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专利名称：使用中红外光谱术测量生物过程的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用中红外光谱术测量生物过程的方法和装置。相关技术讨论分析仪器和/或技术力图测量和/或监测过程。气相色谱、质谱术、高效液相色谱和量热术，代表了用于过程测量的已知装置和/或程序。近来对环境的担忧和有限的自然资源，驱动了源自于非化石原料的材料、例如通过生物过程生产的材料的开发和利用。然而，尽管在分析仪器和技术中已有上述技术，但对用于测量生物过程、例如检测生物过程的反应物、产物和/或副产物并在生物过程中可靠地在线运行(operating on-line)的其他方法和装置，仍存在需求。发明概述本发明涉及使用中红外光谱术测量生物过程的方法和装置。所述方法和装置能够检测生物过程的反应物、产物和/或副产物，同时在生物过程中可靠地在线运行。根据第一个实施方案，本发明包括用于测量生物过程的方法。所述方法包括在生物活性阶段期间将中红外信号导入生物过程样品的步骤，以及从中红外信号检测样品光谱以形成样品光谱的步骤。方法包括通过参比介质产生参比光谱的步骤，以及将样品光谱与参比光谱合并以形成调整过的样品光谱的步骤。根据第二个实施方案，本发明涉及测量生物过程的第二种方法。所述第二种方法包括将中红外信号导入生物过程的初始样品的步骤，以及从中红外信号检测样品光谱以形成初始样品光谱的步骤。第二种方法包括通过参比介质产生初始参比光谱的步骤。第二种方法包括将初始样品光谱与初始参比光谱合并以形成调整过的初始样品光谱的步骤，以及将中红外信号导入生物过程的一个或多个后续样品的步骤。第二种方法包括从中红外信号检测样品光谱以形成一个或多个后续样品光谱的步骤，以及通过参比介质产生与所述一个或多个后续样品光谱中的每一个相对应的一个或多个后续参比光谱。第二种方法包括将所述一个或多个后续样品光谱与相应的一个或多个后续参比光谱合并、以形成一个或多个调整过的后续样品光谱的步骤，以及从所述一个或多个调整过的后续样品光谱的每一个中减去调整过的初始样品光谱、以形成一个或多个差光谱(difference spectra)的步骤。根据第三个实施方案，本发明涉及用于测量生物过程的装置。所述装置包括中红外光谱仪以及与所述光谱仪光连接并适合与生物过程的至少一部分流体连通的探测器。所述装置包括与光谱仪光连接的参比介质。附图简述整合在本说明书中并构成本说明书的一部分的附图，对本发明的实施方案进行了说明，并且与描述部分一起，用于解释本发明的特点、优点和原理。在附图中，

图1示意性显示了一个实施方案的生物过程；图2显示了一个实施方案的初始参比光谱；
图3显示了一个实施方案的初始样品光谱；图4显示了一个实施方案的调整过的初始样品光谱；图5显示了一个实施方案的调整过的后续样品光谱；图6显示了一个实施方案的差光谱；图7示意性显示了一个实施方案的方法流程图；图8示意性显示了一个实施方案的处于打开位置的探测器外壳；图9示意性显示了处于关闭位置的图8的探测器外壳；图10示意性显示了一个实施方案的生物过程；图11显示了一个实施方案的糖的光谱；图12显示了一个实施方案的葡萄糖的光谱；图13显示了一个实施方案的麦芽提取物的光谱；图14显示了一个实施方案的乙醇的光谱；图15显示了一个实施方案的实验设置；图16显示了一个实施方案的发酵光谱；图17显示了一个实施方案的时间依赖性光谱；图18显示了一个实施方案的原始和差减光谱；图19显示了一个实施方案的分量模型准确度的图；以及图20显示了一个实施方案的重力模型准确度的图。详细描述本发明涉及使用中红外光谱术测量生物过程的方法和装置。根据一个实施方案， 本发明可以包括使用独立光纤参比回路测量光谱仪间隙空间(interstitial space)的吸收光谱以产生背景光谱。方法可以包括在接种后立即测量生物过程的吸收光谱以产生初始光谱。方法可以包括从初始光谱中减去背景光谱以产生参比光谱。在后来的时间点，本发明可以包括使用独立光纤参比回路测量光谱仪间隙空间的吸收光谱以产生第二个背景光谱。 也在后来的时间点，方法可以包括测量生物过程的吸收光谱以产生后来的光谱。方法可以包括获取第二个背景光谱与后来的光谱的比率以产生过程光谱。方法可以包括从过程光谱中减去参比光谱以产生产物光谱。不受理论的束缚，所述方法能够对光谱中可能降低光谱仪的准确度和/或特异性的特征，例如水蒸气、二氧化碳等进行校正。所述方法能够增强原本将被背景和/或污染物的峰掩盖的特征。根据一个实施方案，本发明可以至少部分用下列方程描述。吸光度(A)= -log (1/1。)= a. b. cA = -log(Is/Is0)= -log(Is/Ir. Ir/Is0)= -log(Is/Ir)-log(Ir/Is0)= -log(Is/Ir)+log(Is0/Ir)= Asr-As0r其中s =样品，r =参比回路。