专利名称：一种检测类猪圆环病毒p1抗体的间接elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测类猪圆环病毒Pl (即类猪圆环病毒2型因子Pl)抗体的间接ELISA试剂盒，属于兽医生物技术领域。
背景技术：
类猪圆环病毒Pl为一种新近发现的病毒，基因组为单股环状DNA，仅由648个核苷酸组成，除10余个核苷酸外，大部分核苷酸序列与引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease, PCVAD)的原发性病原猪圆环病毒 2 型(porcine circovirus type 2)的高度同源(Wen 等 Complete genome sequence of a novel porcine circovirus-like agent. J Virol 2012, 86(1): 639),已开始在中国养猪场流行(Wen 等 Prevalence of porcine circovirus-like agent Pl in Jiangsu, China. Virol J 2011，8: 543-547)。人工感染Pl的猪表现出类似PCVAD中猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的症状，临床可见感染猪皮肤苍白、腹泻等，病毒可引起猪淋巴结出血、膀胱黏膜出血、脑充血、肺萎缩及出血等解剖变化，病毒分布在感染猪的脑、胰、肺、肝、心等组织中，严重�：ψ兄淼慕】�(Wen等A novel porcine circovirus-like agent Pl is associated with wasting syndromes in pigs. PLoS ONE 2012，7(8) : e41565)。
对于新发疫病的诊断和防制工作是科研工作者首要解决的关键，目前只有通过 PCR技术扩增Pl病毒的核酸来诊断，建立该病毒的抗体检测方法，对该病的流行病学调查、 免疫效果的评价等极有意义，而ELISA因具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、易于基层推广等特点而倍受欢迎，成为目前应用最广泛的一种血清学检测方法。由于目前Pl病毒尚不能在体外培养中得到很好的增殖，所以通过分子生物学方法大量表达Pl的抗原蛋白并以此作为包被抗原建立检测猪血清中抗Pl抗体的ELISA成为最佳选择。
经过基因组结构分析,分析Pl编码的衣壳蛋白(capsid protein, Cap)的N端部分与PCV2的Cap高度同源，而C端部分由于Pl基因组存在I个核苷酸缺失而导致与PCV2 的Cap无同源性，但C端的氨基酸较�。诒泶�、纯化等过程中比较困难鉴别，因此本发明通过pET-28a(+)表达载体构建三个重复的PlCap C端基因的原核表达载体，并利用表达后纯化的重组蛋白建立检测相应抗体的间接ELISA方法。发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种能快速、简便地检测类猪圆环病毒Pl血清抗体的间接ELISA 试剂盒，即利用pET-28a(+)原核表达载体，构建了能表达类猪圆环病毒Pl部分衣壳蛋白基因的载体，并将表达的重组蛋白纯化后包被ELISA板，以检测猪血清中Pl抗体水平。
技术方案本发明通过以下步骤实现4I)利用基因工程重组技术构建类猪圆环病毒Pi部分衣壳蛋白的原核表达质粒，命名为pET-28a-3p Cap ;是由以下方法构建而成的，设计了三对含有不同酶切位点的引物Al :5，-TTATCCATGGGCCACCACCACCACCACCACACTACTCCTCCCGCCAT ACAAT-3’ ；Nco IA2 :5’-GCCGAATTCGCCAAAGCTGATTCTT-3’ ；BcoR IBI :5’-ATGAATTCACTACTCCTCCCGCCATAC-3’ ；BcoR IB2 :5’-TTGGAGCTCGCCAAAGCTGATTCCT-3’ ；Sac ICl :5’-ATAGAGCTCACTACTCCTCCCGCCATACAAT-3’ ； Sac I C2 :5’-CGAAGCTTATTAGCCAAAGCTGATTCCTTTTGTT-3’ ； Hiη III 利用上述三对特异性引物，分别从包括GenBank登录号为EF514716的Pl基因组全长质粒中扩增相同的基因片段，分别可得到165 bp、143 bp和147 bp的扩增片段分别可得到165 bp、143 bp和147 bp，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和 pET-28a ( + )载体进行酶切，用T4 DNA连接酶顺次将3段重复片段连接到pET_28a ( + )上。 