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专利名称：G蛋白偶联受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及G蛋白偶联受体GPR39的功能特征，并涉及改变或 调节GPR39蛋白活性的化合物。具体地说，本发明涉及GPR39激动 剂或拮抗剂的筛选方法，以便鉴定调节胃肠动力的激动剂或拮抗剂， 并涉及这些化合物的治疗用途。在另一个实施方案中，本发明涉及 GPR39与代谢稳态的关联，特别是与在GPR39敲除小鼠中观察到的 胆固醇水平的关联。本发明还涉及携带GPR39基因突变的转基因动 物。
背景技术：
GTP结合蛋白(G蛋白)在配体(如激素和其它化学介导物)和G蛋 白偶联受体(GPCR)的结合与胞内效应物活化之间充当中间体。在配 体与GPCR结合时，受体的胞质结构域经历构象变化，这种变化能 使受体与G蛋白相互作用，此相互作用又能活化胞内中间体如腺苷 酸环化酶、磷脂酶C或离子通道。这样的系统允许放大原始信号， 因为许多第二信使可响应单个配体在GPCR处的结合而产生。通过 该机制，细胞能够感应其外部环境中的改变并对此改变有响应。
G蛋白偶联受体形成了一个细胞质膜内在蛋白超家族，每个受 体都共有7个疏水跨膜结构域的相同特征，这些疏水跨膜结构域每 个都为20-30个氨基酸长，通过不同长度的亲水氨基酸序列连接。所 述受体的氨基末端处于胞外，羧基末端存在于细胞的胞质中。
GPCR广泛存在于各种组织和细胞类型中，参与许多不同的生 理过程。它们由各种各样的配体活化，所述配体例如为激素，诸如 促黄体生成激素、促卵泡激素、绒膜促性腺激素、促曱状腺激素、
促肾上腺皮质激素、胰高血糖素和血管加压素；神经递质，诸如5-HT、 乙酰胆碱(毒蕈碱AchR)、组胺、前列腺素、降4丐素、白三烯和Ca2+。 GPCR的广泛分布和广为不同的作用表明，GPCR可在多种病理病症 中起重要作用。实际上，业已发现GPCR涉及与支气管收缩、高血 压、炎症、激素紊乱、糖尿病、凋亡、伤害感受、神经传递易化和 震颤疾病相关的疾病。
在G蛋白偶联受体超家族中，其天然配体未知的推定GPCR称 为"孤儿受体，，。业已证实，G蛋白偶联受体是有价值的药物l巴， 因为它们是约占50%的市售药物的标靶。因此，正在评价许多孤儿 GPCR,以鉴定新的潜在耙。
鉴定GPR39的基础是与生长激素促分泌素受体(GHS-R)与神经 降压素受体1和2 (NT-R1和NT-R2)的序列相似性(McKee等，1997)。 预测的453个氨基酸的GRP39蛋白包含GPCR特有的7个跨膜结构 域。通过GPR39与其它GPCR进行序列比较，McKee等(1997)发现， GPR39的蛋白序列与GSHR、 MTLR1 (促胃动素受体)和神经降压素 受体-1的蛋白序列分别有27%、 29%和32%相同。RNA印迹分析揭 示，GPR39具有广泛的组织分布。在测试的大部分脑区域中检测到 1.8-2 kb的一种杂交mRNA转录物。但是，除了该物质以外，在几 个外周组织如胃和小肠中以及在诸如胰腺、曱状腺和结肠等组织中 观察到3 kb长的替代转录物，此3-kb物质是检测到的唯一转录物 (McKee等，1997)。根据原位杂交中的荧光，McKee等人(199"将 GPR39基因作图至2q21-q22。TM3中的酸性残基对结构不相似的GHS 结合和活化GHS-R是必需的，该酸性残基在GPR39中是保守的。
根据这些组织分布研究，已猜测GPR39涉及心血管疾病 (WO2001/081634和WO200機4279);癌症，特别是脑癌，例如成 胶质细胞瘤(W02001/036685和WO01042288);炎症和神经疾病(US 2003/232769和WO2004/004279)以及涉及胃肠和肝脏疾病 (WO2004/004279)。不过，在所提及的参考文献中还没有一个提供基
于GPR39的配体鉴定的功能特征。由于所述原因，目前的GPR39功 能解读是有疑问的，需要进一步研究来确定GPR39的配体结合和功 能特性。
已知GPR39的广泛组织分布和大部分G蛋白偶联受体在广泛不 同的细胞和生理过程中起重要作用的事实，人们应有兴趣获取对该 载体的正常生理作用的理解。
发明概述
如上所述，本发明涉及GPR39受体新功能的鉴定。如在下文的 实施例中所述，哺乳动物中的GPR39突变影响胃排空，表明GPR39 为胃肠动力调节中的关键要素。已知GPR39基因下调导致胃排空增 加的事实，预期GPR39表达的增加将减弱胃排空。该发现为通过调 节GPR39活性来调节胃肠动力的新治疗方法提供了一条途径。该发 现还为研究胃肠动力学和涉及胃肠动力障碍的疾病提供了新的模型
筛选方法。
除了以上所述之外，GPR39敲除小鼠的表型还揭示了该受体与 胆固醇代谢的关联。下调GPR39基因导致胆固醇水平升高。因此， 预期GPR39涉及具有过量胆固醇水平的病症，例如代谢综合征，包 括肥胖症、糖尿病、肥胖相关性心血管疾病和青光眼。
因此，本发明的第一方面提供全部GPR39蛋白或部分GPR39 蛋白在化合物鉴定方法中的用途，所述化合物调节胃肠动力，或有 效预防和/或治疗与胃肠动力障碍相关的病状。又一方面，本发明提 供全部GPR39蛋白或部分GPR39蛋白在化合物鉴定方法中的用途， 所述化合物调节胆固醇形成，或有效预防和/或治疗与过量胆固醇形 成相关的病状。或者，本发明提供表达全部GPR39蛋白或部分GPR39 蛋白的细胞在该方法中的用途。在一个具体实施方案中，GPR39是 一种分离蛋白，其具有的氨基酸序列选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:
4、具有上述SEQ ID的蛋白的剪接变体和与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少50%、优选至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的氨基酸序列。
上文使用的部分GPR39蛋白意指包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的多肽的片段，所述片段的大小为至少10个氨基酸，例如至 少20、 30、 40、 50、 75、 100或150个或更多个氨基酸。这样的片 段可分别来源于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的N-端区。含N-端 区的片段可用于重构受体的胞外部分，以提供受体结合位点。优选 地，所述片段保留结合腺噤呤的能力。
本发明还提供编码全部或部分的SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4 的多肽的分离核酸序列在化合物鉴定方法中的用途，所述化合物调 节胃肠动力，或有效预防和/或治疗与胃肠动力障碍相关的病状和与 高水平胆固醇相关的疾�。�例如代谢综合征，包括糖尿病和心血管 疾病。本发明方法中所使用的核酸序列意指包括由SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 3组成的分离的核酸序列，以及与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的核酸序列具有至少50%、优选至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的核酸序列。
本发明的核酸还包括所含序列与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3 的核酸序列或其互补序列具有至少50%、优选至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的核酸。优选地，这些序列在受控以最 小化非特异性结合的条件下与对应核酸杂交。优选地，最好为严格 至中等严格的杂交条件。例如，为检测约80-90%相同的序列，适宜 的条件包括于42。C在0.25 M Na^HPC^ pH 7.2、 6.5% SDS、 10%硫酸 葡聚糖中过夜杂交，在0.1xSSC、 0.1%SDS中于55。C最终洗涤。为 检测约90%以上相同的序列，适宜的条件包括于6S。C在0.25 M Na^HP04 pH 7.2、 6.5% SDS、 10%硫酸葡聚糖中过夜杂交，在0.1 x SSC、 0.1%SDS中于6(TC最终洗涤。
需要认识到的是，这样的核酸不一定编码"全长"多肽，因此
包括代表例如突变形式的GPR39基因的核酸，在突变形式的GPR39 基因中，编码序列已通过产生终止密码子的置换或移码突变而过早 终止。这些核酸也是本发明的核酸。
本发明还提供为本发明多肽编码核酸片段的核酸的用途。在一 个方面，本发明提供核酸引物，其基本上由本发明多肽编码序列或 其互补序列的15-50核苷酸组成，例如由15-35、 18-35、 15-24、 18-30、 18-21或21-24个核苷酸组成。
从治疗上讲，本发明的核酸和多肽均可用于治疗疾病。具体地 说，它们可用于治疗其病状与GPR39受体方面的作用相关的疾�。� 特别是那些与预防和/或治疗与胃肠动力障碍相关的病状和与胆固醇 水平升高相关的疾病(例如代谢综合征)相关的疾病。
又一方面，提供含所述核酸序列的载体，特别是含有与本发明 核酸序列有效连接的启动子的表达载体。所述载体可由宿主细胞携 带，并在所述细胞中表达。在所述表达之后，所述细胞可用于本发 明的方法。
如上所述，提供鉴定化合物(下文亦称药剂)的测定方法是本发明 的一个目的，所述化合物结合本发明多肽或调节本发明多肽的活性。 具体地说，设想这样的化合物为任意大小的有机或无机原子集合体， 包括小分子(小于约2500道尔顿)或4交大分子，例如肽、多肽、完整 蛋白和多核苷酸，其中所述化合物可用于如上所述的治疗方法。
由于本发明的发明人首先鉴定出为受体的GPR39是胃肠动力调 节中的关键要素，所以本发明揭示了在治疗应用中使用GPR39本身 和/或激动或拮抗该受体的化合物的可能性。因此，本发明进一步扩 展至治疗人或动物体的方法，所述方法包括GPR39激动剂或拮抗剂 的用途。特别是与延迟胃排空相关的疾病的治疗方法，所述疾病例 如为胃轻瘫术后肠梗阻、糖尿病性胃轻瘫、机能性消化不良、迷走 神经切断术后胃轻瘫、慢传输型便秘、便秘型IBS、混合型IBS和特 发性假性肠梗阻。所述方法包括给予人或动物治疗活性剂量的GPR39