图1示意性显示了一个实施方案的生物过程10。生物过程10使用反应容器。生物过程10可以使用通过光纤电缆14与光谱仪16相连的中红外探测器12进行测量。光谱仪16还通过光纤电缆14与参比介质18相连。图2将初始参比光谱显示成χ-轴为波数(厘米_0、y-轴为吸光度(吸光度单位) 的图。初始参比光谱包括约800厘米―1至约1，100厘米―1之间的水蒸气特征。初始参比光谱包括约2，300厘米―1至约2，400厘米―1之间的二氧化碳特征。图3将初始样品光谱显示成χ-轴为波数(厘米_0、y-轴为吸光度(吸光度单位) 的图。图4将调整过的初始样品光谱显示成χ-轴为波数(厘米-1)、y-轴为吸光度(吸光度单位)的图。图4的调整过的初始样品光谱是将图3的初始样品光谱与图2的初始参比光谱合并而得到的。图5将调整过的后续样品光谱显示成χ-轴为波数(厘米―1)、y-轴为吸光度(吸光度单位)的图。图5的调整过的后续样品光谱是将后续样品光谱(未显示)与后续参比光谱(未显示)合并而得到的。图6将差光谱显示成χ-轴为波数(厘米_i)、y-轴为吸光度(吸光度单位)的图。 图6的差光谱是从图5的后续参比光谱中减去图4的调整过的初始样品光谱而得到的。差光谱在600厘米―1至1，800厘米―1之间显示出光谱。差光谱可以适用于化学计量模型的开发。图7示意性显示了一个实施方案的测量生物过程的方法的流程图。框A表示通过参比介质产生初始参比光谱的步骤。框B表示将中红外信号导入生物过程的初始样品、并从中红外信号检测样品光谱以形成初始样品光谱的步骤。框C表示将初始样品光谱(框B) 与初始参比光谱(框A)合并以形成调整过的初始样品光谱(框C)的步骤。框D表示通过参比介质产生一个或多个后续参比光谱的步骤。框E表示将中红外信号导入生物过程的一个或多个后续样品、并从中红外信号检测样品光谱以形成与所述一个或多个后续参比光谱中每一个相对应的一个或多个后续样品光谱的步骤。框F表示将所述一个或多个后续样品光谱(框E)与所述相应的一个或多个后续参比光谱(框D)合并以形成一个或多个调整过的后续样品光谱(框F)的步骤。框G表示从一个或多个调整过的后续样品光谱(框F)的每个中减去调整过的初始样品光谱(框C)、以形成一个或多个差光谱(框G)的步骤。图8示意性显示了一个实施方案的探测器12和探测器外壳20，其中隔离器件沈处于对生物过程10的开放位置中。探测器12具有探测器表面22，其与生物过程10接触并可以用冲洗流体观清洁。探测器外壳20包括固定环、通气槽、填装槽、过程槽、密封环和任选的槽沟。理想地，探测器外壳20包括可以在开放、居间和/或关闭位置之间移动和/或滑动的环形几何形状。图9示意性显示了一个实施方案的图8的探测器12和探测器外壳20，其中隔离器件沈处于对生物过程10(未显示)的关闭位置中。图10示意性显示了一个实施方案的生物过程10。探测器12穿过探测器外壳20 插入到生物过程10中。探测器12与光谱仪16相连。探测器外壳20与用于冲洗流体观的冲洗系统34相连。冲洗系统34包括连接管线、管道、阀、配件、泵、储液器等。冲洗系统 34具有控制器32，并与还连接光谱仪16的计算机30相连。
根据一个实施方案，本发明可以包括测量生物过程的方法。方法可以包括在生物活性阶段期间将中红外信号导入生物过程样品的步骤，以及从中红外信号检测样品光谱以形成样品光谱的步骤。方法可以包括通过参比介质产生参比光谱的步骤，以及将样品光谱与参比光谱合并以形成调整过的样品光谱的步骤。测量广义上是指对组成成分的量和/或数量、例如摩尔百分数进行确定、检测、换算、计量等。组成成分和/或组分可以在任何适合的基础上测量，例如以摩尔计、以质量计、 以体积计等。过程广义上是指引起例如结果和/或后果的步骤、行动和/或事件。过程可以是连续、离散、分批、半连续、半分批的，等等。生物广义上是指生命系统、活的过程和/或活生物体，例如古菌、细菌和/或真核生物。根据一个实施方案，生物包括生物来源的化合物，例如酶、蛋白质等。根据一个实施方案，生物不包括成为化石的和/或古代的材料，例如其生命在至少约1，000年前结束的材料。生物过程可以包括任何适合的活系统和/或源自于活系统的项目和/或步骤，例如发酵、细胞培养、有氧呼吸、厌氧呼吸、分解代谢反应、合成代谢反应、生物转化、糖化、液化、水解、解聚、聚合等。导入广义上是指指向、延伸、投向、照向、照亮等。信号广义上是指用于传送和/或传达信息的物质，例如可检测的物理量和/或脉冲。根据一个实施方案，所述信号包含具有适合频率的稳定光束。在备选方案中，信号可以包括波长、频率、振幅、相等的变动和/或脉冲式变化。中红外广义上是指电磁波谱的波长长于可见光但短于微波的部分，例如波数在约 4，000厘米―1至约400厘米―1之间、约3，000厘米―1至约1，000厘米―1之间、约1，500厘米―1 至约2，500厘米―1之间等。中红外光可以具有任何适合的波长，例如约30微米至约2. 5微米之间、约25微米至约5微米之间等。