具体来说，首先将pET-28a( + )载体和Al与A2引物扩增的片段分别经Afco I和I酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pET-28a-lp Cap载体；然后将该载体和BI与B2引物扩增的片段分别经I和Sac I酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA 连接酶连接，构建pET-28a-2p Cap载体；最后将pET-28a_2p Cap载体和Cl与C2引物扩增的片段分别经5^ I和历id III酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA连接酶连接，构建 pET-28a-3p Cap载体，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态中，提取质粒，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序鉴定。
挑取经Afco I和历/2d III双酶切出420 bp条带的质粒(此与预计的Pl Cap基因部分序列的3个重复片段165 bp、143 bp和147 bp经酶切连接后的片段大小一致)进行测序，测序结果表明所选基因的3个重复片段已按照预先设计的不同内切酶的位点相连， 并且也与pET-28a( + )载体正确相连，表达蛋白的阅读框正确，结果表明重组原核表达载体质粒pET_28a_3p Cap构建成功。
2)将质粒pET-28a_3p Cap转化宿主菌大肠杆菌BL21中成为基因工程菌(命名为 BLpET-28a-3p Cap)，将BLpET_28a_3p Cap在LB培养基中培养，经ImM IPTG诱导表达并经 SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中；所述的类猪圆环病毒Pl重组衣壳蛋白的原核表达质粒pET-28a-3p Cap表达的重组蛋白序列如下I MGHHHHHHTTPPAIQSPNPS21 PTTPVTSHPNLFLTPLLITS41 NQITKRISFGEFTTPPAIQS61 PNPSPTTPVTSHPNLFLTPL81 LITSNQITKGISFGELTTPP101 AIQSPNPSPTTPVTSHPNLF121 LTPLLITSNQITKGISFG其中第9位——50位，第53位——94位以及97位——138位为3个重复的氨基酸片段。
3)将重组蛋白通过Ni+亲和层析进行纯化,Western blot分析表明重组蛋白具有良好的免疫学活性；4)以重组蛋白为包被抗原制备ELISA检测板，检测猪血清中类猪圆环病毒Pl的抗体水平；(1)包被将纯化复性后的重组蛋白用抗原包被液(O.05M，pH9. 6的碳酸盐缓冲液)稀释为2. 62 μ g/ml的终浓度，每个ELISA孔加入100 μ 1，4°C条件下包被过夜，PBST缓冲液 (含 O. 01%Tween-20 的 PBS 缓冲液)洗涤 5minX3 次；(2)封闭每孔加封闭液(含1%牛血清白蛋白的PBST缓冲液)100μ 1，37°C条件下作用 lh, PBST缓冲液洗涤5minX3次；(3)加待检血清每孔加入100μ I用含有5%脱脂奶粉的PBS按1:100倍稀释后的血清，37°C条件下作用I. 5h，PBST缓冲液洗涤5minX3次；(4)加二抗每孔加入100μ I稀释的HRP标记的羊抗猪IgG(用ρΗ7· O的PBS按1:5000 比例稀释)，37°C条件下作用45 min, PBST缓冲液洗涤5minX3次；(5)加显色液每孔加含lmg/mlTMB(四甲基联苯二胺)的显色液100 μ 1，37°C避光作用 4 min ；(6)加终止液每孔加入100μI终止液(2M H2SO4),酶标仪测定450 nm吸光值 (0D450)；(7)结果判定待检血清0D450值>O. 345时判定为类猪圆环病毒Pl抗体阳性，0D450 值Z O. 345判定为阴性。
有益效果本发明方法首次利用分子生物学基因克隆表达技术，获得Pl重组蛋白Cap，以重组蛋白为抗原建立间接ELISA，可对目前我国流行的类猪圆环病毒Pl进行有效的诊断，判断猪群中Pl抗体水平和自然感染的状况，为Pl病毒的防制提供一种快速、简便的检测方法。
试验证明，本发明首次利用表达和纯化后的重组蛋白(3pCap)作为抗原包被 ELISA板建立的间接ELI SA方法，确实可以检测到猪体内抗类猪圆环病毒PI抗体，且具有良好的特异性和重复性。对临床样品进行检测，结果表明本方法可以作为类猪圆环病毒Pl血清学检测的一种方法而运用到生产实际中。
