专利名称：电位敏感性荧光染料的荧光强度测定方法
技术领域：
本发明涉及通过使用维生素E和/或胆固醇而使电位敏感性荧光染料的伴随电位或离子强度变化而产生的荧光敏化的方法或者使电位敏感性荧光染料的荧光强度增强的方法。本发明还涉及采用通过使用维生素E和/或胆固醇而得以敏化/增强的测定体系、 对培养心肌细胞的活动电位进行测定的方法。本发明还涉及使用在基材的表面进行固相化的电位敏感性荧光染料、无论有无使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体均能对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化进行测定的方法。本发明还涉及对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率敏化的物质或者使荧光强度增强的物质进行选择的方法。
背景技术：
心律不齐(arrhythmia),不仅会大大降低患者的生活质量,有时还是威胁患者生命的疾病。此外，在应对各种疾病的药剂开发中，检测出对心肌细胞的电活动带来影响的副作用(例如，心律不齐)，回避该副作用是非常重要的。到目前为止，为了进行抗心律不齐药的开发以及对影响心肌的电活动的作用的检查，使用了动物及动物来源心肌细胞。但是，这些由于存在种差的问题，因此还不是足以用于人体的方法(非专利文献I =Biochem Biophys Res Commun.，Vol. 385，p497_502，2009)。最近，随着对人ES细胞、人iPS细胞的开发，表明人心肌细胞是通过这两种细胞分化而得到的。若有能够使用这两种细胞简便地取得人心肌细胞的活动电位的方法，则在药物开发活动中担负重要的作用。作为用来测定这样的人ES细胞、人iPS细胞细胞来源的心肌细胞的活动电位的方法，有设想使用电位敏感性荧光染料的方法的情况，但在使用了电位敏感性荧光染料的分析中，人ES细胞来源心肌细胞和人iPS细胞来源心肌细胞均由于对电位敏感性荧光染料的灵敏度不够而无法测定细胞的活动电位。此外，一直使用的电位敏感性荧光染料只有在结合到细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体上的状态下才能测定电位。即，为了测定电位敏感性荧光染料的灵敏度，需要将水溶液中的电位敏感性荧光染料在细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体上进行固相化后对其进行实验，需要调制细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体。该方式中，作为膜载体，需要调制脂质双层膜脂质体或需要使用细胞，因此，实验体系变得复杂，并且可能会导致各种人为构造 (artifact)的介入。现有技术文献非专利文献非专利文献I Biochem Biophys Res Commun. , Vol. 385, ρ497~502, 2009
发明内容
发明要解决的问题本发明的目的在于开发使电位敏感性荧光染料的依赖于电位或离子强度变化的荧光强度的移位敏化的方法、和/或使电位或离子强度依赖性的荧光强度增强的方法。本发明的目的还在于对迄今为止尚不能测定的来自ES细胞及iPS细胞的心肌细胞的活动电位变化进行测定。本发明的目的还在于能够在不使用细胞或脂质双层膜脂质体等物质(膜载体)的情况下简便地测定电位敏感性荧光染料的荧光强度、电位依赖性的荧光强度变化量。本发明的目的还在于使用该方法、开发用来对使电位敏感性荧光染料的荧光强度增强的物质进行筛选的方法。
_0] 用于解决问题的方案本发明人等对各种物质进行筛�。⑾治谽具有增强电位敏感性荧光染料的灵敏度的作用，而维生素E及胆固醇这两者均具有增强电位敏感性荧光染料的荧光强度的作用。而且，还明确了这两种物质能够组合，能够在通过维生素E增强电位敏感性荧光染料的灵敏度的同时通过胆固醇(或者胆固醇和维生素E的组合)增强电位敏感性荧光染料的绝对荧光强度。即，本申请发明的发明人等基于这些见解提供了一种对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定的方法，其特征在于， 对电位敏感性荧光染料添加电离性化合物而赋予电位或离子强度变化，再添加维生素E和 /或胆固醇而使电位敏感性荧光染料的电位性或离子强度变化敏化。本发明人等还明确了通过利用上述电位敏感性荧光染料的敏化作用而使电位敏感性荧光染料的荧光强度敏化，从而能够对迄今为止尚不能测定的来自ES细胞及iPS细胞的心肌细胞等单细胞的活动电位进行测定，进而还能够对细胞内的部分活动电位的变化进行测定。本申请发明的发明人等基于这些见解提供了一种对培养心肌细胞的活动电位进行测定的方法，其特征在于，使电位敏感性荧光染料与培养液中的培养心肌细胞接触，向培养液中添加维生素E和/或胆固醇，对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定。本发明人等还新明确了电位敏感性荧光染料能够吸附在塑料表面、玻璃表面等基材表面上并进行固相化。这表明电位敏感性荧光染料是容易吸附在塑料表面、玻璃表面等基材表面上的物质。