中红外可用于研究基本振动和相关的旋转-振动结构，例如对称伸缩、不对称伸缩、剪式、摇动、摆动、扭转等。进入广义上是指引入、导入、插入、包含在内等。样品广义上是指较大整体和/或群组的代表性部件和/或部分，例如具有整体的品质和/或特点的部分。根据一个实施方案，样品可以从生物反应容器内含物的一部分获取。根据一个实施方案，样品可以通过直接插入到生物反应容器中来获取。样品可以从体相抽取、在原位获取、在线获取、离线获取、从外部获取等。期间广义上是指在持续时间或时间段中。生物活性阶段广义上是指在活性生物过程例如细胞代谢、生物转化、细胞生长等的时间段期间。根据一个实施方案，生物活性阶段包括无活性和/或休眠期。替代地，在一个实施方案中，生物活性阶段可以不包括无活性和/或休眠期，例如刚好在接种之前和/或之后在生物过程中没有显著细胞活性。根据一个实施方案，生物活性阶段包括迟缓期、指数期、对数期、静止期、衰亡期、死亡期等。检测广义上是指发现、确定、测量到存在、出现、事实等。光谱广义上是指频率和/或波长的范围，例如可以包括连续的范围和/或离散的范围。光谱可以显示在每个波长处有多少透射光，以揭示出吸收了多少能量。
理想地，具有峰和/或谷的样品光谱对应于生物过程的元素、化合物、分子、组成成分等。样品光谱可以对应于和/或代表生物过程期间的任何适合时间和/或时间段，例如活化期间、第一转化阶段期间、第二转化阶段期间、第三转化阶段期间、第四转化阶段期间、 终结阶段期间等。对应于样品光谱的可用原料可以发生任何适合量的转化，例如以质量计至少约10 %、至少约20 %、至少约30 %、至少约40、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、 至少约80%、至少约90%等。可以用任何适合的频率获取样品光谱，例如至少约每秒钟1次、至少约每分钟1 次、至少约每5分钟1次、至少约每10分钟1次、至少约每小时4次、至少约每小时1次、至少约每4小时1次、至少约每8小时1次、至少约每天2次、至少约每天1次、至少约每2天 1次、至少约每5天1次、至少约每周1次、至少约每2周1次，等等。 产生广义上是指制造、收集、发生、使之存在等。参比广义上是指被参照或参考的某类事物，例如信息源。参比介质广义上是指例如可用于提高生物过程读取的质量和/或内容的任何适合的物质。参比介质可以包括水、发酵材料、空气、光纤电缆等。参比介质可以包括能够引导中红外信号从其通过的封闭的介质样品。发酵材料可以代表过程中任何适合的点，例如发酵周期的起始点、发酵周期的中间点、发酵周期的终点等。参比介质可以提供空气背景、 水背景、对应于光谱仪内部的背景等。不受理论的束缚，光纤回路可以允许除去可能随着光谱仪操作的变化(内部条件)随时间改变的特征。光纤回路可以包括从光谱仪的光源连到检测器的单光纤电缆。根据一个实施方案，光纤回路不包括其他器件和/或介质。不受理论的束缚，光谱仪内条件的变化可能在来自生物过程的信号中产生噪音和 /或缺乏清晰度。使用参比光谱能够去除和/或过滤样品光谱中的噪音。噪音可以由光谱仪内水蒸气含量(湿度)、二氧化碳含量等的变化而产生。例如，当监测发酵系统时，可以在用微生物接种后发酵开始时获取样品光谱。尽管光谱仪可以被气密密封，但在生物过程期间光谱仪内的水蒸气含量仍可能改变，使得后续样品当用光谱仪检测时可能包括来自于水蒸气变化的噪音。使用参比介质能够减少和/或去除来自光谱的噪音。合并在广义上是指样品光谱与参比光谱的加、减、乘、除、取对数、取指数、取比率、 完成变换(拉普拉斯(LaPlace)变换、傅里叶(i^ruier)变换等)、取导数、取积分和/或任何其他适合的数学操作。根据一个实施方案，可以从样品光谱中减去参比光谱以形成和 /或制成调整过的样品光谱。理想地，本发明的方法和装置能够为生物过程提供实时和/或在线数据或信息。 例如，探测器可以在原位或过程的外部与过程相接。中红外信号可以穿透到样品中任何适合的深度，例如约1微米至约10微米之间、 约2微米至约8微米之间、约3微米至约7微米之间、约4微米至约6微米之间、至少约2 微米、至少约3微米等。将中红外信号通过样品能够形成透射信号和/或反射信号。参比光谱、样品光谱和/或调整过的样品光谱可以包括对应于分子伸展、分子弯曲等的值。参比光谱、样品光谱和/或调整过的样品光谱可以含有对应于碳单键(约900 厘米―1至约1，500厘米―1之间)、碳双键(约1，500厘米―1至约1，800厘米―1之间)、碳叁键(约2，100厘米―1至约2，300厘米―1之间)、碳-氧键、碳-氮键、氧-氢键(约3，300 厘米―1至约3，500厘米―1之间)、氮-氢键等的值。碳双键可以包括碳-碳键、碳-氧键、碳-氮键等。碳叁键可以包括碳-碳键、碳-氮键等。参比光谱、样品光谱和/或调整过的样品光谱可以含有对应于任何适合的材料、 元素、化合物和/或分子的值，例如丙酮、乙醛、乙醇、丁醇、戊醇、异戊二烯醇、异戊二烯、丁醛、乙酸、乳酸、丙酮酸、甘油、戊糖、己糖、脂肪醇、脂肪酸、酰基甘油酯(包括甘油单酯、二