图I重组蛋白表达和纯化后的SDS-PAGE分析图2免疫印迹试验显示Pl Cap蛋白具体实施方式
本发明的要点是利用pET_28a构建部分Pl Cap基因的原核表达载体，并将表达后的重组蛋白进行纯化，建立间接ELISA检测试剂盒和检测方法，并运用与临床检测。
包被抗原的制备I. I特异性引物设计与合成根据GenBank收录的本实验室上传的类猪圆环病毒Pl (即类猪圆环病毒2型因子P1，公知公用，见温立斌等,一株类猪圆环病毒2型因子Pl的全基因组序列测定与分析，中国农业科学，2010年02期)基因序列(GenBank登录号为 EF514716)，选取编码Pl病毒衣壳蛋白的开放阅读框0RF2的后半段基因，利用Primer6Premier 5. O软件设计了三对含有不同酶切位点的引物并提交上海英骏公司进行合成。
Al :5’ -TTATCCATGGGCCACCACCACCACCACCACACTACTCCTCCCGCCAT ACAAT-3’ ； (.Nco I)A2 :5’ -GCCGAATTCGCCAAAGCTGATTCTT-3’ ； (.EcoR I)BI :5’ -ATGAATTCACTACTCCTCCCGCCATAC-3’ ； (.EcoR I)B2 :5’ -TTGGAGCTCGCCAAAGCTGATTCCT-3’ SSac I)Cl :5’ -ATAGAGCTCACTACTCCTCCCGCCATACAAT-3’ SSac I)C2 :5’ -CGAAGCTTATTAGCCAAAGCTGATTCCTTTTGTT-3’ ； (.Hiη III)I. 2原核表达载体的构建利用上述三对特异性引物，分别从包括GenBank登录号为 EF514716的类猪圆环病毒2型因子Pl)) u基因组全长质粒DNA序列(公知公用，见温立斌等，一株类猪圆环病毒2型因子Pl的全基因组序列测定与分析，中国农业科学,2010年02 通，P413左1.3.3部分PCR产物的克隆与测序)中扩增相同的基因片段，分别可得到165 bp、143 bp和147 bp的扩增片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pET-28a ( + ) (Novagen公司)载体进行酶切，用T4 DNA连接酶顺次将3段重复片段连接到pET-28a ( + )上。具体来说，首先将pET-28a ( + )载体和Al与A2引物扩增的片段分别经Afco I和I酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pET-28a-lp Cap载体；然后将该载体和BI与B2引物扩增的片段分别经I和Sac I酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pET-28a-2p Cap载体；最后将pET-28a_2p Cap 载体和Cl与C2引物扩增的片段分别经5^ I和历/7d III酶切，回收各自的酶切片段，用 T4 DNA连接酶连接，构建pET-28a-3p Cap载体，连接产物分别转化大肠杆菌DH5 α (北京全式金生物技术有限公司)感受态中，提取质粒，酶切鉴定阳性克�。ㄎ粜钥寺〉乃湍暇┙鹚既鸸窘行蛄胁舛�。
挑取经Afco I和历/2d III双酶切出420 bp条带的质粒(此与预计的Pl Cap基因部分序列的3个重复片段165 bp、143 bp和147 bp经酶切连接后的片段大小一致)进行测序，测序结果表明所选基因的3个重复片段已按照预先设计的不同内切酶的位点相连， 并且也与pET-28a( + )载体正确相连，表达蛋白的阅读框正确，结果表明重组原核表达载体质粒pET-28a-3p Cap构建成功，将质粒pET-28a_3p Cap转化宿主菌大肠杆菌BL21中成为基因工程菌，命名为基因工程菌BLpET-28a-3p Cap。
所述重组原核表达载体质粒pET-28a_3p Cap表达的重组蛋白序列如下I MGHHHHHHTTPPAIQSPNPS 21 PTTPVTSHPNLFLTPLLITS 41 NQITKRISFGEFTTPPAIQS 61 PNPSPTTPVTSHPNLFLTPL 81 LITSNQITKGISFGELTTPP 101 AIQSPNPSPTTPVTSHPNLF 121 LTPLLITSNQITKGISFG其中第9位——50位，第53位——94位以及97位——138位为3个重复的氨基酸片段。