受体拮抗剂，特别是包括使用本发明方法可筌定的GPR39拮抗剂的 用途。
提供与胃排空增加相关的疾病的治疗方法也是本发明的 一 个目 的，所述疾病例如为倾倒综合征或肠能动性增强，例如腹泻、腹泻 型BBS和混合型IBS，所述方法包括给予人或动物治疗活性剂量的 GPR39受体激动剂，特别是包括使用本发明方法可鉴定的GPR39激 动剂的用途。
另外，基于所观察到的下调GPR39受体对胆固醇稳态的影响， 又一方面，本发明揭示了在针对胆固醇稳态缺陷的治疗应用中使用 GPR39本身和/或激动或拮抗该受体的化合物的可能性。因此，本发 明还扩展至治疗人或动物体的方法，所述方法包括使用GPR39激动 剂或拮抗剂治疗与胆固醇稳态缺陷相关的疾病。具体地说，GPR39 激动剂用于治疗与过量皮质醇形成相关的疾病，例如代谢综合征， 包括肥胖症、糖尿病和心血管疾�。�如与高水平胆固醇相关的动脉 粥样硬化。
本文更详细地描述了本发明的这些方面和其它方面。 序列描述
SEQ ID NO: 1是小鼠GPR39的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 2是小鼠GPR39的絲酸序列。
SEQ ID NO: 3是人GPR39的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 4是人GPR39的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 5是GPR39正向引物。
SEQ ID NO: 6是GPR39反向引物。
SEQ ID NO: 7是GPR39 4笨针序列。
SEQ ID NO: 8是人肥胖抑制素(obestatin)。
SEQ ID NO: 9是猴肥胖抑制素。
SEQ ID NO: 10是小鼠肥胖抑制素。
SEQ ID NO: SEQIDNO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
ll是大鼠肥胖抑制素。
12是沙鼠肥胖抑制素。
13是猪肥胖抑制素。
14是猫肥胖抑制素。
15是狗肥胖抑制素。
16是山羊肥胖抑制素。
17是绵羊肥胖抑制素。
18是牛肥胖抑制素。
19是肥胖抑制素的共有序列
附图简述


图1A:来源于野生型小鼠的组织中的GPR39的实时定量逆转 录PCR。
图1B:来源于野生型小鼠以及杂合和纯合GPF39敲除小鼠的4 种不同组织中的GPR39的实时定量逆转录PCR。
图2:GPCR39敲除小鼠对野生型小鼠的胃排空的半排空时间(~2) (A)和T^(B)的对比。
图3:野生型小鼠(A)对GPCR39敲除小鼠(B)的粪粒推进对比。 计算在总结肠长度15W的划分区(bin)中的粪粒分布，计数20分钟时 间间隔内由各个划分区排出的粪粒数。
图4:对于幼龄小鼠(17周，11 = 6)和老龄小鼠(56周，n-6),未 禁食小鼠(A)对禁食(19小时)小鼠(B)的累积食物摄取的比较。
图5:显示了 11个哺乳动物物种的前胃促生长素原(preproghrelin) 的氨基酸序列，其具有信号肽(斜体)、成熟胃促生长素(阴影)和侧翼 的肥胖抑制素(下划线)。代表推定的转化酶切割位点的共有碱性残基 用黑色背景上的白色字母表示。在共有序列中，完全保守的各个残 基以大写字母显示。各个胃促生长素(ghrelin)基因的GenBank (gi)号 为37183224 (人)、34541890 (猴)、19224664 (小鼠)、11067387 (大鼠)、
27357900 (沙鼠)、47523230 (猪)、52782813 (猫)、50978704 (狗)、 52782814 (山羊)、57526202 (绵羊)和27806613 (牛)。
发明详述 核酸
如本发明方法所使用的核酸包括DNA (基因组DNA和cDNA均 包括在内)和RNA。在本发明核酸包括RNA的情况下，所提及的在 所附序列表中显示的序列，应被理解为指U替代T的等同RNA。
本发明的核酸可为单链或双链的。本发明的单链核酸包括反义 核酸。因此，要理解的是，提及的SEQIDNO: 1或含SEQIDNO: 1 的序列或其片段包括互补序列，除非内容明显有矛盾。这同样适用 于SEQIDNO:3。
一般来说，本发明的核酸作为分离物提供，以分离和/或纯化形 式提供，或者不含或基本上不含与其天然结合的物质，例如除了可 能有一个或多个用于表达的调节序列以外，不含或基本上不含在人 类基因组中侧接所迷基因的核酸。核酸可为全合成的或部分合成的， 可包括基因组DNA、 cDNA或RNA。
本发明还提供为本发明多肽编码核酸的片段的核酸。在一个方 面，本发明4是供核酸引物，其基本上由编码本发明多肽的序列或其 互补序列的15-50个核苷酸组成,例如由15-35、 18-35、 15-24、 18-30、 18-21或21-24个核苦酸组成。
术语"基本上由……组成"是指不包含任何附加的5'或3'核酸 序列的核酸。但是，在本发明的另一方面，如上定义基本上由15-30 个核苷酸组成的本发明核酸可以3'末端但优选5'末端连接至其天然 不连接的短(例如4-15个核苷酸，如4-10个核苷酸)附加序列。这样 的附加序列优选为含限制酶识别位点的接头，以便于在本发明核酸 用作例如PCR引物时进行克隆。
本发明引物能够与编码本发明多肽的核酸选择性杂交。所述"选
择性的"是指对编码其它嘌呤受体的序列是选择性的，特别是对腺 噤呤受体以外的受体是选择性的。序列选择性杂交的能力可通过实 验确定或计算得出。
例如， 一种计算引物Tm的方法参考了计算针对同源靶序列的 引物Tm的公式。该公式为Tm (°C) = 2 (A + T) + 4 (G + C)-5。这将 提供在3xSSC和0.1。/。SDS(其中SSC为0.15MNaCl、 0.015M々宁檬 酸钠，pH 7)条件下的Tm。该公式一般适合于长度达约50个核苷酸 的引物。在本发明中，该公式可作为一种算法用于计算来源于本发 明多肽编码序列的指定序列的引物的标称Tm。可基于对这些其它序 列的任意部分的最大匹配数，将此Tm与计算出来的人和大鼠GPCR 序列的Tm对比。
引物与靶序列杂交的适宜条件还可经实验测得。合适的实验条 件包括在低严格杂交条件(例如6xSSC、 "。C)下候选引物与编码本 发明多肽的核酸和编码固体支持体上的其它腺噤呤受体的核酸均杂 交，于降低的SSC和/或升高的温度洗涤，例如在0.2xSSC、 45'C下，
并逐渐升高杂交温度，以测定允许引物与编码本发明多肽的核酸杂 交但不与其它编码嘌呤受体的核酸杂交的杂交条件。
本发明的核酸，尤其是引物，可携带显示标记。合适的标记包 括放射性同位素(例如32P或35S)、荧光标记、酶标记或其它蛋白标记 (例如生物素)。这样的标记可加入到本发明的多核苷酸或引物中，并 可通过自身已知的技术进行检测。
本发明的引物可包含合成核酸，例如具有用于提升细胞中的核 酸稳定性的修饰主链结构的核酸。本领域已知许多不同类型的针对 寡核苷酸的修饰。这些修饰包括曱基磷酸酯和硫代磷酸酯主链、在 分子的3'和/或5'末端加入吖啶或聚赖氨酸链。对本发明而言，需要 理解的是，本文描述的多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法修 饰。可实施这样的^"饰，以便增强本发明多核苷酸的体内活性或有 效期限。
本发明范围内也包括基于本文描述的核酸序列的反义序列，优 选为寡核香酸(尤其是稳定的寡核苷酸)形式或核酶形式。
反义寡核普酸可设计用于与核酸、前mRNA或成熟mRNA的互 补序列杂交，干扰由给定靶DNA序列编码的多肽的生产，使得其表 达被降4氐或完全阻止。核酶设计用于裂解由编码GPR39 GPCR的本 发明核酸序列编码的mRNA,针对GPR39 GPCR特异性的靶序列裂 解，即针对与其它GPCR序列不共有的序列裂解。反义序列的构建 及其应用描述于Peyman和Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol" 32:329-376, (1992),以 及Zamecnik和Stephenson, P.N.A.S， 75:280-284， (1974)。核酶的构建 及其应用描述于例长口 Gibson和Shillitoe, Molecular Biotechnology 7(2): 125-137, (1997)。
在一个实施方案中，可使用双链(dsRNA) (Fire等，Nature 391: 806-811, 1998)或短干扰RNA (siRNA)序歹寸(Yu等，Proc Natl Acad Sci USA. 99:6047-52, 2002)，将本发明的RNA用于诱导RNA干扰 (RNAi)。 "RNAi"是dsRNA借助其i秀导互补mRNA的同源性依赖 性降解的过程。在一个实施方案中，本发明的核酸分子通过与本发 明的"有义"核糖核酸互补碱基配对进行杂交，形成双链RNA。提 供dsRNA反义和有义核酸分子，它们对应于至少约20、 25、 50、 100、 250或500个核普酸或GPR39编码链，或Y又对应于其一部分。在一 个替代实施方案中，siRNA长度为30个核苷酸以下，更优选21-23 个核苷酸，具有特征性的2-3个核苷酸的3'突出端，该突出端通过核 糖核酸酶III剪切由较长dsRNA产生。参见例如Tuschl T. (Nat Biotechnol. 20:446-48, 2002)。
小RNA分子的胞内转录可通过将siRNA模板克隆到RNA聚合 酶III (Pol m)转录单位中实现，所述转录单位一般编码小核RNA (snRNA) U6或人RNA酶P RNA HI 。可使用两种方法表达siRNA: 在一个实施方案中，组成siRNA双链体的有义和反义链由单独的启
动子转录(Lee等，Nat. Biotechnol. 20， 500-505, 2002);在一个备选实 施方案中，siRNA以茎-环发夹RNA结构表达，所述发夹结构在胞 内加工后产生siRNA (Brummelkamp等，Science 296:550-553, 2002) (在此引用作为参考)。