酯、三酯)、二氧化碳、一氧化碳等。根据一个实施方案，生物过程包括可再生材料的生产和/或制造。可再生材料广义上是指至少部分源自于能够被自然生态循环和/或资源更替的来源和/或过程的物质和 /或物品。可再生材料广义上可以包括化学品、化学中间体、溶剂、单体、寡聚物、聚合物、生物燃料、生物燃料中间体、生物汽油、生物汽油掺配油、生物柴油、绿色柴油、可再生柴油、生物柴油掺配油、生物馏出物等。理想地，但不是必需的，可再生材料可以源自于活的生物体， 例如植物、藻类、细菌、真菌等。生物燃料广义上是指适合用作源自于可再生来源的燃料或燃烧源的组分或料流， 所述可再生来源例如可以可持续生产和/或向大气的净碳排放降低或没有的那些。根据一个实施方案，可再生资源可以不包括挖掘或钻探的材料，例如来自于地下的材料。理想地， 可再生资源可以包括单细胞生物、多细胞生物、植物、真菌、藻类、栽培作物、非栽培作物、木材等。生物燃料可以适合用作运输燃料，例如用于陆上交通工具、海上交通工具、空中交通工具等。生物燃料可以适合用于产生动力，例如产生蒸汽和/或发电。生物汽油广义上是指适合于直接使用和/或掺配到汽油池(gasoline pool)和/ 或辛烷供应物中、源自于可再生来源的组分或料流，例如甲烷、氢气、合成气(合成)、甲醇、 乙醇、丙醇、丁醇、二甲基醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、己醇、脂族化合物(直链、支链和/或环状)、庚烷、异辛烷、环戊烷、芳香族化合物、乙苯等。丁醇广义上是指1-丁醇、2-丁醇、异丁醇的产物和衍生物、其他异构体等。生物汽油可以用于火花点火式发动机、例如汽车汽油内燃发动机中。根据一个实施方案，生物汽油和/或生物汽油掺配油满足或符合工业上接受的燃料标准。生物柴油广义上是指适合于直接使用和/或掺配到柴油池和/或十六烷供应物中、源自于可再生来源的组分或料流，例如脂肪酸酯、甘油三酯、脂类、脂肪醇、烷烃、石脑油、馏程材料、石蜡族材料、芳香族材料、脂族化合物(直链、支链和/或环状)等。生物柴油可用于压缩发动机、例如汽车的柴油内燃发动机中。在备选方案中，生物柴油也可用于燃气轮机、加热器、锅炉等中。根据一个实施方案，生物柴油和/或生物柴油掺配油满足或符合工业上接受的燃料标准。生物馏出物广义上是指适合于直接使用和/或掺配到航空燃料(喷气燃料)、润滑油基料、煤油燃料等中、源自于可再生来源的组分或料流，其沸点范围在约100°c至约 700°C之间、约150°C至约350°C之间等。根据一个实施方案，生物过程包括生物质发酵成醇类。生物质广义上是指植物和 /或动物材料和/或至少部分源自于活物质、例如木质纤维素来源的物质。木质纤维素的广义上是指含有纤维素、半纤维素、木质素等，例如植物材料。木质纤维素材料可以包括任何适合的材料，例如糖用甘蔗、糖用甘蔗渣、能源甘蔗、能源甘蔗渣、 水稻、稻草、玉米、玉米秸、小麦、麦杆、玉蜀黍、玉蜀黍秸、高梁、高梁秸、甜高粱、甜高粱秸、 棉花、棉花残余物、甜菜、甜菜废粕、大豆、油菜籽、麻风树、柳枝黍、芒属植物、其他草本植CN 102549409 A物、木材、软木、硬木、树皮、废木材、锯末、纸张、废纸、农业废物、粪便、粪肥、污水、城市固体
垃圾、任何其他适合的生物质材料等。根据一个实施方案，导入中红外信号的步骤利用了衰减全反射，其中将中红外信号从与生物过程的至少一部分流体连通的内表面上反射和/或反弹至少约1次。反射和 /或反弹的次数可以是任何适合的次数，例如至少约1次、至少约2次、至少约3次、至少约 3. 4次、至少约4次、至少约6次、至少约8次、至少约10次、至少约12次等。从中红外信号检测样品光谱以形成样品光谱的步骤，可以包括检测从生物过程的样品反射和/或透射的中红外信号。根据一个实施方案，方法还可以包括在生物活性阶段之前将中红外信号导入生物过程的初始样品的步骤，以及在生物活性阶段之前从中红外信号检测样品光谱以形成初始样品光谱的步骤。方法可以包括在生物活性阶段之前通过参比介质产生初始参比光谱的步骤，以及将初始样品光谱与初始参比光谱合并以形成调整过的初始样品光谱的步骤。方法还可以包括从调整过的样品光谱中减去调整过的初始样品光谱和/或将两者合并以形成差光谱的步骤。初始广义上是指开始，例如起初。在生物活性阶段之前广义上是指没有显著细胞活性的时间段，例如在向生物过程接种或添加微生物之前和/或其后不久，例如不到约10分钟、不到约5分钟、不到约2分钟等。在生物活性阶段之前可以包括将原料和液体例如糖和水装入生物过程容器中之后的时间段。减去和/或合并以形成差光谱，可以包括上面对于形成调整过的样品光谱所描述的任何适合的数学操作和/或技术。差光谱显示了从生物过程开始至随后时间段中生物过程透光度的变化，以例如显示材料的浓度变化。差光谱对于生物过程期间形成的化合物和/或产物是有用的。对应于其他时间段(之前和/或之后)的其他差光谱，也在本发明的范围之内。