通过使用该固相化了的电位敏感性荧光染料，成功地开发出在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体存在下非常简便而且稳定且重现性高的、使用了电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化的测定体系。本申请发明的发明人等基于该见解提供了一种在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化进行测定的方法，其特征在于，在溶液中将电位敏感性荧光染料固定在基材的表面， 对上述溶液添加电离性化合物而赋予电位或离子强度变化，再对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定。本发明人等还在其他方案中明确了通过使用特定的物质从而能够增强电位敏感性荧光染料的荧光的灵敏度、增强电位敏感性荧光染料的绝对荧光强度，在此基础上，还明确了无论有无使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体均能对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化进行测定，在此基础上，明确了能够对可增强电位敏感性荧光染料的灵敏度的物质、可增强绝对荧光强度的物质进行筛选。本申请发明的发明人等基于该见解提供了一种对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率增强的物质进行选择的方法，其包括以下步骤(i)在溶液中将电位敏感性荧光染料固定于基材的表面，对上述溶液添加电离性化合物，然后对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离
5子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定，由此，在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体的存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度的基准值进行测定，( )在溶液中将电位敏感性荧光染料固定于基材的表面，对上述溶液添加电离性化合物和被检物质，然后对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定，由此，在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体的存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度的试验值进行测定，(iii)将⑴中得到的基准值与(ii)中得到的试验值进行比较， 在对于同一浓度的电离性化合物而言(ii)中得到的电位敏感性荧光染料的荧光强度高于
(i)中得到的荧光强度时、或者对于至少两个不同电离性化合物添加浓度而言(ii)中得到的荧光强度增加率高于(i)中得到的增加率时，对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率增强的被检物质进行选择。发明的效果在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体存在下进行的实验体系中以及在使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体的一直以来的实验体系中，均明确了通过维生素E能够使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光的灵敏度增强，而且通过维生素E及胆固醇这两者均能够使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度增强。
图I是表示在不存在作为膜载体的细胞的条件下在基材表面上进行固相化后的电位敏感性荧光染料以与离子强度成正比的荧光强度发光的图，基材的材质(玻璃或塑料)不限并且电位敏感性荧光染料的种类不限，均显示出荧光强度与所添加的电离性化合物(氯化钾)的浓度成正比地增加。图2是表示在不存在作为膜载体的细胞的条件下在基材表面上进行固相化后的电位敏感性荧光染料以与离子强度成正比的荧光强度发光的图，在Di8-ANEPPS (a)及 RH237(b)中显示出产生与所添加的电离性化合物(氯化钾)的浓度成正比的荧光强度变化。图3是表示维生素E作为具有使电位敏感性荧光染料的电位依赖性荧光强度变化率增加的作用(敏化作用)的物质发挥作用、以及胆固醇和维生素E这两者均作为电位敏感性荧光染料的电位依赖性荧光强度的增强物质发挥作用的图。图4是表示维生素E作为具有使电位敏感性荧光染料的电位依赖性荧光强度变化率增加的作用(敏化作用)的物质发挥作用、以及胆固醇和维生素E这两者均作为电位敏感性荧光染料的电位依赖性荧光强度的增强物质发挥作用的图。图5是表示维生素E及胆固醇能够在使用细胞作为膜载体的条件下也同样地显示出电位敏感性荧光染料的敏化作用或增强作用的图。