dsRNA/siRNA最通常如下施用体外退火有义和反义RNA链， 然后给予生物体。在一个备选实施方案中，RNAi可如下实施施用 在同一溶液中的本发明有义和反义核酸，在施用前没有退火，并甚 至可如下实施在非常接近的时间段内施用在单独的溶媒中的所述 核酸。另外提供编码GPR39的片段、同源物、衍生物和类似物的核 酸分子或与GPR39核酸序列互补的反义核酸。
本发明的反义siRNA和核酶序列可导入到培养的哺乳动物细胞 系中，以例如通过引起该基因下调并观察表型作用来研究GPR39 GPCR的功能，或研究本文描述的与GPR39 GPCR相关的蛋白的表 达和定位。在其中出现GPIG9 GPCR异常表达的细胞中，这样的反 义siRNA和核酶序列可用于下调基因的表达。
本发明的GPCR的cDNA序列可使用标准PCR (聚合酶链式反 应)克隆技术进行克隆。这包括制作一对针对SEQIDNO: 1的相反链 上的5'和3'末端的引物，使所述引物与由哺乳动物皮层细胞获得的 mRNA或cDNA接触，在致使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链 式反应，分离扩增片段(例如通过在琼脂糖凝胶上对反应混合物进行 纯化)并回收扩增的DNA。所述引物可设计得包含合适的限制酶识别 位点，以便扩增的DNA可克隆到合适的克隆载体中。这同样适用于 SEQIDNO: 3。
可以多种途径获得与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3序列并非 100%同源、但编码SEQ ED NO: 2或SEQ ID NO: 4或本发明的其它 多肽的多核苷酸。
例如，可对SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3序列进4亍定点诱变。 这在以下情况下是有用的例如序列需要沉默密码子改变，以优化
对其中要表达多核苷酸序列的具体宿主细胞的密码子选择。也可以 有其它序列改变，以^更导入限制酶识别位点，或改变由多核苦酸编 码的多肽的特性或功能。可以有其它变化，以呈现为提供例如保守 置换所需要的特定密码子改变。
本发明的核酸可在5'或3'末端包含附加序列。例如，合成或天 然的5'前导序列可以与编码本发明多肽的核酸相连接。附加序列还可 包含本发明核酸在特定宿主细胞中转录所需要的5'或3'非翻译区。
另外，可获得其它动物、特别是哺乳动物(例如人或兔)、更特别 是灵长类动物(包括人)的GPR39同源物，并用于本发明方法。这样 的序列可如下获得制备或获得cDNA文库，所述cDNA文库通过 将细胞或组织或基因组DNA文库与其它动物物种分开而制备，并在 中等至高严格(例如0.03 M氯化钠和0.03 M柠檬酸钠，约5(TC至约 60。C)条件下用包含全部或部分的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的 探针探测此文库。
本发明进一步扩展至分离的DNA序列，其含本发明多肽的编码 序列，但其中所述编码序列被分割为两个或多个(优选不超过5个， 例如4个或3个)外显子。这样的外显子序列可为天然的并得自基因 组克�。�或者可为合成的。外显子序列可用于构建含本发明多肽编 码核酸的小基因序列，所述序列被一个或多个外显子序列间隔开。
还可使用来源于任何真核来源的异源外显子构建小基因。
多肽
用于本发明方法的分离的多肽是如上定义的那些为分离形式、 不含或基本上不含与其天然伴随的物质(例如与其 一起存在于细胞中 的其它多肽)的多肽。所述多肽当然可与稀释剂或辅剂一起配制，实 际上仍是分离的一例如所述多肽如果用于包被免疫测定用微量滴定 板，则通常与明胶或其它载体混合。所述多肽可天然地或通过异源 真核细胞系统糖基化，或者它们可(例如通过在真核细胞中表达产生的情况下)为非糖基化的。多肽可磷酸化和/或乙酰化。
本发明的多肽还可为大致纯化形式，在此情况下一般包含处于
制品中的多肽，其中所述制品中90%以上(例如95%、 98%或99%)的 多肽是本发明多肽。
本发明多肽例如可通过加入组氨酸残基来修饰，以帮助其纯化， 或者可通过加入信号序列来修饰，以促进其由细胞分泌。
与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4具有至少50% (例如60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98Q/。)序列同一性的多肽可为分别是SEQID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列变体、等位基因、衍生物或突 变体的多肽，也由本发明提供。例如，这样的多肽可具有与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4所给出序列不同的氨基酸序列，不同之处在于一 个或多个(例如1-20个，例如2、 3、 4或5至10个)氨基酸的添加、 置换、缺失和插入。
多肽序列的同 一性百分率可使用比较参比序列(例如本发明的 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4)和查询序列的商品化算法来计算。其 它评测同 一性的细节见下文。
在测定出查询序列与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的序列具 有至少50%、优选至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%同一性 的情况下，所述序列是保留GPR39受体活性的多肽序列，这样的序 列构成了本发明的组成部分。
例如可在通过由编码核酸表达生产之后分离和/或纯化本发明的 多肽(例如使用抗体)。所述分离的和/或纯化的多肽可用于组合物配 制，所述组合物可包含至少一种附加组分，例如包含药学上可接受 的赋形剂、溶媒或载体的药物组合物。
本发明的多肽可用作免疫原，要不然就用于获得特异性抗体。 抗体可用于纯化和其它多肽操作、诊断筛选和治疗范畴。
本发明的多肽可用于筛选结合或调节其活性或功能的分子。这 样的分子可用于治疗(有可能包括预防)范畴。
本发明的多肽或标记多肽或其片段还可固定至固相，例如免疫 测定孔或测试条的表面。
这样的标记和/或固定化多肽(装在合适容器中)可与合适的试 剂、对照、说明书等一起装到试剂盒中。
该多肽和试剂盒可用于通过免疫测定法测定针对样品中存在的 该多肽或其活性部分或片段的抗体的方法。
免疫测定方法在本领域众所周知， 一般包括
(a) 提供一种包含抗所述蛋白的抗体可结合的表位的多肽；
(b) 将生物样品与所述多肽在允许形成抗体-抗原复合物的条件 下温育；和
(c) 测定是否形成含所述多肽的抗体-抗原复合物。 序列同一性
可使用对比参比序列和查询序列的商品化算法计算核酸和多肽 序列的同 一性百分率。可使用以下程序(由美国国家生物技术信息中 心提供)测定同源性/同一性BLAST、 gapped BLAST、 BLASTN和 PSI-BLAST,它们可使用默认参数。
算法GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI)使用最大化匹 配数和最小化空位数的Needleman和Wunsch算法来比对两个完整序 列。 一般来说，使用默认参数，空位创建罚分=12,空位延伸罚分 =4。
另 一种测定核酸序列或其部分和查询序列之间的最佳全局匹配 的方法是使用基于Bmtlag等(Comp. App. Biosci., 6; 237-245 (1990)) 的算法的FASTDB计算机程序。该程序提供了全局序列比对。所述 全局序列比对的结果为同一性百分率。在DNA序列的FASTDB检 索中用于计算同一性百分率的适宜参数为矩阵-Unitary、 k-tuple = 4、错配罚分-1、连接罚分=30、随机化组长度-0、截止分值=1、 空位罚分=5、空位大小罚分=0.05，单位比对长度(Window Size) = 500 或查询序列的核苷酸碱基长度中较短的那 一个。计算氨基酸比对的
同一性和相似性百分率的适宜参数为矩阵-PAM 150、 k-tuple = 2、 错配罚分=1、连接罚分=20、随机化组长度=0、截止分值-1、空 位罚分=5、空位大小罚分=0.05,单位比对长度(Window Size) = 500 或查询序列的核苦酸碱基长度中较短的那 一个。
载体
本发明的核酸序列可掺入到载体中，特别是表达载体。所述载 体可用于在相容宿主细胞中复制所述核酸。因此，在另一个实施方 案中，本发明提供一种如下制备本发明多核苷酸的方法将本发明 的多核苷酸导入复制型载体中，将所述载体导入到相容宿主细胞中， 在引起载体复制的条件下培养所述宿主细胞。所述载体可从宿主细
胞回收。合适的宿主细胞连同表达载体一起描述于下文。
优选地，载体中的本发明多核苷酸有效连接至能够供宿主细胞
表达编码序列使用的控制序列，即所述载体是一种表达载体。
术语"有效连接(的)"是指一种并列，所述组件在并列中所处的
关系允许其以其预期方式起作用。与编码序列"有效连接，，的控制
序列的连接方式使得在与控制序列相适的条件下实现编码序列的表达。
可选择或构建合适的载体，其包含合适的调节序列，包括启动 子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和 其它适宜序列。载体可为适宜的质粒、病毒(例如噬菌体、噬菌粒或 杆状病毒)、粘粒、YAC、 BAC或PAC。载体包括基因治疗载体，例 如基于腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒(例如HIV或MLV)的载体 或曱病毒载体。
可提供具有复制起点、任选地具有用于表达所述多核苷酸的启 动子和任选地具有所述启动子的调节子的载体。所述载体可包含一 个或多个选择标记基因，例如对于细菌质粒包含氨千青霉素抗性基
因和对于哺乳动物载体包含新霉素抗性基因。载体可体外使用，例