任选地和/或替代地，对于生物过程所消耗的化合物(原料)来说，可以从调整过的初始样品光谱中减去调整过的样品光谱或其一部分。根据一个实施方案，差光谱的绝对值能够基于差光谱显示化合物的浓度变化。理想地，所述光谱能够显示浓度增加(典型为产物和/或副产物)和/或浓度降低(典型为反应物)。根据一个实施方案，方法还可以包括在显示屏(监测器)上显示一个或多个光谱、 在打印基材(纸)上打印一个或多个光谱、在记录介质(磁盘、闪存、可读光碟)上记录一个或多个光谱等的步骤。方法可以包括任何适合的有形结果和/或输出(outcome)。通过应用化学计量模型，可以将原始和/或裸光谱数据转变成有用数据。化学计量学广义上是指通过例如应用和/或使用数学和/或统计方法或技术，将对化学过程做出的测量与系统的状态相关联的科学。化学计量学可用于在生物过程例如发酵液中存在的组分的已知浓度(系统状态)与从生物过程收集的中红外光谱(对过程做出的测量)之间建立关联(校准模型)。化学计量模型可以基于数据中的变差和/或相关性。基于对原始数据集中观察到的变差的不同贡献，可以将光谱数据转变成新的数据集。新数据集可以由从每个波数处吸光度的线性组合所制成的正交分量、例如主成分的因数构成。然后可以对模型中每个成分的许多因数进行限制，以便将使过程信息最大化的因数包含在预测模型中。根据一个实施方案，本发明可以包括测量生物过程的方法。方法可以包括将中红外信号导入生物过程的初始样品的步骤，以及从中红外信号检测样品光谱以形成初始样品光谱的步骤。方法可以包括通过参比介质产生初始参比光谱的步骤，以及将初始样品光谱与初始参比光谱合并以形成调整过的初始样品光谱的步骤。方法可以包括将中红外信号导入生物过程的一个或多个后续样品的步骤，以及从中红外信号检测样品光谱以形成一个或多个后续样品光谱的步骤。方法可以包括通过参比介质产生与所述一个或多个后续样品光谱的每一个相对应的一个或多个后续参比光谱的步骤，以及将所述一个或多个后续样品光谱与所述相应的一个或多个后续参比光谱合并以形成一个或多个调整过的后续样品光谱的步骤。方法可以包括从所述一个或多个调整过的后续样品光谱的每一个中减去调整过的初始样品光谱以形成一个或多个差光谱的步骤。根据一个实施方案，本文公开的任何方法的步骤可以用本文中明确列出的次数、 频率和次序执行。在备选方案中，方法的步骤可以被重新排序、重复、省略等。后续广义上是指在时间、次序、位置等方面靠后，例如后来。后续可以包括任何适合的时间段和/或频率，例如约每分钟1次、约每10分钟1次、约每小时1次、约每2小时 1次、约每4小时1次、约每8小时1次、约每日1次等。根据一个实施方案，中红外信号可以包括约4，000厘米―1至约400厘米―1之间的波数，并且参比介质可以包括光纤电缆。生物过程可以包括生物质分批发酵成醇类，例如戊糖和/或己糖发酵成乙醇。方法还可以包括将所述一个或多个差光谱合并以产生一个或多个时间依赖性光谱的步骤，以测量分批过程中时间段期间组成成分的浓度变化。根据一个实施方案，本发明可以包括用于测量生物过程的装置。所述装置和/或设备可以包括中红外光谱仪以及与光谱仪光连接的探测器。探测器可以适合与生物过程的至少一部分流体连通。装置可以包括例如在单独的通道和/或光源上与光谱仪光连接的参比介质。上面对方法实施方案的任何部分所描述的任何和/或所有属性和/或特征，可以适用于本发明的装置实施方案。光谱仪广义上是指用于测量光的波长和/或光谱的仪器，例如具有发射源和检测器以测量来自发射源的散射和/或透射的分析仪器。理想地，可以将光谱仪密封和/或与周围环境隔绝。根据一个实施方案，光谱仪能够产生波数在约4，000厘米―1至约400厘米―1 之间的信号。光谱仪可以包括例如使用适合的散热器冷却和/或速冷至适合温度。运行温度可以包括低于约100°C、约环境条件、低于约0°C、低于约-100°C、低于约-190°C等。探测器广义上是指适合于插入到过程的至少一部分中的测试器件。探测器可以包括晶体例如金刚石、蓝宝石等。理想地，但不是必需的，探测器可以利用衰减全反射。光连接可以包括任何适合的导管和/或缆线，例如光纤电缆、镜管、可视通路(视觉线路)等。根据一个实施方案，装置不包括使用光导管。流体连通广义上是指通过例如直接插入、管道连接、管线连接等，与过程的至少流体和/或液体部分相接触。正如上面关于方法所讨论的，装置的参比介质可以包括水、空气、发酵材料、光纤电缆等。也正如上面关于方法所讨论的，探测器可以将中红外信号从与生物过程的至少一部分流体连通的内表面上反射至少1次。装置可以包括与光谱仪相连的任何其他适合设备，例如计算机。计算机可以包括任何适合的部件，例如处理器、存储装置、显示装置、打印装置、软件程序等。根据一个实施方案，装置可以包括适合于冲洗机制的探测器外壳，以使冲洗流体流过和/或通过至少一部分探测器表面。不受理论的束缚，生物过程中的固体和/或其他材料可能弄脏和/或黏附于探测器表面而降低信号质量。