具体实施例方式电位敏感性荧光染料是用来测定心肌细胞、神经细胞的活动电位而有用的物质。 迄今为止报道了各种电位敏感性荧光染料物质。使用这些电位敏感性荧光染料而通过荧光强度来分析活动电位的特性这样的一直以来进行的方法，是使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜结构(膜载体)测定细胞膜内外的电位差的方法。在这些一直以来进行的方法中，一般使用的是与其使用具有自律性电活动性的细胞，不如使用不具有电活动性的细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体，从细胞外添加电离性化合物，生成电位差，并基于此进行的定量分析方法。为了使用电位敏感性荧光染料测定电位而使用细胞的理由追溯为原本电位敏感性荧光染料是以测定细胞膜电位差为目的的，为了达成该目的而进行开发以获得向细胞膜的闻迁移性。本发明人等为了探索出能够以更高灵敏度检测出活动电位变化的添加物，首先， 按照以往的方法，通过使用细胞作为膜载体的方法进行了测定。在为了增强电位敏感性荧光染料的荧光强度而增加电位敏感性荧光染料的添加浓度时，产生以下现象与细胞上的荧光强度相比，反而是细胞培养皿上的荧光强度增加，即，背景的荧光强度增加。该现象暗示着由对细胞培养皿的基材表面固定电位敏感性荧光染料这一现象所产生。迄今为止，认为需要将电位敏感性荧光染料在细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体上进行固相化后对其进行实验，能够在塑料、玻璃等基材的表面进行固定化是完全无法预期的现象。基于该见解，本申请发明人等使电位敏感性荧光染料黏附于塑料、玻璃等细胞黏附性基材表面，以此来代替将电位敏感性荧光染料在细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体进行固相化，除此以外，按照以往的方法，对依赖于与电离性化合物的添加相伴的电离性化合物的浓度(即，离子强度)的荧光强度变化进行了测定。其结果发现，即使不使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体，荧光强度也与电离性化合物的浓度(离子强度)依赖性地增强。 由此，能够简便地测定电位敏感性荧光染料的荧光强度、电位依赖性的荧光强度变化量。S卩，本发明的一个方式中表明在溶液中将电位敏感性荧光染料固定在基材的表面，对上述溶液添加电离性化合物，然后对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定，由此能够提供在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化进行测定的方法。这里，电位敏感性荧光染料可以为任意该技术领域中一般可获得的电位敏感性荧光染料，例如可以使用选自由ANEPPS类、ANRPEQ类及RH类等构成的苯乙烯系电位敏感性荧光染料；由DiSC类、DiOC类、DiIC类、DiBAC类、DiSBAC类等构成的cyanine系、oxonol系的电位敏感性荧光染料；以及Rh 123、TMRM、TMRE等rhodamine衍生物的电位敏感性荧光染料中的电位敏感性荧光染料。本发明中，更优选使用由ANEPPS类、ANRPEQ类及RH类等构成的苯乙烯系电位敏感性荧光染料，具体而言，可以使用di-8-ANEPPS、di-4-ANEPPS、RH-237、 RH-1691、di-5-ASP、RH-160, RH-421, RH-795, di-4-ANEPPDHQ、ANNINE-5 或 ANNINE-6 作为优选的电位敏感性荧光染料。对在溶液中固定于基材表面的电位敏感性荧光染料添加的电离性化合物，只要是在溶液中电离而离子化的物质则任意物质均可使用。即，只要为仅仅以钾、钠、钙、碳酸氢根离子、氯离子、氢氧根离子及铵离子等生体组织液或细胞内液所含的离子为构成要素的电离性化合物即可。本发明中，例如可以使用氯化钾、氯化钙或氯化钠作为优选的电离性化合物。就塑料及玻璃等基材表面而言，无需实施特别处理，或者也可以实施表面处理以使细胞易黏附。对这些基材的表面以适当的电位敏感性荧光染料浓度(例如使用ANEPPS类电位敏感性荧光染料时为100 μ M以下的浓度)、在适当的时间(例如ANEPPS类为15分钟)、适当的温度下(例如ANEPPS类为20°C )进行处理。用任意水溶液对处理后的表面洗涤最少3次，由此，去除未被固定的电位敏感性荧光染料。本发明中还通过使用在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化进行测定的上述方法，从而能够使一直以来使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体进行的利用电位敏感性荧光染料的对电位或离子强度变化的测定在体外非常简便地进行。因此，为了对使电位敏感性荧光染料的荧光强度变化增强的物质及容易检测出荧光强度变化的物质进行筛�。褂昧松鲜龇椒�。即，表明能够提供使用了上述方法的、使电位敏感性荧光染料的荧光强度改变的物质(即，使荧光强度增强的物质或使荧光强度降低的物质)及容易检测出荧光强度变化的物质(即，容易检测出荧光强度变化上升的物质或容易检测出荧光强度变化降低的物质)的筛选方法。