如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。所述载体还可适于体 内使用，例如适用于基因治疗方法。用于在各种不同宿主细胞中克 隆和表达多肽的系统众所周知。合适的宿主细胞包括细菌、真核细 胞(诸如哺乳动物和酵母)以及杆状病毒系统。本领域可用于表达异源 多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卯巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠 肾细胞、COS细胞等等。
可选择启动子和其它表达调节信号，以与为其设计表达载体的 宿主细胞相适。例如，酵母启动子包括酿酒酵母(S. ce^v/w'^) GAL4 和ADH启动子、粟酒裂殖酵母(S. jrom&) nmtl和adh启动子。哺乳 动物启动子包括可响应重金属如镉而被诱导的金属硫蛋白启动子。 还可使用病毒启动子，如SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子。所 有这些启动子在本领域都容易获得。
所述载体可包含其它序列，例如驱动插入核酸表达的启动子或 增强子、使所述多肽作为融合体生产的核酸序列和/或使在宿主细胞 中生产的多肽由细胞中分泌出来的分泌信号的编码核酸。
用于生产基因治疗用本发明多肽的载体包括携带本发明的小基 因序列的载体。因此，本发明的一个目的是提供一种治疗与GPR39 GPCR及其活性表达不足相关的异常病症的方法，所述方法包括使用 编码GPR39 GPCR的多核普酸。特别是治疗胃排空增力口(例如倾倒综 ^sf正)或肠能动性增强(例如腹泻、腹泻型IBS和混合型IBS)的方法。 在基因治疗中，本发明的多核苷酸用于通过受试者中的相关细胞实 现GPR39 GPCR的内源性生产。例如，可工程化编码GPR39 GPCR 的多核苷酸，以在如上提供的复制缺陷型逆转录病毒载体中表达。 然后，可分离逆转录病毒表达构建物，并导入到用含编码本发明多 肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞中，使得包装细胞 现在生产含目标基因的感染性病毒颗粒。这些生产细胞可施用于受 试者，用于在体内改造细胞和在体内表达多肽。关于基因治疗的综
述,参见Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches,笫20章，载于Human Molecular Genetics, T. Strachan and A.P. Read， BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996)。
关于进一步的细节,参见例如Molecular Cloning: a Laboratory Manual:笫2版，Sambrook等，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。许多用于操作核酸的已知技术和方案，例如在核酸构建物制 备、诱变、测序、将DNA导入细胞中并进行基因表达以及蛋白分析 中的技术和方案，详述于Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等编著，John Wiley & Sons, 1992。
载体可如上所述转化入合适的宿主细胞中，以供本发明多肽表 达使用。因此，又一方面，本发明提供一种制备本发明多肽的方法， 该方法包括在供编码多肽的编码序列的载体表达的条件下培养如上 所述用表达载体转化或转染的宿主细胞，并回收所表达的多肽。多 肽还可在体外系统中表达，例如网织红细胞裂解物。
本发明的其它实施方案提供用本发明多核苷酸复制和表达用载 体转化或转染的宿主细胞。选择与所述载体相适应的细胞，其例如 可为细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。宿主细胞可在表达所述基 因的条件下培养，以便生产编码多肽。如果所迷多肽偶联合适的信 号前导肽表达，则其可由细胞中分泌到培养基中。在通过表达生产 之后，视情况可由宿主细胞和/或培养基中分离和/或纯化出多肽，随 后根据需要使用，例如用于配制可含一种或多种附加组分的组合物， 例如含一种或多种药学上可接受的赋形剂、溶媒或载体的药物组合 物。
本发明的多核苷酸还可以反义方向插入到上述载体中，以便供 反义RNA或核酶生产使用。
测定
本发明的 一个目的是提供一种用于鉴定调节胃肠动力和胆固醇
稳态的化合物的测定，该测定包括提供本发明的全部或部分GPR39 受体蛋白，使所述蛋白与推定结合化合物接触；测定所述化合物是 否能够与所述蛋白相互作用。
在所述测定的一个实施方案中，受体或受体亚基可用于结合测 定。结合测定可为竟争性的或非竟争性的。此测定可提供大量化合 物的快速筛�。�以测定哪种化合物(如果有的话)能够结合所述多肽。 随后，可用发现结合的那些化合物进行更详细的测定，以进一步确 定这些化合物是否能用作本发明多肽的激动剂或拮抗剂。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于筌定调节胃肠动力和 胆固醇稳态的化合物的方法，该方法包括
(i) 在适于结合的条件下，使表达本发明的全部或部分GPR39 受体蛋白的宿主细胞与所述化合物接触，和
(ii) 检测化合物与所述受体蛋白的结合。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于鉴定调节胃肠动力 的化合物的方法，该方法包括
(i) 在适于结合的条件下，使表达本发明的全部或部分GPR39 受体蛋白的宿主细胞的膜制备物与所述化合物接触，和
(ii) 检测化合物与所述受体蛋白的结合。
在再另一个实施方案中，本发明提供一种用于鉴定调节胃肠动 力的化合物的方法，该方法包括一种竟争性结合测定，其中
(i) 在有和没有待测化合物的两种情况下，使表达本发明的全部 或部分GPR39受体蛋白的宿主细胞与已知结合GPR39受体蛋白的化
合物4妄触，和
(ii) 评价所述化合物对已知结合GPR39受体蛋白的化合物的结 合的影响。
在存在待测化合物的情况下，已知结合GPR39受体蛋白的化合 物的结合下降，说明所述化合物能结合GPR39受体蛋白。近期已鉴 定出GPR39受体蛋白的天然配体肥胖抑制素(Zhang, J.V.等，2004
Science,笫310巻；996-999)，其为与胃促生长素(ghrelin)来源于相
同激素原的另一种肽。在一个具体实施方案中，已知结合受体的化 合物包括肥胖抑制素，更特别是选自图5公开的其中一种肥胖抑制 素序列，即选自SEQ ID NO: 8-19,更特别是SEQ ID NO: 8或SEQ ED NO: 10。或者，本文使用的肥胖抑制素是指与SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 98% 或99%序列同一性的肽。
在一个替代实施方案中，用表达本发明的全部或部分GPR39受 体蛋白的宿主细胞膜制备物进行上述竟争性结合测定。下面描述了 所述宿主细胞的制备方法及这些细胞的膜制备物的制备方法。
在一个具体实施方案中，前述结合测定中的GPR39受体蛋白是 一种分离蛋白，其具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、具有前述SEQ ID的蛋白的剪接变体以及与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少50%、优选至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的氨基酸序列。
上文使用的部分GPR39蛋白意指包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的多肽的片段，所述片段大小为至少10个氨基酸，例如至少 20、 30、 40、 50、 75、 100或150个或更多个氨基酸。这些片段可分 别来源于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的N端区。含此N端区的 片段可用于重构受体的胞外部分，以提供受体结合位点。优选地， 所述片段保留结合已知结合GPR39受体蛋白的化合物的能力。
膜制备物
表达本发明受体蛋白的细胞膜用于某些类型的测定，包括但不 限于配体结合测定、GTP个S结合测定和其它测定。制备此细胞膜的 具体程序在某些情况下可由随后测定的特性来决定，但通常包括收 获全细胞和石皮碎细胞，例如通过在冰冷緩沖液(例如20mM Tris HCl、 ImM EDTA, pH 7.4,于4。C)中进行超声处理。随后通过j氐速离心清
除所获粗细胞裂解物的细胞碎片，例如以200xg于4°C离心5分钟。 最后使用高速离心步骤进行进一步的清除和膜富集，例如以40,000xg 于4'C离心20分钟，获得的膜沉淀通过在水冷緩沖液中悬浮并重复 高速离心步骤进行洗涤。最终洗涤过的膜沉淀重悬浮在测定緩沖液 中。蛋白浓度通过Bradford法(1976)测定，使用牛血清白蛋白作为标 准。所述膜可直接使用或冷冻待以后使用。
放射性标记配体结合测定
表达本发明受体的细胞可用于筛选所述受体的配体。可使用相 同测定荟定可用于各种治疗目的的受体激动剂或受体拮抗剂。
通过将由表达受体的细胞所制备的膜用合适的緩冲液稀释进行 放射性配体结合测定，所述緩沖液例如为含有2.1%牛血清白蛋白 (Sigma)、氺卩酶月太(0.005mg/ml， Boehringer Mannheim)和苯丁4中制素 (O.lmM， Sigma)作为蛋白酶抑制剂的50mM Tris緩冲液(pH = 7.4，于 (TC)。测定中的最终蛋白浓度通常在12-40iiig/ml之内。
然后，在有或没有竟争性配体的情况下，将膜与放射性标记的 配体在总体积为250]ul的96孔孩i量滴定板中于水上保温60分钟。然 后使用Tomtec (Wallac)真空过滤装置，经0.5Q/o聚乙烯亚胺(PEI)预浸 泡的GF/B滤器过滤，将结合配体与游离配体分离。在加入Ready Safe (Beckman)闪烁液后，使用Trilux (Wallac)闪烁计数器(结合计数的计 数效率接近40%)定量测定结合放射性。另一方面，优选可收集结合 配体，然后使用本领域众所周知的程序分离配体与受体。数据用 GraphPad prism拟合为非线性曲线。