探测器外壳可以由任何适合的材料制造和/或构造，所述材料例如碳钢、不锈钢、镍合金、其他合金、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、含氟聚合物、工程树脂、其他聚合物、复合材料等。冲洗流体可以包括任何适合的材料，例如水、发酵液、乙醇、甲醇、丙醇、糖溶液、乙酸、空气、氮气、氩气、二氧化碳、其他溶剂、其他稀释剂等。冲洗流体可以利用动力装置，例如离心泵、正排量泵等。冲洗流体可以利用一个或多个储存容器，例如储液器、罐、瓶、滤器等。冲洗流体和/或清洁溶液可以使用齿轮泵来提供正向流和/或反向流两者。理想地，但不是必需的，探测器外壳可以提供探测器与生物过程的可移动隔离，以提供清洗模式和/或操作。探测器外壳可以为润湿的探测器部分提供原位灭菌。外部探测器外壳可以通过蒸汽或其他适合的程序清洁。根据一个实施方案，探测器外壳可以包括隔离器件，所述隔离器件可以在使至少一部分探测器表面暴露于生物过程的第一位置与使至少一部分探测器表面暴露于冲洗流体的第二位置之间移动，例如具有一般为同心环形的构型。所述隔离器件可以包括通过水压、例如通过齿轮泵在正向和/或反向之间的电切换而在开放与关闭位置之间移动的含氟聚合物探测器密封件。探测器可以用任何适合的频率冲洗，例如约每小时1次、约每日1次、约每2日1 次、约每周1次等。
实施例实施例1乙醇(99.8Vol% )、D(+)葡萄糖、糖(蔗糖)、麦芽提取物和啤酒酵母的标准品，是用来证实用于生物过程的中红外(MIR)技术的能力和灵敏度的成分。图11显示了一个实施方案的糖标准品的光谱，χ-轴上为波数(厘米―1)，y_轴上为吸光度(吸光度单位)。图12显示了一个实施方案的葡萄糖标准品的光谱，χ-轴上为波数(厘米―1)，y-轴上为吸光度(吸光度单位)。图13显示了一个实施方案的麦芽提取物标准品的光谱，χ-轴上为波数(厘米―1)，y_轴上为吸光度(吸光度单位)。图14显示了一个实施方案的乙醇标准品的光谱，χ-轴上为波数(厘米―1)^-轴上为吸光度(吸光度单位)。通过在无菌烧杯中将80克麦芽提取物用500毫升沸水溶解来执行发酵过程。向烧杯添加120克糖(葡萄糖)以形成水性溶液。然后将水性溶液转移到在整个过程中带有持续搅拌和温度控制的反应容器中。向水性溶液加入另外500毫升水。将0.5克酵母在温水中溶解15分钟，然后添加到水性溶液中。
光谱数据使用来自于Billerica，Massachusetts，U. S. A 的 Bruker Optics 公司的 Bruker IFS/66 FT-IR 光谱仪获取。使用来自于苏格兰 West Lothian 的 Fibre Photonics 有限公司或是Bruker Optics公司的二次反射金刚石衰减全反射(ATR)探测器，在35°C 下每小时记录发酵过程的fflR光谱。ATR探测器通过多晶红外(PIR)光纤电缆与光谱仪相连。探测器具有2，500厘米―1至600厘米―1之间的量程，分辨率为8厘米―1，每个光谱累积1 次扫描。在每次实验开始时获取初始背景光谱。光谱仪装备有来自于Chelmsford， Massachusetts U. S. Α.的 Brooks Automation 公司的 KBr (溴化钾)射束分离器和 Cryotiger冷却器。冷却器与检测器连接。Cryotiger冷却器是低温致冷器系统，其避免了对单独的液氮冷却系统的需要。然后将ATR探测器插入到反应容器中，用于在75小时的葡萄糖发酵期间记录光谱。图15显示了实施例1中使用的实验设置。实验设置包括反应容器中的生物过程10。 探测器12插入到生物过程10中，并将光谱仪16和检测器40与计算机30相连。实验设置包括搅拌器36和温度控制装置38。图16显示了来自于发酵的光谱，χ-轴上为波数(厘米―1)，y_轴上为吸光度(吸光度单位)。随着时间的增加，对应于乙醇的峰增加。交叠的峰可以使单变量校准困难，因此使用了多变量偏最小二乘技术。使用化学计量学，通过使用主成分分析来分析光谱。主成分分析图显示出与葡萄糖和麦芽提取物的消耗相符的向下趋势。图还显示出在约55小时后没有显著变化，表明发酵酵母的活动已经停止。使用葡萄糖、麦芽提取物和乙醇混合物的20种校准标准品，根据一阶导数预处理和二阶导数预处理，建立了偏最小二乘模型。相关性结果显示出实测值与预测值的决定系数R2在0. 998至0. 905之间。实施例1的结果显示，中红外光谱术与多变量化学计量校准一起，能够提供发酵过程的在线监测。一阶和二阶导数光谱与主成分分析分值和载荷图一起，给出了关于葡萄糖向乙醇生物转化的解释性信息。偏最小二乘法模型为三种成分或分析物(葡萄糖、麦芽提取物和乙醇)提供了良好的估算，显示出可以用过程监测的准确度来预测生物过程成分的浓度。Cyrotiger检测器便于连续光谱的获取而不需带有液氮冷却的检测器。金刚石 ATR探测器在发酵试验期间不会弄脏。实施例2以10升规模进行了四次小麦面粉发酵，并使用中红外光谱术进行监测。