即，提供一种对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率改变的物质进行选择的方法，该方法包括以下步骤(i)在溶液中将电位敏感性荧光染料固定于基材的表面，对上述溶液添加电离性化合物，然后对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定，由此，在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度的基准值进行测定，(ii)在溶液中将电位敏感性荧光染料固定于基材的表面，对上述溶液添加电离性化合物和被检物质，然后对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定，由此，在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度的试验值进行测定，(iii)将(i)中得到的基准值与(ii)中得到的试验值进行比较，对于同一浓度的电离性化合物而言Qi)中得到的电位敏感性荧光染料的荧光强度高于Q)中得到的荧光强度时，或者对于至少两个不同电离性化合物添加浓度而言(ii)中得到的荧光强度增加率高于(i)中得到的增加率时，对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率改变的被检物质进行选择。这里，使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率 “改变”的情况可以为使该变化率增强的情况以及使该变化率降低的情况中的任一种情况。 本发明中，分别优选使电位敏感性荧光染料的荧光强度增强的物质及容易检测出荧光强度增加的物质。在使用细胞作为膜载体的以往的筛选方法中，难以辨别物质是作用于细胞中存在的离子通道等蛋白质还是与电位敏感性荧光染料直接相互作用，而在本申请发明所述的上述筛选方法中，由于与以往的方法不同、不存在细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体，因此， 可以选择与该染料直接相互作用的物质。作为上述方法的(ii)中的被检物质添加了多种物质，对各个物质是增强电位敏感性荧光染料的荧光强度的物质还是容易检测出荧光强度变化的物质进行了调查。其结果发现，特征不同的两种物质维生素E及胆固醇能够增强电位敏感性荧光染料的荧光强度。 对这两种物质的作用进行了详细地研究，结果表明维生素E具有增强电位敏感性荧光染料的灵敏度的作用，维生素E及胆固醇这两者均具有增强电位敏感性荧光染料的荧光强度的作用。在该筛选体系中，通过采用不使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体的实验体系，能够采集到基于染料与物质的直接相互作用而产生的荧光强度变化。因此明确了维生素E及胆固醇不在膜的作用、膜电位的辅助下通过直接作用于染料能够增强对周边离子的灵敏度及荧光强度。此外，从维生素E及胆固醇的性质来看，不仅可期待维生素E衍生物及胆固醇衍生物容易地发挥出类似的功能，而且可期待丁基化羟基甲苯、水溶性维生素E(tr0l0X)、儿茶素、奸青素等的衍生物及公知文献(Advances in Drug Research, Vol. 28,1996, pp65_138 及Toxicology, Vol. 180, 2002, pp 151-167等)中记载的化合物、其衍生物等脂溶性抗氧化物质也容易地发挥出类似的功能。在对影响荧光强度及电位依赖性荧光强度变化量的物质进行筛选时，可对溶液添加要固相化的任意染料物质并通过上述方法进行处理。在这些筛选体系中，对维生素E及胆固醇的浓度以及荧光强度的敏化作用或增强作用进行了确认，结果发现维生素E在以 500 μ M 5 μ M的浓度使用时能够增强电位敏感性荧光染料的灵敏度，而且能够同时增强电位敏感性荧光染料的荧光强度。此外，还发现同样发现的胆固醇在以500μΜ 5μΜ的浓度使用时能够增强电位敏感性荧光染料的荧光强度。进而表明使用由这样的筛选方法得到的灵敏度增强物质、荧光强度增强物质，能够比以往的方法更高灵敏度地测定E S细胞及iPS细胞来源心肌细胞的多细胞群及单一细胞、以及细胞内的一部分中的活动电位变化。具体而言表明，使电位敏感性荧光染料接触培养液中的培养心肌细胞，在培养液中添加维生素E和/或胆固醇，对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定，由此对培养心肌细胞的活动电位进行测定，从而能够实现比以往方法更高灵敏度地测定。为了测定心肌细胞的活动电位，对塑料、玻璃等基材表面进行任意的细胞黏附促进处理，黏附培养心肌细胞。对于经黏附培养的细胞，通过在培养液中添加电位敏感性荧光染料从而对细胞进行染色，再分别以500 μ M 5 μ M的浓度添加维生素E和/或胆固醇。此时，可以单独使用维生素E，也可以单独使用胆固醇，还可以组合使用维生素E和胆固醇。作为荧光显微镜，可以使用能够在该技术领域中使用的任意的荧光显微镜，使用例如1X71 (OLYMPUS株式会社)。