以此方式，可鉴定结合受体的激动剂或拮抗剂化合物，因为它 们抑制放射性标记配体结合表达所述受体的细胞的膜蛋白。非特异 性结合,皮定义为在对应于所用放射性配体的100 nM未标记肽存在下 膜蛋白保温后保留的放射性量。在平衡饱和结合测定中，在浓度渐 增的标记化合物存在下，将用受体转染的膜制备物或完整细胞进行保温，以测定标记配体的结合亲合性。未标记化合物的结合亲合性 可在存在浓度可变的置换配体的情况下使用固定浓度的标记化合物 于平衡竟争结合测定中测定。
在一个具体实施方案中，使用如上文定义的放射性标记肥胖抑 制素，进行上述放射性配体结合测定。肥胖抑制素的标记和受体结
合描述于Zhang, J.V.等，2004 Science,笫310巻；996-999。简而言之 使用Iodogen (Pierce, Upland, IN)方法使肥胖抑制素捵化。将肽 (20貼)和lmCi [125I] Nal的混合物转移至预包被Iodogen小瓶中，温 育4分钟。1251-标记肽加到Sep-Pak C18柱(Waters),然后用60%乙腈 /0.1。/。TFA洗脱。对于放射性配体结合测定，大鼠空肠或其它组织用 緩冲液A(20mMHepes、 5mMEDTA、 lmM 二硫苏糖醇(DTT)、 10pM 脒基苯基曱基磺酰氟、5mg/L亮抑酶肽、lOOmM KC1, pH 7.5)洗涤， 切成小块，使用机械匀浆器匀浆。匀浆物以l，OOO g离心5分钟，上 清液于2。C以300，000 g离心1小时。沉淀(粗膜分离级分)用无KC1 的緩冲液A重悬�。�在液氮下快速冷冻，储存于-8CTC直至使用。在 有或没有1,000倍过量的未标记肥胖抑制素的情况下，将组织匀浆物 在含0.1%牛血清白蛋白的lOO(il磷酸緩冲盐溶液中于室温与不同浓 度的1251-肥胖抑制素温育18小时。温育后，将试管以10,000 g离心 10分钟，用水冷PBS洗涤沉淀两次，然后用丫-分光光度计定量测定 放射性。用总结合减去非特异性结合得出特异性结合。对于位移曲 线，将固定浓度的1251-肥胖抑制素单独保温或者与浓度渐增的肥胖抑 制素或其它肽一起保温。
除了前述结合测定以外，本发明的目的还在于提供用于鉴定调 节胃肠动力的化合物的功能测定，其特征在于所述化合物能调节本 发明的GPR39受体蛋白的活性。这样的测定包括以下步骤
(i) 使全部GPR39受体蛋白或部分GPR39受体蛋白与待测化合 物4妄触，和
(ii) 测定GPR39受体蛋白的活性，其中在试^r化合物存在下
GPR39活性的改变，说明所迷化合物调节胃肠动力的能力。
假定观察到GPR39与胆固醇稳态的关联，在鉴定结合和/或调节 GPR39活性的化合物的所有公开实施方案中，所述测定可用于鉴定 可影响受试者的胆固醇稳态的化合物，所述受试者包括人和温血动 物。
调节本发明多肽活性的化合物是指改变多肽活性以使多肽在有 所述化合物和没有所述化合物时表现不同的化合物。影响调节的化 合物包括激动剂和拮抗剂。激动剂包括激活GPR39 GPCR功能的化 合物。反过来说，拮抗剂包括干扰GPR39 GPCR功能的化合物。通 常，观察到的拮抗剂作用为阻断激动剂诱导的受体活化，但对最近 已描述为组成型活性受体的GPR39而言，干扰GPR39 GPCR功能的 化合物还包括反向激动剂，即和该受体的激动剂 一样结合同 一受体 结合位点但表现出相反药理学效应的药剂。拮抗剂包括竟争性以及 非竟争性拮抗剂。竟争性拮抗剂(或竟争性阻断剂)作用于或接近于对
激动剂结合特异性的位点。非竟争性拮抗剂或阻断剂通过与激动剂 互作位点之外的位点相互作用而使受体功能失活。
因此，本发明的目的在于提供一种鉴定能够增加胃排空和/或结 肠能动性的化合物的方法，所述方法包括
(i) 使表达全部GPR39受体蛋白或部分GPR39受体蛋白的宿主
细胞与待测化合物在允许所述受体蛋白活化的条件下接触，和
(ii) 测定GPR39受体活性的任何增加，由此筌定为能够增加胃
排空和/或结肠能动性的化合物的试验化合物。
在再一个实施方案中，本发明提供一种鉴定能够降低胃排空和/
或结肠能动性的化合物的方法，所述方法包括
(i) 使表达全部GPR39受体蛋白或部分GPR39受体蛋白的宿主
细胞与待测化合物在允许所述受体蛋白活化的条件下接触，和
(ii) 测定GPR39受体活性的任何降低，由此鉴定为能够降低胃
排空和/或结肠能动性的化合物的试验化合物。
再者，就上文提及的结合测定而言，上述活性测定还可用于鉴
定会调节胆固醇代谢的化合物。根据观察到的表型，预期增加GPR39 活性的化合物会导致胆固醇水平降低，而降低GPR39活性的化合物 会导致胆固醇水平升高。在一个具体实施方案中，本发明提供一种 鉴定能够降低胆固醇水平的化合物的方法，所述方法包括
(i) 使表达全部GPR39受体蛋白或部分GPR39受体蛋白的宿主 细胞与待测化合物在允许所述受体蛋白活化的条件下接触，和
(ii) 测定GPR39受体活性的任何增加，由此鉴定为能够降低胆 固醇水平的化合物的试验化合物。
所述化合物对GPR39活性的作用可为增加或降低由GPR39介 导的胞内第二信使形成，所述笫二信使例如为胞内4丐、cAMP或受体 基因产物。GPR39属于称为G蛋白偶联受体(GPCR)的蛋白类型。GPCR 在结合配体时经细胞膜传输信号。配体结合的GPCR活化由异三聚 化G蛋白介导的胞内信号转导事件，例如活化腺苦酸环化酶途径或 活化磷脂酶c-p途径。评价前述胞内信号转导事件活化的测定一般来 说是本领域已知的，其中包括用于含嵌合配体可诱导转录因子的信 号转导的细胞型测定、使用荧光强度分布分析的用于G蛋白偶联受 体的结合测定、使用偶联至发光团的环核苷酸的细胞信号转导测定 或使用指示多重应答元件或cAMP应答元件的寺艮道分子测定检测G 蛋白偶联受体的应答。下面描述了几种这样的测定。
本发明还提供一种鉴定调节GPR39 GPCR基因的调节区的化合 物的生物测定。此测定使用能够表达本发明多肽(优选SEQ ID NO: 2 或SEQ ID NO: 4)的大鼠或人细胞进行。所述细胞与至少一种化合物 接触，其中所述化合物调节所述调节区的能力是已知的。此后，监 测所述细胞表达本发明核酸的情况。任选地，启动子可以与寺艮道基 因相连接。可使用的适宜报道基因包括例如氯霉素乙酰转移酶基因、 萤光素酶基因等。
如本领域技术人员所理解的，鉴定调节受体(例如本发明多肽)活
性的化合物的生物测定方法一般需要与对照进行比较。 一类对照是 与接触所述化合物的试验细胞或试验培养物大致相同地处理的细胞 或培养物，不同之处在于对照细胞或培养物不接触所迷化合物。另 一类可使用的对照细胞或培养物是与转染细胞相同的细胞或培养
物，例外之处是对照细胞或培养物不表达功能性GPR39 GPCR。因 此，在相同反应条件下，可对比转染细胞和对照细胞或培养物对相 同化合物的反应。
特别优选的测定类型包括结合测定和功能测定，它们可如下实
施
结合测定
编码本发明多肽的核酸在细胞系(包括哺乳动物HEK 293细胞、 CHO细胞和Sf9昆虫细胞)中的过量表达可用于生产携带所述多肽(为 方便起见，在本章节中是指GPR39 GPCR)的膜制备物，用于配体结 合研究。这些膜制备物可用于常规滤膜结合测定(例如使用Brandel 滤膜测定设备)或高通量闪烁亲近型结合测定(SPA和Cytostar-T Flashplate #支术；Amersham Pharmacia Biotech)， 以斗企测》文射寸生才示"i:己酉己 体的结合和结合位点的竟争物对此放射配体的替换。放射性可用 Packard Topcount或相似的设备检测，能够由96、 3M、 1S36孩t量滴 定孔形式进行快速检测。SPA/Cytostar-T技术尤其可按照高通量筛选 实施，因此该技术适合用作对能够替换标准配体的化合物的筛选。
研究配体与GPR39 GPCR蛋白在近于天然状况的环境中结合的 另 一种方法利用Biacore instrument (Malmqvist M., Biochem Soc Trans. 1999年2月；27(2):335-40)开发的表面等离子体共振作用。在膜制备 物或全细胞中的GPR39 GPCR能与Biacore的生物芯片相连接，并在 有和没有化合物的情况下检验配体结合，以鉴定结合位点的竟争物。
功能测定
因为GPR39 GPCR经通常与GIRK (内向整流钾通道)相互作用 的Gi或Go (抑制型G蛋白)起作用，所以钾离子流动应对这些受体的 活化有作用。这种离子流动可使用各种技术实时检测，以测定特定 化合物的激动或拮抗作用。因此，在细胞系或例如爪蟾(Xem / w力卵 母细胞中表达的重组GPR39 GPCR受体可使用全细胞或单通道电生 理学分析来表征，以确定目标化合物的作用机制。可使用常规电生 理学技术和目前处于研发中的新高通量方法(当它们变为可用时)，电 生理学筛选对GPIG9 GPCR有活性的化合物。
焚光一使用几种离子敏感型荧光染料可检测钙和钠流动，所述 染料包括fluo-3、 fluo-4、 fluo-5N、 fum red、绿钠盐、SBFI和包括 Molecular Probes在内的供应商的其它类似探针。从而可使用荧光计 和焚光成像技术(包括用或不用激光共聚焦法的荧光显^^镜术，其组 合成像分析算法)实时表征由GPR39 GPCR引起的钙和钠流动。
另一种方法是高通量筛选测定，用于起影响钙瞬变的激动剂或 调节剂作用的化合物。该测定基于称为荧光成像读板仪((FLIPR⑧)， Molecular Devices Corporation)的设备。其以其最常用配置激发并检 测由荧光型染料发射的荧光。其使用氩离子激光于488 nm产生高能 激发的荧光团，使用一种光学系统快速扫描96/384孔板的整个底部， 并使用灵敏的冷却CCD照相机捕获发射的荧光。其还包含一种96/384 孔分液头，允许设备将试剂溶液加到96/384孔板各孔中。FLIPR测 定设计用于在加入所述化合物之前、当中和之后同时地实时检测全 部96/384孔的细胞群体的荧光信号。FLIPR测定可用于筛选和表征 对在细胞系中表达的重组GPR39 GPCR (例如大鼠或人GPR39 GPCR) 有功能活性的化合物。如下所述，为了确定受体的天然配体，使用 FLIPR测定4t测GPR39 GPCR转染细胞中的钙瞬变，以便检测各种