从发酵反应器收集几个样品用于分析。建立了用于葡萄糖、甘油和乙醇的化学计量模型。也测试了在位灭菌。使用了来自瑞士 Bottmingen的INFORS HT公司的带有辅助设备的Techfors-S不锈钢生物反应器。将ATR探测器定位于反应器的备用底部端口中。样品从反应器底部的取样点收集。经过4周执行了 4次发酵。通过将面粉与水的混合物用液化酶在83°C下处理，然后用糖化酶在60°C下处理，来制备发酵液。将发酵液无菌转移到发酵容器中，然后用重新水化的酵母和10毫升15vol. %的消泡剂溶液接种。运行A使用中筋白面，温度为M°C，酵母接种率为每升介质1.74克，搅拌速率为每分钟350转。运行B使用中筋白面，温度为M°C，酵母接种率为每升介质1.74克，搅拌速率为每分钟350转。运行C使用中筋白面，温度为27°C，酵母接种率为每升介质1.74克，搅拌速率为每分钟350转。运行D使用中筋白面，温度为27°C，酵母接种率为每升介质3. 01 克，搅拌速率为每分钟500转。使用实施例1中所用的2次反射ATR探测器监测发酵系统。样品获取包括来自独立的光纤参比回路的参比光谱，测量发酵期间的样品光谱，以及为发酵期间的每个时间段获取参比光谱与样品光谱的比率以形成调整过的样品光谱。每5分钟重复取样，四次发酵中的每一次总共约2，000个原始光谱。通过从调整过的样品光谱中减去调整过的初始样品光谱(在刚刚接种后)来产生原始光谱，以除去没有随时间改变的特征。在一个工作周期间，约每2小时从发酵容器取出发酵液样品，每次发酵共约20个样品。使用某些样品的一部分，通过加入已知量的葡萄糖、甘油和/或乙醇以形成调整过的样品，来建立化学计量模型。使用次级验证探测器为调整过的样品产生光谱。将调整过的样品离心和过滤，然后对得到的上清液使用高效液相色谱(HPLC)。HPLC分析具有针头污染、折射率限制以及其他糖类的共洗脱的一些问题。HPLC问题可能人为地增加HPLC数据与中红外数据之间的误差。校准样品组包括直接来自于反应器中的59个样品和来自于调整过的样品的61个样品。保留另外M个样品用于验证组。使用主成分分析(PCA)，将化学计量模型应用于数据。图17显示了发酵图，其中时间(小时)在X-轴上，葡萄糖浓度A (克/升)在y-轴上(左侧标度)，乙醇浓度B (克 /升)在y-轴上(右侧标度)。数据点表示HPLC数据，并与显示成线的中红外光谱数据显示出良好的相关性。图18显示了使用差减光谱数据B(噪音较低)与原始光谱数据A相比的好处。图19显示了甘油的分量模型准确度，其中χ-轴上是HPLC甘油浓度(克/升)， y-轴上是预测的甘油浓度(克/升)。对于差减光谱的预测来说，预测的均方根误差为5. 71 克/升。通过取得组分浓度相当恒定的时间段内组分预测浓度的标准偏差，来探索模型的精确度。标准偏差在0. 11克/升至0. 85克/升的范围内。还建立了基于中红外光谱预测发酵混合物的重力或密度的模型。将40个样品用于重力模型校准，并将20个样品用于验证。图20显示了 χ-轴上为实测重力(克/毫升)、 y-轴上为预测重力(克/毫升)的图。均方根误差预测仅为0.0014克/升。还使用3. 4次反射ATR探测器对样品进行测试，其产生了与上面讨论的2次反射探测器的结果相似的结果。通过将反应器中的水升温至121°C 15分钟，然后冷却至环境温度，对探测器进行了蒸汽灭菌。在灭菌前探测器的光通量为在水中5，949次计数，灭菌后为在水中6，030次计数。探测器的灭菌没有明显损失灵敏度。探测器的灭菌是成功的。在本文中已经针对生物过程对本发明进行了描述，但是本技术领域的专业人员可以容易地认识到，本发明不限于这样的生物学应用。在本说明书中公开的方法和装置的更广泛和多样的应用和/或使用，在本发明的范围之内。当在本文中使用时，术语“具有”、“包含”和“包括”是开放性和包容性表述。反之， 术语“由……构成”是封闭性和排他性表述。如果在权利要求书或说明书中在任何术语的解释中存在任何意义不明确之处，起草者的意图倾向于开放性和包容性表述。当在本文中使用时，术语“等”为列出的项目和/或成员的任何和所有个体和组合提供支持，并为项目和/或成员的个体和组合的等效物提供支持。对于方法或过程中步骤的次序、数量、顺序和/或重复限度来说，除非明确提供， 否则起草者打算不为本发明的范围暗示步骤的次序、数量、顺序和/或重复限度。对于范围来说，范围应该被解释为包括上限值与下限值之间的所有点，以例如为包含在上限值与下限值之间的所有可能范围、包括没有上限和/或下限的范围提供支持。对于本技术领域的专业人员来说，显然可以在所公开的结构和方法中进行各种修改和改变，而不背离本发明的范围或精神。具体来说，对任一实施方案的描述可以与其他实施方案的描述自由组合，以产生两种或以上元素和/或限度的组合和/或变化形式。对于本技术领域的专业人员来说，在考察了本文公开的本发明的详细说明和实践后，本发明的其他实施方案将是显而易见的。所述详细说明和实施例打算仅仅被当作是示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求书指明。