I. 3重组蛋白诱导表达和分析将基因工程菌BLpET-28a-3p Cap于LB液体培养基(在950mL去离子水中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用NaOH调pH至7. 0，用去离子水定容至1L)中37°C 振荡培养至0D600 ^ O. 4 O. 6，加入IPTG至终浓度为I. OmM,进行诱导表达，收集诱导后不同时间表达的菌体，与冰浴上进行超声破碎，裂解后的菌液经IOOOOrpm离心30min后，分离上清和沉淀同时进行SDS-PAGE电泳(采用LaemimLi不连续SDS-PAGE系统，分离胶12%、 浓缩胶4%)，鉴定目的蛋白的表达及表达形式。
I. 4重组蛋白纯化取100ml LB液体培养基，按照I. 3中蛋白诱导表达条件进行大量诱导培养，取包涵体按照Macherey-Nagel公司Protino Ni-TED Resin试剂盒说明书进行蛋白纯化,取回收蛋白样品加2XSDS凝胶加样缓冲液煮沸5 min后，进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。回收蛋白样品采用分光光度计测定蛋白质浓度。
SDS-PAGE分析显示，重组蛋白3pCap串联蛋白在大肠杆菌BL21细胞中成功表达， 以不溶性包涵体形式存在于菌体中，蛋白分子量大小为14. 7kDa，与预测的重组蛋白大小基本一致，镍柱回收后蛋白质样品进行SDS-PAGE，可见单一的目的条带，表明用镍柱纯化该表达蛋白效果较好。
Western Blotting分析按照I. 4中方法纯化的蛋白进行SDS-PAGE,参照常规 Western Blotting方法进行操作,最后采用DAB底物显示试剂(武汉博士德公司)进行显色。结果在14. 7KDa处出现特异条带，表明表达纯化的蛋白具有与Pl因子阳性血清的反应原性。
2.以重组蛋白3p Cap建立间接ELISA:取纯化后重组蛋白3p Cap做包被抗原建立间接ELISA方法，采用方阵法探索ELISA最佳蛋白包被浓度和血清稀释度，以及ELISA最佳反应条件。
2. I抗原抗体的最佳工作浓度用O. 05M pH9. 6的碳酸盐缓冲液将纯化所得的3pCap串联蛋白从1:50开始依次倍比稀释，100 μ L/孔包被酶标板，4°C包被过夜，然后弃掉包被液，用PBST洗涤酶标板3次，每次5min ;加入封闭液，200 μ L/孔，37°C作用2h，弃掉封闭液，用PBST洗涤酶标板板3次，每次5min ;用含有5%脱脂奶粉的PBS将血清作25、50、100、200、400、800倍稀释，100 μ L/孔， 37°C温箱孵育90min，PBST洗涤ELISA板板5次，每次3min ;用PBST稀释酶标二抗至工作浓度，100 μ L/孔，37°C温箱孵育45min, PBST洗涤ELISA板4次，每次3min ;加单组份TMB 溶液，10(^17孔，371温箱中反应5-81^11，加入IM H2S04溶液100 μ L/孔终止反应，酶标仪检测0D450值。结果当包被抗原稀释倍数为1:50 (浓度为2. 62 μ g/mL),时，血清稀释倍数为1:100时，P/N比值最大。据此，确定最佳包被浓度是2.62 μ g/mL，血清最佳稀释倍数为 1:100。
2.2最佳包被时间的选择用重组蛋白包被酶标板，分别于4°C过夜、37°C孵育Ih后于4°C过夜、37°C作用2h后于 4°C过夜。在其它条件相同的情况下，用己知的阴、阳性血清进行ELISA检测，观察OD值变化及P/N变化情况,确定最佳包被时间。结果确定最佳包被时间为4°C过夜，2.3 最佳封闭液的选择用重组蛋白包被酶标板，4°C包被过夜。然后分别用1%BSA、2%BSA、2%脱脂乳、5%脱脂乳、8%脱脂乳、5%犊牛血清、10%犊牛血清、1%明胶和2%明胶作为封闭液，37°C封闭2h，在其它条件相同的情况下，用己知的阴、阳性血清进行ELISA 检测，观察OD值变化及P/N变化情况，确定最佳封闭液。结果选择含有1% BSA的PBST作为为最佳封闭液， 2.4封闭时间的选择用重组蛋白包被酶标板，4°C包被过夜, 用最佳封闭液封闭，分别在37°C封闭lh、2h、3h、4h后，在其它条件相同的情况下，用己知的阴、阳性血清进行ELISA检测，观察OD值变化及P/N变化情况，确定最佳封闭时间。结果选择37°C封闭Ih为最佳封闭时间。
2. 5最佳血清稀释液的选择在血清稀释液中加入封闭成分，能达到减少非特异性吸附作用，为此在PBS中加入 1%BSA、2%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉和1%明胶，用己知的阴、阳性血清进行ELISA检测，观察OD 值变化及P/N变化，并以PBS稀释血清作为对照筛选最佳一抗稀释液。结果选择含有5%脱脂奶粉的PBS作为最佳一抗稀释液。