而且，在使用荧光显微镜1X71 (OLYMPUS株式会社)时，作为光源装置，使用汞灯(OLYMPUS株式会社)或LED光源(OLYMPUS株式会社)。此外，有关荧光图像的采集及成像以及数值计算，只要是能够在该技术领域中使用的成像及数值计算用的分析软件则可以使用任意的分析软件，本发明中使用MiCAM02系统(brainvision株式会社)。综合这些结果表明在无细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体存在下进行的实验体系中以及在使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体的一直以来的实验体系中，均可通过维生素E来增强电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度的灵敏度，而且通过维生素E及胆固醇这两者均能够使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度增强。因此新表明本发明能够在实验体系不限的情况下提供一种对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定的方法，其特征在于，对电位敏感性荧光染料添加电离性化合物而赋予电位或离子强度变化，再添加维生素E和/或胆固醇而无论有无使用膜载体均可使电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化敏化。实施例通过以下实施例对本发明进行更详细地说明。但是，以下的实施例为本发明的例示，其意图不在于限定本发明。实施例I :使用在基材表面进行固相化的电位敏感性荧光染料的荧光强度、电位依赖性荧光强度变化测定方法的构建本实施例中示出了将电位敏感性荧光染料在透明塑料及玻璃等基材表面进行固相化的方法以及在基材表面进行固相化后的电位敏感性荧光染料的荧光强度、电位依赖性荧光强度变化的测定方法。在含有终浓度10%的胎牛血清(SAFC Biosciences, Lenexa, Kansas, USA)的 MEM-BASE 培养基(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA)中混合 50 μ M 的电位敏感性荧光染料(Di8-ANEPPS或Di4-ANEPPS ;均为Invitrogen)，将其用O. 22 μ m注射器式滤器(MiIlipore, Massachusetts, USA)进行过滤,从而制作电位敏感性突光染料溶液。对3. 5cm 塑料培养皿(BD，New Jersey, USA)及 3. 5cm 玻底培养皿(IWAKI，Asahi Glass Co.，Ltd.，Tokyo, Japan)分别添加Iml量的电位敏感性荧光染料溶液，在20°C下对表面处理15分钟。将处理过的表面用加温至37°C的不含电位敏感性荧光染料的上述溶液洗涤最少3次，由此去除未被固相化的电位敏感性荧光染料。将培养基换成含50 μ M 的 Mn-TBAP (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)及 992 μ M 的 Trolox (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. , Osaka, Japan)的含10%胎牛血清的MEM-BASE,使用突光显微镜系统1X71 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan)及萊灯(Olympus Corporation, Tokyo, Japan)或 LED 光源(Olympus Corporation, Tokyo, Japan),采集突光信号，使用 MiCAM02 系统(Brainvision Inc. , Tokyo, Japan),实施成像及数值计算。为了赋予溶液中的电位变化，在溶液中添加氯化钾溶液使其终浓度为0、5、10、15、 20mM。添加氯化钾后，静置I分钟，对各个培养皿表面(电位敏感性荧光染料存在部位)的荧光强度进行了测定。在培养皿上不同的3点采集各浓度下的荧光强度，求得荧光强度的平均值、标准偏差。将上述数据标绘在图表上，对荧光强度及荧光强度变化绘制了图表(图 I)。图I中，(a)表示在塑料皿表面上对Di8_ANEPPS进行固相化的情况；(b)表示在塑料皿表面上对Di4-ANEPPS进行固相化的情况；以及(c)表示在玻璃皿表面上对 DiS-ANEPPS进行固相化的情况。从这些结果可知，基材的材质(玻璃或塑料)不限而且电位敏感性荧光染料的种类不限，荧光强度均与所添加的电离性化合物(氯化钾)的浓度成正比地增加。此外，为了求得电位敏感性荧光染料的可使用的浓度范围，分别使用ΙΟμΜ或 100 μ M的Di8-ANEPPS及RH237 (均为Invitrogen)，添加于3. 5cm塑料培养皿的表面上，再在溶液中添加氯化钾溶液使其终浓度为O、5、10、15、20mM,进行同样的研究，并将所得的结果绘制成图表(图2)。