底物对受体的活化。
环AMP (cAMP)测定一可在表达所述受体的细胞中测定受体介 导的对环AMP (cAMP)形成的刺激和抑制。用于cAMP测定的代表
性方法见下文。
在该方法中，使用DEAE-葡聚糖法用受体基因瞬时转染COS-7 细胞，再接种到96孔位置。转染后48小时，用补加10mM HEPES、 10mM葡萄糖和5mM茶碱的Dulbecco磷酸緩冲盐溶液(FES)洗涤细 胞两次，并在相同緩冲液中于37°C、 5% C02下温育20分钟。加入 试验化合物，细胞于37。C再温育IO分钟。然后吸出培养基，通过加 入100mMHCl终止反应。所述板于-20。C储存2-5天。对于cAMP检 测，解冻平板，每个孔中的cAMP含量通过cAMP闪烁亲近测定 (Amersham Pharmacia Biotech)才企测。方文射'tK吏用microbeta Trilux i十 数器(Wallac)定量。
微量生理测定一因为细胞代谢错综复杂地参与广泛的细胞事件 (包括多个信使途径的受体活化)，所以使用细胞代谢的微量生理测定 可以提供对细胞活性的一般性测定，所述细胞活性起因于任何孤儿 受体的活化，与受体信号转导途径的特异性无关。
瞬时受体表达、细胞制备和4鼓量生理测定记录的一般指引参见 Salon, J.A.和Cwicki, J.A., 1996。通常，收获表达受体的细胞，并在 实验前24小时以3xl05细胞"效量生理计传感器接种在完全培养基 中。在记录前16小时用无血清培养基替换原培养基，以使分了类的 和不清楚的血清因子的非特异性代谢刺激减至最小。在实验当天， 将细胞传感器转移入4敬生理计中，并使其在记录培养基(低緩沖RPMI 1640， 无碳酸氬盐、无血'清(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA),含0.1-1%无脂肪酸的BSA)中平衡，在此过程中建立基础代谢 活性的基线测量值。
标准记录方法规定流速100)ul/分钟，总泵循环2分钟，其中 含30秒流动中断，在此过程中进行酸化率检测。配体攻击包括就在 进行头遍攻击率检测之前接触样品1分20秒，之后是两次额外泵循 环，共5分20秒样品接触。通常，初筛时药物按10pM终浓度提供 给细胞。此外，患有心血管并发症的个体可以是患有中风的个体。术语"中 风"涉及任何脑血管事件，其中，例如由于脑出血或脑动脉的血栓形 成，流向脑的小的或大的区域的血液被中断。中风可能引起暂时的意
识丧失或麻痹。在这种情况下，中风被称为"apoplectic stroke"。
个体可能显示临床症状(例如，呼吸困难、胸痛，参见以下的NYHA 分类法)，他们可能是无症状的。虽然本发明对于鉴定没有显示先存 的心血管疾病、风险或并发症症状的风险患者特别有益，在其他集合 中它也是有用的，例如，来确认或监视显示心血管疾病症状的患者的 风险状态。
术语"心血管风险"涉及发展心血管并发症的风险。 本发明涉及由于施用抗炎药物或Cox-2抑制剂，特别是NSAID、
甾族药物或选择性Cox-2抑制剂的结果发展的"心血管并发症"。心血
管并发症也称为"心血管事件"。在下文中，仅仅或主要地，将使用术
语"心血管并发症"。
术语"心血管并发症，，是本领域的技术人员已知的。因而，根据本
发明的"心血管并发症"涉及本领域的技术人员已知的任何类型的这种
心血管并发症或心力衰竭(特别是急性心力衰竭)，特别地，该术语 是指与动脉血栓形成或动脉血栓形成的发展相关的并发症。动脉血栓
形成可能引起冠状动脉综合征(例如，急性心肌梗塞或中风)，
特别地，"心血管并发症"涉及动脉系统中的并发症，例如ACS、
UAP、 MI、 ST提高的MI、非ST提高的MI或中风。
更特别地，"心血管并发症"涉及MI、 ST提高的MI、非ST提高
的MI或中风。
心血管疾病的症状是本领域的技术人员已知的，可以包括，例如， 新的Q-波或束支阻滞、非致死性中风的病征、由水肿的发展或先存的 下肢水肿的恶化所暗示的心力衰竭的发作或恶化、听诊的罗音或肺充 血、动脉高压的新近发作或先存的高动脉压的恶化、以及静脉血栓形 成。
心血管疾病的症状已经才艮据New York Heart Association (NYHA)被分类入功能性分类系统。I类患者没有心血管疾病的明 显症状。身体活动不受限制，普通的身体活动不引起过度疲劳、心跳 或呼吸困难(呼吸急促)。II类的患者具有身体获得的轻微限制。他
使用的那些载体或稀释剂。载体或稀释剂的选择当然取决于提议的 给药途径，给药途径可取决于所述药剂及其治疗目的。制剂可便利 地以单位剂型提供，并可通过药学领域众所周知的任一种方法制备。 这样的方法包括实现活性成分与由一种或多种助剂构成的载体结合
的步骤。 一般来说，所述制剂如下制备将活性成分与液体载体或
微细固体载体或这二者非常均匀地混合在一起，然后必要时使产物 成型。
对于固体组合物，可使用常规的无毒固体载体，包括例如药用 级甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬脂酸镁、糖精 钠、滑石粉、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。上述活性化合物可使用例 如作为载体的聚烷撑二醇、乙酰化甘油三酯等配制成栓剂。可施用
的液体药物组合物例如可通过对如上定义的活性化合物和可选的药 用辅剂的载体溶液进行溶解、分配等来制备，所述载体例如为水、 葡萄糖盐水溶液、甘油、乙醇等，由此制成溶液剂或混悬剂。如果 有需要的话，待施用的药物组合物还可包含少量无毒辅助物质，例
如润湿剂或乳化剂、pH緩冲剂等，例如乙酸钠、失水山梨醇单月桂 酸酯、三乙醇胺乙酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯 等。这些剂型的实际制备方法是本领域技术人员已知的或者是显而 易见的；参见Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eastern, Pennsylvania,笫15版，1975。
在任何情况下，待施用的组合物或制剂都将含有一定量的活性 化合物，其量有效减轻待治疗受试者的症状。
可制备含0.25-95%范围内的活性成分的剂型或组合物，由无毒 载体平;(釺组成。
对于口服给药，通过掺入任一正常使用的赋形剂，例如药用级 甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、交联羧曱基纤维素钠(sodium crosscarmellose)、淀粉、硬脂酸4美、糖精钠、滑石粉、葡萄糖、蔗糖、 碳酸镁等，制成药学上可接受的无毒組合物。这样的组合物采用溶
液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶嚢剂、散剂、緩释制剂等形式。这
样的组合物可包含1%-95%活性成分，更优选为2-50%,最优选为5-8%。
一般来说，胃肠外施用以皮下、肌内或静脉内注射为特征。注 射剂可制备成常规形式，或者作为液体溶液剂或混悬剂、适于在注 射前用液体配制成溶液剂或混悬剂的固体形式，或者为乳剂。合适 的赋形剂例如为水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等。另外，如果有 需要的话，待施用的药物组合物还可包含少量无毒助剂，例如润湿 剂或乳化剂、pH緩冲剂等，例如乙酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、 三乙醇胺油酸酯、三乙醇胺乙酸钠等。
在此胃肠外组合物中包含的活性化合物的百分率高度依赖于其 具体特性以及化合物的活性和受试者要求。但是，在溶液剂中活性 成分的百分率为0.1%-10%是有益的，如果组合物为固体则活性成分 的百分率将会更高，随后所述固体组合物稀释至上述百分率。优选 地，所述组合物的溶液中活性剂占0.2-2%。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于治疗以下疾病的药物 组合物胃排空延迟、与胃排空延迟相关的疾病(例如胃轻瘫术后肠 梗阻、糖尿病性胃轻瘫、机能性消化不良、迷走神经切断术后胃轻 瘫和特发性假性肠梗阻)，所述组合物包含GPR39受体拮抗剂。
本发明的另 一个目的是一种用于治疗以下疾病的药物组合物 胆固醇水平升高、胃排空增加、与胃排空增加相关的疾病(例如倾倒 综合征或肠能动性增强，例如腹泻、腹泻型IBS和混合型IBS),所 述组合物包含GPR39受体激动剂。
因此，本发明的一个目的是提供GPR39拮抗剂在制备用于治疗 与胃排空延迟相关的疾病的药物中的用途。特别是用于治疗胃轻瘫 术后肠梗阻、糖尿病性胃轻瘫、机能性消化不良、迷走神经切断术 后胃轻瘫和特发性假性肠梗阻。在另一个实施方案中，本发明提供
GPR3 9激动剂在制备用于治疗与胃排空增加相关的疾病的药物中的
用途。特别是用于治疗倾倒综合征、腹泻、腹泻型IBS和混合型IBS。 参考下面的实施例细节将更好地理解本发明，但本领域技术人 员容易意识到，这些实施例细节仅用于说明本发明，本发明在所附 权利要求书中更完整地描述。另外，在本申请全文中，引用了各种 出版物。这些出版物的公开内容在此引用到本申请中作为参考，以 更全面地描述本发明所属领域的现有技术水平。
实施例
下面的实施例用于说明本发明。才艮据这些实施例，本领域技术 人员会联想到其它实施方案。
材料与方法 GPR39敲除小鼠
GPRC39敲除小鼠由Lexicon Genetics Inc获得。通过用IRES LacZ/MCl-Neo报道基因/选择盒替换GPR39基因笫一编码外显子的 编码区，对GPR39可读框进行-皮坏。动物保持在满足所有比利时和 欧洲动物管理要求的SPF设施中。除非有不同指示，否则小鼠分群 关养在气候受控的动物居住区中，12小时昼夜循环(昼于7:00 EST开 始)，自由获取食物和水。采用足够的措施使疼痛或不适最小化。所 有实验都按照欧洲议会和理事会规定(European Communities Council Directives) (86/609/EEC)进行，并得到了地方伦理委员会的批准。