权利要求
1.一种测量生物过程的方法，所述方法包含在生物活性阶段将中红外信号导入到生物过程的样品中； 从中红外信号检测样品光谱以形成样品光谱； 通过参比介质产生参比光谱；以及将样品光谱与参比光谱合并以形成调整过的样品光谱。
2.权利要求1的方法，其中中红外信号包含约4，000厘米―1至约400厘米―1之间的波数。
3.权利要求1的方法，其中参比介质包含水、发酵材料、空气、光纤电缆或其组合。
4.权利要求1的方法，其中中红外信号穿透到样品中约1微米至约10微米之间。
5.权利要求1的方法，其中样品光谱含有对应于分子伸展、分子弯曲或其组合的值。
6.权利要求1的方法，其中样品光谱含有对应于碳-氧键、碳-氮键或其组合的值。
7.权利要求1的方法，其中导入中红外信号利用衰减全反射，所述衰减全反射从与生物过程的至少一部分流体连通的内表面上将中红外信号反射出去至少一次。
8.权利要求1的方法，其中样品光谱含有对应于丙酮、乙醛、乙醇、丁醇、戊醇、异戊二烯醇、异戊二烯、丁醛、乙酸、乳酸、丙酮酸、甘油、戊糖、己糖、脂肪醇、脂肪酸、酰基甘油酯、 二氧化碳、一氧化碳或其组合的值。
9.权利要求1的方法，其中生物过程包含产生可再生材料。
10.权利要求1的方法，其中生物过程包含生物质发酵成醇类。
11.权利要求1的方法，其中从中红外信号检测样品光谱以形成样品光谱包含检测从生物过程样品反射或透射的中红外信号。
12.权利要求1的方法，其还包含在生物活性阶段之前将中红外信号导入生物过程的初始样品中； 在生物活性阶段之前从中红外信号检测样品光谱以形成初始样品光谱； 在生物活性阶段之前通过参比介质产生初始参比光谱； 将初始样品光谱与初始参比光谱合并以形成调整过的初始样品光谱；以及从调整过的样品光谱中减去调整过的初始样品光谱，以形成差光谱。
13.权利要求12的方法，其还包含 在显示屏上显示一个或多个光谱； 在打印基材上打印一个或多个光谱；或在记录介质上记录一个或多个光谱。
14.一种测量生物过程的方法，所述方法包含 将中红外信号导入生物过程的初始样品中； 从中红外信号检测样品光谱以形成初始样品光谱； 通过参比介质产生初始参比光谱；将初始样品光谱与初始参比光谱合并以形成调整过的初始样品光谱； 将中红外信号导入生物过程的一个或多个后续样品； 从中红外信号检测样品光谱以形成一个或多个后续样品光谱； 通过参比介质产生与所述一个或多个后续样品光谱的每一个相对应的一个或多个后续参比光谱；2将所述一个或多个后续样品光谱和所述相应的一个或多个后续参比光谱合并，以形成一个或多个调整过的后续样品光谱；以及从所述一个或多个调整过的后续样品光谱的每一个中减去所述调整过的初始样品光谱，以形成一个或多个差光谱。
15.权利要求14的方法，其中中红外信号包含约4，000厘米―1至约400厘米―1之间的波数；并且参比介质包含光纤电缆。
16.权利要求14的方法，其中生物过程包含生物质分批发酵成醇类。
17.权利要求14的方法，其还包含将所述一个或多个差光谱合并以产生一个或多个时间依赖性光谱。
18.一种用于测量生物过程的装置，所述装置包含 中红外光谱仪；与所述光谱仪光连接并适合于与生物过程的至少一部分流体连通的探测器；以及与所述光谱仪光连接的参比介质。
19.权利要求18的装置，其中中红外光谱仪产生包含波数在约4，000厘米―1至约400 厘米―1之间的信号。
20.权利要求18的装置，其中参比介质包含水、空气、发酵材料、光纤电缆或组合。
21.权利要求18的装置，其中探测器包含衰减全反射探测器。
22.权利要求18的装置，其中探测器包含金刚石。
23.权利要求18的装置，其中探测器从与生物过程的至少一部分流体连通的内表面上将中红外信号反射出去至少一次。
24.权利要求18的装置，其还包含与中红外光谱仪相连的计算机，所述计算机包含 处理器；存储装置； 显示装置； 打印装置；以及软件程序。
25.权利要求18的装置，其还包含适合于冲洗机制的探测器外壳，以使冲洗流体流过至少一部分探测器表面。
26.权利要求25的装置，其中探测器外壳包含可以在使至少一部分探测器表面暴露于生物过程的第一位置与使至少一部分探测器表面暴露于冲洗流体的第二位置之间移动的隔离器件。
全文摘要
本发明涉及使用中红外光谱术测量生物过程的方法和装置。方法包括在生物活性阶段期间将中红外信号导入生物过程样品的步骤，以及从中红外信号检测样品光谱以形成样品光谱的步骤。方法包括通过参比介质产生参比光谱的步骤，以及将样品光谱与参比光谱合并以形成调整过的样品光谱的步骤。
文档编号G01N21/35GK102549409SQ201080042236
公开日2012年7月4日 申请日期2010年8月30日 优先权日2009年9月22日
发明者海伦·马松, 瑞贝卡·尼科尔森, 穆拜特·巴达莫西, 阿莱斯戴尔·I·汤姆森 申请人:Bp北美公司