图2 中，(a)表示使用 10 μ M Di8_ANEPPS 和 100 μ MDi8_ANEPPS 时的数据，(b)表示使用ΙΟμΜ RH237和ΙΟΟμΜ RH237时的数据。由这些结果可知，产生了与所添加的电离性化合物(氯化钾)的浓度成正比的荧光强度变化。实施例2 :使用了在基材表面进行固相化的电位敏感性荧光染料的荧光强度、电位依赖性荧光强度变化(灵敏度)增强物质的筛选本实施例中对使实施例I中记载的电位敏感性荧光染料的荧光强度及电位依赖性荧光强度变化率(灵敏度)增强的物质进行了筛�。⑹境隽硕跃哂懈髯缘淖饔玫奈镏式屑ǖ姆椒�。按照实施例I中记载的方法调制了 100 μ M的Di8_ANEPPS的溶液作为电位敏感性荧光染料溶液，在该溶液中添加75 μ M的维生素E (和光纯药)、75 μ M的胆固醇(和光纯药) 或者它们的组合。对于维生素E添加组(图3 “VE 18. 75 μ Μ”)、胆固醇添加组(图3 “Cho
18.75 μ Μ”)、维生素E+胆固醇添加组(图3 “double”)以及对照组(图3 “di_8”)，分别与实施例I的方法同样地使用在溶液中添加氯化钾溶液使其终浓度为0、5、10、15、20mM的方法，对电位依赖性的荧光强度变化量及电位依赖性的荧光强度进行了测定。将其结果绘制成图表，图示于图3(图3)。图3中，(a)表示荧光强度的变化率；(b)表示荧光强度的测定值；而且在各自的图中，“ ”表示对照组(仅DiS-ANEPPS)，“■”表示维生素E添加组，“▲”表示胆固醇添加组，以及“ ”表示维生素E+胆固醇添加组。图3(a)中对与未添加氯化钾时相比的荧光强度的变化率进行了调查，结果表明 维生素E具有增强电位敏感性荧光染料的荧光的灵敏度的作用(即，敏化作用)。此外，图3(b)中对与各个氯化钾浓度相比的荧光强度的增加进行了调查，结果表明维生素E及胆固醇均具有增强电位敏感性荧光染料的荧光强度的作用。进而，通过混合使用维生素E和胆固醇，能够使荧光强度相加性地增强，并且能够兼具来自维生素E的增加电位依赖性荧光强度变化率的作用(敏化作用)。该结果表明本说明书中记载的使电位敏感性荧光染料的荧光强度增强的物质和/或使电位依赖性荧光强度变化率增加的物质的筛选体系是非常优异的方法。进而，图4中，为了求得胆固醇和维生素E的可使用的浓度范围，对ΙΟΟμΜ的 Di8-ANEPPS溶液分别添加了 5 μ M、18. 7 μ M或500 μ M的维生素E或者18. 8 μ M或238 μ M 的胆固醇，添加于3. 5cm塑料培养皿的表面上，再在溶液中添加氯化钾溶液使其终浓度为
0、10、20、30、40、50mM，进行了同样的研究，将所得的结果绘制成图表(图4)。由此可见，胆固醇可得到依赖于浓度的荧光强度的增强，而维生素E的荧光强度、 荧光强度变化率均不依赖于浓度，至少在18. 7 μ M 500 μ M的范围内，使荧光强度增加I. 5 倍左右，使荧光强度变化率增加3倍左右。进而可知，维生素E即使在5 μ M的低浓度下也具有使荧光强度变化率增加的作用。实施例3 :来自人ES细胞及人iPS细胞的心肌细胞的活动电位测定本实施例中，从人ES细胞及人iPS细胞分化出心肌细胞，将分化出的心肌细胞在酶的作用下进行分散培养，对采集其活动电位时的维生素E及胆固醇的作用进行了研究。人胚胎干细胞(ES细胞)从京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心 (由日本国家生物资源项目主办的胚胎干细胞中心)获得。人诱导性多功能干细胞(iPS细胞)从京都大学物质细胞统合系统据点iPS细胞研究中心获得。使用经由丝裂霉素C处理而增殖钝化的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast ；MEF)对该人干细胞进行未分化维持培养。另外，该MEF细胞使用来自妊娠14 日的ICR小鼠(CLEA Japan, Inc.)的胎仔的材料(将内脏和头部完全去除后的剩余部分)， 可以将其用W02006/022377中记载的方法进行分散处理而得到离散细胞。作为培养液，使用组成为F12/DMEM(1 : I) (Sigma-Aldrich Corporation,产品编号 D6421) ,20% KO-SERUM(GIBC0, Life Technologies Foundation, Maryland, USA)、 I. 6mM L-谷氨酸胺、0. ImM非必需氨基酸(MEM)、0· ImM β -疏基乙醇(2-ME ;Sigma-Aldrich Corporation)、100IU/ml青霉素、100 μ g/ml硫酸链霉素及10ng/ml的重组人碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF ；PeproTech Inc. ,New Jersey,USA)的培养液。在传代培养时，用0. 1% III 型胶原酶(Worthington Biochemical Corporation,New Jersey,USA)在 37°C处理 10 分钟分离出胚胎干细胞菌落。接着，为了分离MEF和胚胎干细胞，取得孔径40 μ m的网孔的非通过细胞块(胚状体，EB)。该细胞块即为纯胚胎干细胞块。