GPR39的实时定量逆转录PCR分析
使用实时定量逆转录PCR分析由野生型小鼠(脑、肝脏、脊髓、 胃、肾脏、脾脏、结肠、肺、心脏、食管、胰腺、回肠、空肠)和GPR39 敲除小鼠(肝脏、胃、空肠、结肠)解剖的不同组织的总RNA，以研 究GPR39的组织分布，并证实GPR39被敲除。使用随机六聚体引物 和Superscript II RT (Invitrogen Life Technologies)对l.Omg总RNA进 行笫 一链cDNA合成。使用Taqman PCR试剂盒在ABIPrism 7000循
环仪(Applied Biosystems)上进行定量PCR。使用连续稀释的cDNA 产生临界循环数对(3-肌动蛋白浓度对数的标准曲线。下文收集了 RTQ 特异性引物对和探针。
RTQ引物和探针的小鼠MPA2选择
GPR39一FW 5'-CCA CTC ACA AGG GAC TCA ACT G-3' (SEQ ID NO: 5) GPR39—REV 5'-TGG AGT TTC CAG GTT CAT CGT-3' (SEQ ID NO: 6) GPR39一Probe 5'-AAC CTC TCT CGC ACC CGC CA-3' [5' FAM〗[3' TAMRA] (SEQIDNO:7)。
样品以 一 式三份进行实验，结果仅在符合定量标准时才显示。 不同小鼠组织中的表达水平以对小鼠(3-肌动蛋白标准化后的相对水平表示。
GPR39敲除小鼠中的P-半乳糖苷酶活性的染色
由在内源小鼠GPR39启动子调控下表达细菌(3-半乳糖苷酶基因 (LacZ)的纯合GPR39敲除小鼠解剖出组织(胰腺、胃、回肠、空肠和 结肠)。按照已描述的方案(InvitroGen)对这些组织进行整封染色，接 着对组织进行石蜡包埋和制作切片。
表型分析 胃排空
一组6只野生型和6只纯合雄性GPR39敲除小鼠关养在20-22 。C、 14小时-10小时昼夜循环的笼内。标准商品化小鼠饲料(4352 Muracon G， Nutreco Belgium NV, Gent, Belgium) (4.5%脂肪、4%纤维 素、21%蛋白质、1.404 kcal/g)可随意获取，直至测试前的晚上。在 下午4点，撤除食物，在笫二天的上午11点开始测试。将铁丝网板 插入到笼的底部，以避免禁食过程中的嗜粪癖。除了测试期间以外， 自来水始终可自由获取。
试验餐
固体试验餐由O.l g烘烤的炒蛋黄组成，掺杂O.Ol nCi "c-辛酸 钠盐(American Radiolabeled chemicals Inc, St Louis, MO， USA), 并与 0.1 g标准小鼠饲料混合。加入自来水，并混合形成均匀糊浆。在开 始试验前的2周内，每周两次按固定时间程序训练禁食小鼠(19小时) 自动吃无放射性标记的试验餐。在该训练后，大部分小鼠在60秒内 吃完试验餐。
呼吸测试方法CO二取样
为6根气密塑料管装上进口阀，通过该阀门通入连续气流(80% N2、 20%O2、 360ml/min),同时出气流通入一个装有002捕集器、四 甲基氢氧化铵(1.3mmo1) (Acros, Geel, Belgium)和pH指示剂百里酚舦 (0.006%)的小瓶内。在所用取样时间内，没有观察到脱色，说明在实 验过程中呼出的所有C02都被捕获。管的尺寸(直径50mm，长度 150mm)允许小鼠自由走动。每只小鼠都放置在气密管中，在给予测 试餐之前取基线呼吸样品(5分钟)。打开管，给予小鼠食物，再关闭 管。在前半个小时每5分钟进行取样，在接下来的4小时当中每15 分钟进行取样。加入闪烁液，用P-计数器对样品计数。
数据分析
使用最小平方分析，呼吸中排出的14C02通过两个数学公式拟 合，以获得最佳拟合曲线(Ghoos等，W93; Maes等，1994): 公式1: y = mkpe-kt(l -e — 公式2: y = atVct
y是每小时呼吸中"C02排出的百分率，t是以小时为单位的时 间；m、 k、 |3、 a、 b和c为回归估计常凄t， m是时间无穷大时回收 的"C02总量。
由最佳拟合计算以下参数
-胃半排时间(、/2),排出14002总量的50%的时间。因此，11/2值
不仅包含胃半排空时间，而且包含胃处理后必须的时间，例如"c辛
酸的吸收和代it和呼吸中"(:02的排出。 公式1: t1/2 = (-l/k)*ln(l-2 —1/p) 公式2: t1/2 = 60*(b/c)
-迟滞期(t^)，由于胃将食物研磨成细颗粒需要时间而导致的胃 排空延迟。
公式l: tlag-ln(P)/k
/>式2: tlag = 60*gammainv(0.5; 1 + b; 1/c)
为了确保测出的14C02产量没有由拟合的数学曲线逸出太多，将 测量值与数学拟合为理论曲线的值相关联。如果相关系数小于0.95 (r幼.95),则数学拟合被认为是不可接受的，数据排除在分析之外。
胃分泌
使用一组6只野生型(WT)和6只纯合GPR39敲除(GPR 39 —一) 雌性小鼠研究胃分泌。
使用异氟烷麻醉小鼠。在麻醉下利用缝线(vicryl 4-0， Ethicon)闭 合幽门，然后缝合腹腔。将动物单独地再放入其笼内达4小时。4小 时后处死幽门闭合小鼠，刚好在贲门之上闭合食管。由腹腔中取出 胃。称重胃，打开取出胃分泌物。检测胃分泌物，然后用5ml水稀 释(Water Molecular Biology Grade, Eppendorf)。用pH电极(pH 597, Profi Lab)测pH。
数据分析
数据用平均值士SD表示。使用非参数Wilcoxon检验比较野生 型(WT)和GPR39-「小鼠之间的小鼠胃重量和胃分泌物。首先测水 (5ml)的pH，然后加入到胃分泌物中，再测pH。计算出水的pH和含 胃分泌物的溶液的pH之间的差值，然后对lml溶液进行报告，接 着使用非参数Wilcoxon检验对比两个组之间的pH差。
粪粒推进力
使用一组6只野生型(WT)和6只纯合GPR39敲除(GPR 39 — 雄性小鼠研究粪粒推进力。
利用C02使小鼠窒息，接着断头。切下由盲肠到直肠的结肠， 清除粘连组织。将组织转移至含100ml Krebs-Henseleit溶液的玻璃烧 杯，用95% 02和5% C02吹气，保持于37。C。在开始实验之前，测 量结肠长度。计数结肠中的粪粒，并测出它们到盲肠的距离。然后 记录20分钟内各个粪粒排出的时间。
数据分析
通过将各个粪粒相对于结肠长度的位置分区，测定t-0和20分 钟时结肠长度内粪粒的分布(结肠长度15%的划分区0%-15%，〉 15%-30%、 >30%-45%、 〉60%-75%、 〉 75%-90%和 > 卯％-100%, 其中0%代表直肠，100。/。代表IC瓣)。考察总结肠长度15%的划分区， 在20分钟时间段内计数各个划分区中的粪粒数和由各个划分区排出 的粪粒数。使用双边符号检验进行统计学分析。
小鼠4于为试验
使用一组14只野生型和14只纯合雄性GPR39敲除小鼠以及12 只野生型和12只纯合雌性GPR39敲除小鼠进行两种行为试验开放 场域试验(Open Field Test)(—种评价运动能力的行业内已知方法)和 高架零迷宫(Elevated Zero Maze)(—种评价焦虑相关行为的行业内已 知方法)。
在正常昼/夜周期的白昼阶段中进行开放场域试验(OFT)。每只 小鼠在自动化开放场域系统中进行30分钟的测试训练。记录在水平 和垂直方格中的走动。在此训练当中，记录以下参数活动持续时 间、移动次数、总移动距离、在中心移动的距离、在边缘移动的距 离、在中心移动的相对距离、在中心耗费的时间、在边缘耗费的时
间、在中心^^费的相对时间、在中心移动的距离对在边缘移动的距 离、在中心耗费的时间对在边缘耗费的时间、直立次数和直立持续
时间。单因素ANOVA用作所得结果的统计学分析。
高架零迷宫(o-迷宫)在正常昼/夜周期的白昼阶段中进行。每只
小鼠在高架零迷宫中进行5分钟的测试训练。在此训练当中，记录 以下参数在封闭臂和开放臂中的活动时间、在封闭臂和开放臂中 耗费的相对时间、总移动距离、在封闭臂和开放臂中的移动距离。 单因素ANOVA用作所得结果的统计学分析。
呼吸率
使一组6只野生型和6只纯合雄性GPR39敲除小鼠适应AIN-93G 啮齿动物纯化祠料(Dyets, Inc., USA),然后将它们放入代谢笼内。在 与代谢笼(参见下文)相同的条件下，将小鼠单独关养在2型笼内最少 l周，之后检测。在连续2天内，所有小鼠都在受控的温度(28.8。C)、 湿度(55-60%)和光照(12:12小时昼/夜周期，昼于06:00开始)下单独 关养在代谢笼内。动物自由获取啮齿动物祠料和水。测定以下参数， 用平均值表示呼吸商(RER)、 V02和产热。
血液分析
在随意获取标准飼料后剥夺食物12小时，然后测定6月龄雄性 和雌性GPR39一-小鼠对GPR39"+同窝出生小鼠中的血浆胆固醇和甘 油三酯水平。使用同 一供应商的试剂和试验方法，利用Hitachi Modular 随才踏取分4斤4义(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)测定月旦固醇和 甘油三酯水平并求出平均值。
食物摄取
在上午10点开始，于6小时当中，在随意喂饲和禁食的年幼(17 周)和年长(56周)GPR39 —一小鼠对GPRS9+"同窝出生小鼠(每组i^6) 中进行累积食物摄取分析。将每只小鼠放到单独的笼内，置于暗室
中(除非另有说明)，小鼠在笼内接受预称重量的食物。通过在30分 钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时和6小时时扣除没吃的 食物测出累积食物摄取。
结果
GPR39的实时定量逆转录PCR分析
在来源于野生型小鼠的多个小鼠组织中进行的GPR39实时定量 逆转录PCR分析显示出广泛的组织分布(图1A)。在来源于野生型小 鼠以及杂合和纯合GPR39敲除小鼠的4种不同组织(肝脏、胃、空肠、 结肠)中进行的GPR39实时定量逆转录PCR证实，在GPR39敲除小 鼠中不存在GPR39转录物。在杂合小鼠中获得中间水平(图1B)。