2. 6最适酶标二抗使用浓度的确定包被好的酶标板，加入适当倍稀释的阴、阳性血清，100 μ L/孔，37°C反应90min后， PBST洗涤酶标板3次，分别加入1:5000、1:10000、1:20000、1:40000稀释的酶标二抗，每孔 100 μ L，在其它条件不变的情况下，进行ELISA检测，观察OD值变化及Ρ/Ν变化情况，确定最适酶标二抗使用浓度。结果选择酶标二抗1:5000倍稀释为最佳。 2.7最适底物反应时间的确定抗原、血清、酶标二抗按最适条件进行，加入底物后于37 V’分别作用4min、7min、 10min、13min终止反应，450nm处测定OD值,确定最适底物反应时间。结果选择显色4min 时为最佳。
2. 8间接ELISA方法阴阳性临界值的确定用已建立的间接ELISA方法检测阴性猪场血清，计算出40份阴性血清的平均OD值⑴ 和标准方差(SD)。阴、阳性临界值为X+3SD，凡超过临界值的判为阳性，否则判为阴性。结果以0D450值是否大于O. 345判定来判定阴阳性临界值。
2. 9间接ELISA的特异性和重复性试验用建立的类猪圆环病毒Pl间接ELISA检测方法检测已知的SS2 (猪链球菌2型)、HPS (副猪嗜血杆菌)、Mhp (猪肺炎支原体)、PCV2 (猪圆环病毒2型)、PPV (猪细小病毒)、PRV (猪伪狂犬病毒)、TGEV (传染性胃肠炎病毒)、CSFV (猪瘟病毒)、PRRSV (猪繁殖与呼吸综合征病毒)、FMDV (口蹄疫病毒)阳性血清，确定是否有交叉反应。结果OD值均小于O. 2，为阴性， 表明该方法与上述病毒无交叉反应。
批内重复用同一批制备的间接ELISA抗体检测酶标板检测6份Pl抗体水平不同的血清，每份血清平行做4孔，计算检测结果的变异系数。
批间重复在不同批次制备的串联蛋白包被的酶标板中，每批随机抽取I个，检测 6份Pl抗体水平不同的血清，每份血清平行做4孔，计算检测结果的变异系数。结果表明批内和批间的变异系数均小于5%，表明该方法具有较好的重复性。
3间接ELISA方法的初步应用通过建立的间接ELISA方法检测江苏、安徽、山东、浙江和上海五省市送检的于2008 年 2011年之间采集的1135份猪血清。江苏检测的两个猪场(六和、洪泽)共有血清156CN 102928605 A书明说7/7页份，总阳性率为34. 6% ;安徽送检的三个猪场(淮南、合肥、滁州)共有血清212份，总阳性率为18. 9% ;山东送检的两个猪场(青岛、临沂)共有血清148份总阳性率为45. 3% ;上海送检的一个猪场血清90份，阳性率为14. 4%。浙江送检的3个猪场(金华、湖州、杭州)共有血清 529份，总阳性率为33. 6%，其中杭州共送检血清405份，阳性率为38. 5%，其中母猪、哺乳仔猪、保育猪、生长育成猪、种公猪阳性率分别为53. 3%,48. 6%,34. 5%、18. 3%、20%。
表I五省市血清检测结果
权利要求
1.一种类猪圆环病毒Pl抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于试剂盒内设有抗体检测板，封闭液，样品稀释液，洗涤液，酶结合物工作液，酶底物溶液，终止液，阳性对照和阴性对照；其中抗体检测板为包被类猪圆环病毒Pl重组衣壳蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为类猪圆环病毒Pl标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清。
2.根据权利要求I所述的一种类猪圆环病毒Pl抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述的类猪圆环病毒Pl重组衣壳蛋白的原核表达质粒，命名为pET-28a-3p Cap，是由以下方法构建而成的设计了三对含有不同酶切位点的引物 Al :5，-TTATCCATGGGCCACCACCACCACCACCACACTACTCCTCCCGCCAT ACAAT-3’ ；Nco I A2 :5’-GCCGAATTCGCCAAAGCTGATTCTT-3’ ；BcoR I BI :5’-ATGAATTCACTACTCCTCCCGCCATAC-3’ ；BcoR I B2 :5’-TTGGAGCTCGCCAAAGCTGATTCCT-3’ ；Sac ICl :5’-ATAGAGCTCACTACTCCTCCCGCCATACAAT-3’ ； Sac IC2 :5’-CGAAGCTTATTAGCCAAAGCTGATTCCTTTTGTT-3’ ； Hiη III利用上述三对特异性引物，分别从包括GenBank登录号为EF514716的Pl基因组全长质粒中扩增相同的基因片段，分别可得到165 bp、143 bp和147 bp的扩增片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pET-28a ( + )载体进行酶切，用T4 DNA连接酶顺次将3段重复片段连接到pET-28a ( + )上，构建pET-28a_3p Cap载体，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定正确的表明重组原核表达载体质粒pET_28a_3p Cap 构建成功。