分化时，将每个EB为50 1000个的胚胎干细胞块在细胞非黏附性细菌培养皿(AGC TECHNO GLASS CO. ,LTD. , Chiba, Japan :灭菌培养皿) 上以胚状体的状态培养共15 30天，使其分化成含有心肌细胞的胚状体。进而，使用W02006/022377中记载的方法对心肌细胞进行分散处理。S卩，用胶原酶和胰蛋白酶对胚状体进行处理，得到离散的单细胞。将其悬浮于含有10%血清的 a MEM (Sigma-Aldrich Corporation)中，接种到表面用O. 001%纤连蛋白(Sigma-Aldrich Corporation)在37°C涂敷处理I小时后的3. 5cm塑料培养皿(BD)及3. 5cm玻底培养皿 (IffAKI7Asahi Glass Co.，Ltd.)中。黏附的心肌细胞发生自律性搏动。不使用维生素E及胆固醇对活动电位进行了测定，以及按照实施例2，用电位敏感性荧光染料及18. 75 μ M的维生素E和/或18. 75 μ M的胆固醇对培养细胞进行处理，测定荧光强度的经时性变化。由此，能够取得单一细胞的活动电位及来自单一细胞的一部分的活动电位(图5)。图5(a)表示不使用维生素E及胆固醇对分离出的人ES细胞来源心肌细胞进行测定的情况；图5(b)表示分离出的人ES细胞来源心肌细胞的活动电位的取得；以及图5(c) 表示分离出的人iPS细胞来源心肌细胞的活动电位的取得。该结果表明，在不添加维生素E及胆固醇的条件下无法检测出的单细胞ES细胞来源心肌细胞的活动电位波形可通过这些物质的添加而得以观察到。此外还表明在不存在细胞作为膜载体的条件下具有电位敏感性荧光染料的敏化作用或增强作用的维生素E及胆固醇，在使用细胞作为膜载体的条件下也同样能够显示出电位敏感性荧光染料的敏化作用或增强作用。
权利要求
1.一种对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定的方法，其特征在于，对电位敏感性荧光染料添加电离性化合物而赋予电位或离子强度变化，再添加维生素E和/或胆固醇而使电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化敏化。
2.根据权利要求I所述的方法，其单独添加500μ M 5 μ M的维生素E ;或者组合添加 500 μ M 5 μ M的维生素E和500 μ M 5 μ M的胆固醇。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中，电位敏感性荧光染料选自由ANNINE类构成的Anellated Hemicyanine系的电位敏感性突光染料，由BNBIQ类构成的biaryl hemicyanine系的电位敏感性荧光染料，以及由ANEPPS类、ANRPEQ类及RH类构成的styryl hemicyanines系的电位敏感性突光染料。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，电位敏感性荧光染料选自di-8-ANEPPS、 di-4-ANEPPS、RH-237、RH-1691、di-5-ASP、RH-160, RH-421、RH-795、di-4-ANEPPDHQ、 ANNINE-5 及 ANNINE-6 组成的组。
5.根据权利要求I 4中任一项所述的方法，其中，电离性化合物选自由氯化钾、氯化钙及氯化钠组成的组。
6.一种对培养心肌细胞的活动电位进行测定的方法，其特征在于，使电位敏感性荧光染料与培养液中的培养心肌细胞接触，向培养液中添加维生素E和/或胆固醇，对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，培养心肌细胞为原代培养心肌细胞、胚胎干细胞来源心肌细胞、单一胚胎干细胞来源心肌细胞、诱导性多功能干细胞(iPS细胞)来源心肌细胞或单一诱导性多功能干细胞来源心肌细胞。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其单独添加500μ M 5 μ M的维生素E ;或者组合添加500 μ M 5 μ M的维生素E和500 μ M 5 μ M的胆固醇。
9.根据权利要求6 8中任一项所述的方法，其中，电位敏感性荧光染料选自由 ANNINE类构成的Anellated Hemicyanine系的电位敏感性荧光染料，由BNBIQ类构成的 biaryl hemicyanine系的电位敏感性荧光染料，以及由ANEPPS类、ANRPEQ类及RH类构成的styryl hemicyanines系的电位敏感性突光染料。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，电位敏感性荧光染料选自由di-8-ANEPPS、 di-4-ANEPPS、RH-237、RH-1691、di-5-ASP、RH-160, RH-421、RH-795、di-4-ANEPPDHQ、 ANNINE-5 及 ANNINE-6 组成的组。