GPR39敲除小鼠中的P-半乳糖苷酶活性的染色
检测胰腺的外分泌部分(胰岛)和内分泌部分、位于幽门粘膜腺组 织上部区域的壁细胞和胃体中颈粘液细胞、小肠和结肠中的肠细胞 以及神经支配肠肌肉层的神经元中的GPR39表达。
胃排空
与野生型小鼠相比，GPCR 39敲除小鼠中固体食物的胃排空明 显加速。实际上，GPCR39敲除小鼠中的半排空时间(、2)(48.5士2分 钟，n-6)与野生型小鼠(89.9土6分钟，n-6)相比显著降低(图2A)。 GPCR 39敲除小鼠的T^相对于野生型小鼠也显著降低(22.5 ± 1.3分 钟对39.2 ±3.4分钟，n = 6)，证实GPCR 39敲除小鼠中固体食物的 胃排空加速(图2B)。这些结果是以3天间隔在每组6只小鼠中进行 的3次连续试验的平均值。
胃分泌
在WT和GPR39-卜小鼠之间没有观察到小鼠体重的显著差异(分 别为30.4±6.6 g对26.9±4.0 g)。测量了两个组之间的胃重量趋势
(WT: 978土262mg对GPR39 -/-1395 士343mg; P = 0.0547)。
与野生型小鼠相比，GPR39 -/-小鼠中的胃分泌物(jjL)显著增加 (分别为638 ±336|ul对225士170pl; P = 0.0242)。 GPR39 -/-中水pH 和胃分泌物溶液pH之间的pH下降显著小于WT (分别为0.9 ± 0.2对 1.1 ±0.2; P = 0.0374)。这些数据表明，GPR39受体的缺失诱发胃分 泌物显著增加，但这种增加不是缘于酸分泌的增加。
粪粒推进力
结果表明，在实验开始时结肠内的粪粒分布在GPR39-/-和WT 之间没有差异(根据双边符号检验p = 0.5637;蓝色条，在黑白显示时 呈黑色)(图3)。 WT和GPR39 -/-均排出最接近直肠的粪粒(总长度的 0-30%);大部分位于远侧的粪粒(长度的30-75%)由GPR39 —^动物的 结肠排出，但没有由WT动物排出(p-0.0253;黄色条，在黑白显示 时呈白色)(图3)。这些结果表明，GPR39-动物结肠的粪粒排出更 有效。
小鼠4于为试验
因为观察到的胃排空差异可能被GPR39敲除小鼠的一般活动或 情绪状态的差异所混淆，所以我们进行现有的神经学检查 一开放场 域试验(OFT)和零迷宫试验(O-迷宫)。
开放场域试验
在雌性GPR39敲除小鼠和野生型同窝出生小鼠之间没有观察到 运动能力差异。因此，观察到的胃排空差异不是缘于雌性GPR39敲 除小鼠一般活动增加的假象。没有观察到移动持续时间、移动次数、 总移动距离、总移动时间、在中心移动的距离、在边缘移动的距离、 在中心移动的相对距离、在中心耗费的时间、在边缘^^费的时间、 在中心耗费的相对时间、在中心移动的距离对在边缘移动的距离、
在中心耗费的时间对在边缘耗费的时间、速度、直立次数和直立持
续时间的显著差异。在对比雄性GPR39敲除小鼠和野生型同窝出生 小鼠时，没有观察到可混淆观察到的胃排空差异的一般活动增加。 即使有的话，也是在雄性GPR39敲除小鼠中观察到小但显著的一般 活动下降，以雄性GPR39敲除小鼠与野生型对照相比总移动时间和 总移动距离显著下降为证(ANOVA, p<0.001)。另外，与野生型同 窝出生小鼠相比，GPR39敲除小鼠中的中心移动距离、中心移动相 对距离以及中心对边缘距离显著降低。后述差异可能缘于运动能力 下降，或者，可反映出致焦虑表型。因此，进行O-迷宫试验。
零迷宫试验
在O-迷宫中，GPR39敲除小鼠既没有表现出致焦虑表型，也没 有表现出抗焦虑表型。在封闭臂对开放臂中耗费的相对时间以及在 封闭臂对开放臂中的相对移动距离在GPR39敲除小鼠和野生型对照 小鼠中是相似的。因此，GPR39敲除小鼠中胃排空速率增加不是缘 于针对焦虑诱发条件的反应改变。
呼吸率
在两个记录日当中，没有观察到雄性GPR39敲除小鼠和野生型 同窝出生小鼠之间的呼吸率差异。因此，观察到的胃排空差异不是 缘于雌性GPR39敲除小鼠呼吸率的假象。野生型和GPR39敲除小鼠 的呼吸商都保持在1.0左右，V02连同产热不随任一个基因型而变。
血液分析
在随意获取标准铜料后剥夺食物12小时，然后收集6月龄雄性 和雌性GPR39-"小鼠对GPR39"同窝出生小鼠的血液化学数据。和 GPR39+"雄性(107.3 士".8)和雌性(83.5 ±24.2)同窝出生小鼠相比,雄 性(142.2 士29.0)和雌性(118.7 ± 16.2) GPR39一—小鼠的胆固醇水平(以 mg/dl为单位的平均值土SD)均显著增力口(对于雄性和雌性分别为p<0.05和p<0.001)。和GPR39+"雄性(123.9士20.8)和雌性(71.4士12.0) 同窝出生小鼠相比，雄性(162.5 ± 14,7)和雌性(84.6 ± 7.2) GPR39 —小 鼠的甘油三酯水平(平均值士SD,单位为mg/dl)呈现出增加，但差异 没有达到显著程度。
食物摄取
在GPR39敲除小鼠中，在开始实验之前自由获取食物的小鼠(17 周，n = 6)中的累积食物摄取与野生型小鼠相比没有显著(P - 0.47)差 异。在较年长的小鼠中得到相同观察结果(56周，n = 6, P-0.78)。 相反，在禁食小鼠(19小时)中，GPR39小鼠中的累积食物摄取显著(P 〈O.OOOl)低于野生型小鼠。此效果在较年长小鼠(56周)中甚至更明 显。实际上，在6小时后，和年龄匹配的野生型小鼠相比，年幼GPR39 小鼠的累积食物摄取降低0.62 g，年长GPR39小鼠的累积食物摄取 降低1.25 g。
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权利要求
1.一种鉴定调节胃肠动力和/或胆固醇代谢的化合物的方法，所述方法包括使用全部GPR39受体蛋白或部分GPR39受体蛋白。
2. 权利要求l的方法，其中所述GPR39受体蛋白选自SEQEDNO: 2、 SEQEDNO:4、具有前述SEQ ID的蛋白的剪接变体，以及与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少50%、优选至少 80%、 90%、 95%或98%序列同一性的氨基酸序列。
3. 权利要求1的方法，其中部分GPR39受体蛋白由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的多肽的至少10个氨基酸的片段组成。
4. 一种用于鉴定调节胃肠动力和/或胆固醇代谢的化合物的方 法，所述方法包括(i) 使表达全部GPR39蛋白或部分GPR39蛋白的宿主细胞与所 述化合物接触，和(ii) 检测所述化合物与所述受体蛋白的结合。
5. —种用于鉴定调节胃肠动力和/或胆固醇代谢的化合物的方 法，所述方法包括(i) 使表达全部GPR39蛋白或部分GPR39蛋白的宿主细胞的膜 制备物与所述化合物接触，和(ii) 检测所述化合物与所述受体蛋白的结合。
6. 权利要求4或5的方法，其中所述化合物与GPR39受体蛋白 的结合利用与待测化合物直接或间接结合的标记来^r测，或者以包 含与标记竟争物竟争的测定来检测。
7. 权利要求6的方法，其中所述标记竟争物是标记的肥胖抑制素。
8. —种鉴定调节胃肠动力和胆固醇代谢的化合物的方法，所述 方法包括(i)使全部GPR39蛋白受体或部分GPR39蛋白受体与待测化合 物4妄触，和(ii)测定GPR39受体蛋白的活性，其中在所述化合物存在下的 活性变化，说明所述化合物调节胃肠动力的能力。
9. 权利要求8的方法，其中在步骤i)中，所述化合物与表ii^又 利要求2或3所限定的全部GPR39蛋白或部分GPR39蛋白的宿主细 胞接触。
10. 权利要求8或9的方法，其中用对胞内信使的调节来测定所 述GPR39受体蛋白的活性。
11. 权利要求10的方法，其中所述胞内笫二信使是cAMP、钩 或报道基因产物。
12. 分离的核酸序列在权利要求1-11中任一项的方法中的用 途，所述核酸序列选自(i) 编码全部或部分的SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4多肽的核 酸序列，(ii) 由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3组成的核酸序列；或(iii) 与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的核酸序列具有至少80% 序列同一性的核酸序列。
13. 包含权利要求12限定的核酸序列的载体在权利要求1、 4、 5、 8或9中任一项的方法中的用途。
14. 包含权利要求12限定的核酸序列或包含权利要求13限定的 载体的宿主细胞在权利要求1、 4、 5、 8或9中任一项的方法中的用 途。
15. —种药物组合物，其用于治疗人或动物的胃排空延迟和结肠 蠕动延迟并且包含GPR39受体拮抗剂。
16. —种药物组合物，其用于治疗人或动物的胃排空增加和结肠 蠕动增加并且包含GPR39受体激动剂。
17. GPR39拮抗剂在制备用于治疗与胃排空延迟和结肠蠕动延迟 相关的疾病的药物中的用途。
18. GPR39激动剂在制备用于治疗与胃排空增加和结肠蠕动增加 相关的疾病的药物中的用途。
19. 一种药物组合物，其用于治疗人或动物的胆固醇水平升高并 且包含GPR39受体激动剂。
20. GPR39激动剂在制备用于治疗与胆固醇水平升高相关的疾病 的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及G蛋白偶联受体GPR39的功能特征，并涉及改变或调节GPR39蛋白活性的化合物。具体地说，本发明涉及GPR39激动剂或拮抗剂的筛选方法，以便鉴定能够调节胃肠动力和/或胆固醇代谢的化合物，并涉及这些化合物的治疗用途。本发明还涉及携带GPR39基因突变的转基因动物。
文档编号G01N33/68GK101107529SQ200580047118
公开日2008年1月16日 申请日期2005年11月30日 优先权日2004年12月1日
发明者B·C·J·-C·莫罗克斯, B·考利, D·W·E·莫查尔斯, I·I·T·德波特尔, T·L·H·皮特斯 申请人:詹森药业有限公司