后，再用0.45 μ m微孔滤膜滤过，即得。
9.根据权利要求7所述的中药肝炎灵注射液原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)中色谱条件为:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相:体积比为4:1的0.2~1%%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃，柱温30~40°C，检测波长为200~220nm。
10.根据权利要求7所述的中药肝炎灵注射液原料药材山豆根的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)中色谱条件为:以规格为5 μ m，SUPELCO Discovery; 25cmX4.6mm为色谱柱，流动相:体积比为4:1的0.2%十二烷基硫酸钠:四氢呋喃，柱温30°C，检测波长为205nmo
【文档编号】G01N30/02GK103837619SQ201410104187
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】顾治平, 王恒斌, 陈力建 申请人:常熟雷允上制药有限公司