11.一种在无膜载体存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化进行测定的方法，其特征在于，在溶液中将电位敏感性荧光染料固定于基材的表面，对上述溶液添加电离性化合物而赋予电位或离子强度变化，再对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，基材为塑料或玻璃。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，电位敏感性荧光染料选自由ANNINE 类构成的Anellated Hemicyanine系的电位敏感性突光染料，由BNBIQ类构成的biaryl hemicy anine系的电位敏感性荧光染料，以及由ANEPPS类、ANRPEQ类及RH类构成的styryl hemicyanines系的电位敏感性突光染料。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，电位敏感性荧光染料选自由di-8-ANEPPS、 di-4-ANEPPS、RH-237、RH-1691、di-5-ASP、RH-160, RH-421、RH-795、di-4-ANEPPDHQ、 ANNINE-5 及 ANNINE-6 组成的组。
15.根据权利要求11 14中任一项所述的方法，其中，电离性化合物选自由氯化钾、氯化钙及氯化钠组成的组。
16.一种对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率改变的物质进行选择的方法，其特征在于，包括以下步骤(i)在溶液中将电位敏感性荧光染料固定于基材的表面，对上述溶液添加电离性化合物而赋予电位或离子强度变化，然后对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定，由此，在无膜载体存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度的基准值进行测定，( )在溶液中将电位敏感性荧光染料固定于基材的表面，对上述溶液添加电离性化合物和被检物质，然后对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定，由此，在无膜载体存在下对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度的试验值进行测定，(iii)将(i)中得到的基准值与(ii)中得到的试验值进行比较，在对于同一浓度的电离性化合物而言(ii)中得到的电位敏感性荧光染料的荧光强度高于(i)中得到的荧光强度时、或者对于至少两个不同电离性化合物添加浓度而言(ii)中得到的荧光强度增加率高于(i)中得到的增加率时，对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率改变的被检物质进行选择。
17.根据权利要求16所述的方法，对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率增强的被检物质进行选择。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，被选择的被检物质为维生素E或胆固醇。
19.根据权利要求16 18中任一项所述的方法，其中，基材为塑料或玻璃。
20.根据权利要求16 19中任一项所述的方法，其中，电位敏感性荧光染料选自由 ANNINE类构成的Anellated Hemicyanine系的电位敏感性荧光染料，由BNBIQ类构成的 biaryl hemicyanine系的电位敏感性荧光染料，以及由ANEPPS类、ANRPEQ类及RH类构成的styryl hemicyanines系的电位敏感性突光染料。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，电位敏感性荧光染料选自由di-8-ANEPPS、 di-4-ANEPPS、RH-237、RH-1691、di-5-ASP、RH-160, RH-421、RH-795、di-4-ANEPPDHQ、 ANNINE-5 及 ANNINE-6 组成的组。
22.根据权利要求16 21中任一项所述的方法，其中，电离性化合物选自氯化钾、氯化钙及氯化钠组成的组。
全文摘要
本发明的课题在于开发一种使电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化敏化的方法。本发明的课题还在于对迄今为止尚不能测定的ES细胞及iPS细胞来源心肌细胞的活动电位变化进行测定。本发明人等对各种物质进行筛选，发现维生素E具有增强电位敏感性荧光染料的灵敏度的作用，胆固醇具有增强电位敏感性荧光染料的荧光强度的作用。而且，还明确了这两种物质能够组合，能够在通过维生素E增强电位敏感性荧光染料的灵敏度的同时通过胆固醇增强电位敏感性荧光染料的绝对荧光强度。
文档编号G01N21/64GK102612644SQ20108004957
公开日2012年7月25日 申请日期2010年10月29日 优先权日2009年10月30日
发明者佐藤裕介, 服部文幸, 福田惠一 申请人:学校法人庆应义塾, 第一三共株式会社
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