3.根据权利要求2所述的一种类猪圆环病毒Pl抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述重组原核表达载体质粒pET-28a-3p Cap表达的重组蛋白序列如下 I MGHHHHHHTTPPAIQSPNPS 21 PTTPVTSHPNLFLTPLLITS 41 NQITKRISFGEFTTPPAIQS 61 PNPSPTTPVTSHPNLFLTPL 81 LITSNQITKGISFGELTTPP 101 AIQSPNPSPTTPVTSHPNLF 121 LTPLLITSNQITKGISFG 其中第9位——50位，第53位——94位以及97位——138位为3个重复的氨基酸片段。
4.根据权利要求3所述的一种类猪圆环病毒Pl抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述表达的重组蛋白经镍柱纯化后，成为检测类猪圆环病毒Pl抗体的包被抗原。
5.根据权利要求I或2所述的ELISA试剂盒，其用于检测猪血清中类猪圆环病毒Pl的抗体水平的方法为 (I)包被将权利要求I或2所述的一种类猪圆环病毒Pl C-端衣壳蛋白的原核表达质粒pET-28a-3p Cap表达的重组蛋白纯化后用抗原包被液稀释为2. 62 μ g/ml的终浓度，每个ELISA孔加入100 μ 1，4°C条件下包被过夜，PBST缓冲液洗涤5minX3次；抗原包被液为O. 05M，pH9. 6的碳酸盐缓冲液；PBST缓冲液为含质量比O. 01%Tween-20的PBS缓冲液； (2)封闭每孔加封闭液100μ1，37°C条件下作用Ih7PBST缓冲液洗涤5minX3次;封闭液为含质量比1%牛血清白蛋白的PBST缓冲液； (3)加待检血清每孔加入100μ I用含有质量比5%脱脂奶粉的PBS按1:100倍稀释后的血清，37°C条件下作用I. 5h，PBST缓冲液洗涤5minX3次； (4)加二抗每孔加入100μ I稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37°C条件下作用45 min,PBST缓冲液洗涤5minX 3次；稀释的HRP标记的羊抗猪IgG为用pH7. O的PBS按1:5000比例稀释； (5)加显色液每孔加含lmg/mlTMB四甲基联苯二胺的显色液100 μ 1，37°C避光作用,4 min ； (6)加终止液每孔加入100μ I终止液，酶标仪测定450 nm吸光值0D450 ;终止液为2M H2SO4 ； (7)结果判定待检血清0D450值>O. 345时判定为类猪圆环病毒Pl抗体阳性，0D450值Z O. 345判定为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测类猪圆环病毒P1抗体的间接ELISA试剂盒。属于生物技术领域。包括抗原重组蛋白的制备、间接ELISA建立、判定标准及临床血清学检测的应用。所述的抗原重组蛋白是利用pET-28a(+)原核表达载体，构建的表达类猪圆环病毒P1Cap衣壳蛋白C端部分氨基酸序列的3个重复的基因工程菌BLpET-28a-3pCap,并将表达的重组蛋白纯化后的Cap蛋白。该方法用于检测猪血清中类猪圆环病毒P1的抗体水平具有重复性好、特异性高的特点，可用于类猪圆环病毒P1血清学调查，为该病的防治和流行情况的掌握提供一种快速、简便的检测方法。目前该方法是国际上首次利用P1衣壳蛋白建立检测猪群中P1抗体的ELISA。
文档编号G01N33/531GK102928605SQ20121043663
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者何孔旺, 文世富, 温立斌, 王小敏, 李彬, 郭容利, 俞正玉, 茅爱华, 倪艳秀, 张雪寒, 吕立新, 周俊明, 胡屹屹, 汪伟, 叶青, 祝昊丹, 于洋, 沈江萍, 周萍 申请人:江苏省农业科学院
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