专利名称：Ev71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及其应用。具体涉及一种可中和EV71病毒A、B、C三种基因型病毒的广谱性单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株及该单克隆抗体的用途。
背景技术：
手足口病(hand，foot and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的一种急性传染病。该病自1957年首次报道以来，曾多次流行，世界卫生组织于2006年曾将本病列为第四位引起死亡的的疾病。美国、澳大利亚、意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国等国家经常发生由各型柯萨奇、�？刹《竞统Φ啦《�71型(EV71)引起的手足口病。20世纪90年代后期，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。1998-2001年手足口病在新加坡的流行以及2007年该病在中国发生了大规模的疾病暴发。手足口病是全球性传染�。昀词肿憧诓∫丫晌嚼丛酵补谕舛】档墓惴毫餍行约膊≈�。为指导全国各地做好手足口病的预防控制，2008年卫生部发布《手足口病预防控制指南》；规定自2008年5 月2日起，手足口病纳入丙类传染病管理。研究发现，引发手足口病的病毒有一个共同特点，均为肠道病毒科，为单股正链小 RNA病毒。这些病毒有20多种(型)，包括肠道病毒71型(EV 71)、柯萨奇病毒A组的16 型(Cox A16)、埃可病毒以及其它柯萨奇病毒。目前国内爆发的手足口病主要是由EV71和 Cox A16引起的。由柯萨奇病毒引起的手足口病一般症状较轻，而EV71则相对较重，20%的患者可以伴有引起无菌性或病毒性脑炎，心肌炎和脑麻痹后遗症的患者。因此，有关EV71 的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属 (Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71病毒的基因组为7408核苷酸的单股正链RNA。该基因组仅含有一个开放阅读框(编码含有约2194个氨基酸的多聚蛋白)。所编码的多聚蛋白可进一步水解成PI、P2和P3三个前体蛋白，Pl前体蛋白被进一步活化为 IA (多肽VP1)、1B (多肽VP2)、1C (多肽VP3)和ID (多肽VP4)四个病毒结构蛋白；四种结构蛋白拼接成五聚体结构；五聚体形成亚单位结构，60个亚单位构成病毒粒子。P2和卩3前体蛋白主要编码7个非结构蛋白，编码蛋白水解酶及RNA聚合酶，P3区在进化过程中高度保守。VPl作为主要的衣壳蛋白，具有最多的型特异性中和位点，其基因序列与病毒血清型具有较高的相关性。EV71病毒衣壳蛋白VPl是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。VPl基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VPl基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据。并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VPl基因成了 EV71基因分型和遗传进化分析的最重要的对象。目前基于VPl核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等三个基因型，A型仅包括原型株BrCr-CA-70 ；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3和C4亚型。Brown等曾对113株世界各地的EV71分离株的VPl基因的核苷酸序列进行同源性分析，显示同一型内毒株间序列同源性大于92%， 而不同型间毒株的同源性为78% 83%。自1997-2001年期间在马来西亚、新加坡、中国台湾和澳大利亚西部等地流行期间分离到2个新亚型，即B3和B4亚型，其中B3亚型为东南亚地区的流行株。B4亚型曾在新加坡(1997-1998年)和中国台湾(1998年)小规模流行，但2000年在马来西亚和新加坡大规模流行，成为流行株。B基因型主要包括美国、澳大利亚、哥伦比亚、新加坡、部分中国大陆与中国台湾地区、部分马来西亚的毒株；而C基因型主要包括美国、澳大利亚、中国大陆与中国台湾、加拿大和部分马来西亚的毒株。B和C基因型在系统发生树上遗传距离较远。中国台湾1998年EV71大爆发是由2个基因型，即B和 C2同时引起的，但Siih等比较了其流行期间从死亡病例中分离的18株毒株。结果表明， 有17株分离毒株为C2亚型，仅1株为B型。近年来在中国上海、重庆、浙江和深圳等多个地区分离的EV71病毒有较高的同源性，均属于C4亚型，提示该C4亚型EV71病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。EV71病毒衣壳蛋白VP2和VP4是肠道病毒外壳蛋白的主要组成部分，它们与病毒的抗原性密切相关，基于VPl与VP4的基因分型具有很高的相关性。目前针对EV71引起疾病的疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中。EV71病毒疫苗的抗原含量检测、保护性表位研究、治疗性单克隆抗体的制备，具有广泛的应用范围和社会需求。高质量的EV71单克隆抗体(mAb)有可能用于研制治疗性mAb、EV71患者血清学诊断以及EV71病毒疫苗的抗原含量的检测，因此具有重要的应用价值。鉴于EV71的�：π砸约肮谘逍偷奶氐悖臼笛槭乙訣V71病毒的C4亚型为基�。∪∮肫渌切捅Ｊ氐男蛄兄票钢刈榭乖糜诿庖咝∈�。当然筛选单克隆抗体时，同时用A、B、C三类病毒亚型进行筛�。玫侥芡庇階、B、C三类病毒亚型结合的单克隆抗体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供EV71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。为此，本发明的解决方案是提出一种EV71病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏名称为杂交瘤细胞A7-E3，保藏号为CCTCC No:C201123。保藏日期为2011年4月12 日，经检测为存活。(中国典型培养物保藏中心地址中国湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编 430072)。本发明所述EV71病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏名称为杂交瘤细胞 A7-E3，名称有所不同的原因是前者为通用名，后者是根据保藏中心的要求命名的。其中杂交瘤细胞为细胞类别，A7-E3为筛选时产生的特定的克隆编号。进一步地，本发明提出由前述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。进一步地，本发明提出用于检测EV71抗原或EV71的IgG或IgM的试剂盒、试剂或药剂，包含前述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段。本发明的试剂盒、试剂或药剂中，EV71病毒选自A、B、C三种基因型的EV71病毒； 优选地，所述B型EV71病毒选自Bi、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒选自 Cl、C2、C3、C4 和 C5 型 EV71 病毒。
本发明的试剂盒、试剂或药剂中，其所述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的。本发明的试剂盒、试剂或药剂中，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记，或是荧光标记，例如荧光素标记。进一步地，本发明提出了前述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段在制备用于预防或治疗EV71感染的人源化抗体中的用途。进一步地，本发明提出了检测EV71病毒抗原的方法，是采用双抗体夹心法进行 EV71病毒抗原的检测，其中使用了权利要求2所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体，或标记的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体(例如酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶)的或荧光标记的，例如荧光素标记的)。进一步地，本发明提出了检测EV71相关抗体的方法，是采用捕获法进行抗EV71病毒IgG、IgM的检测，其中使用了权利要求2所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体或标记的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体(例如酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶)的或荧光标记的，例如荧光素标记的)。相对于现有技术，本发明的有益效果是给EV71病毒抗原检测以及捕获法进行抗 EV71病毒IgG、IgM的检测提供一种高特异性、高灵敏度的优质的抗体。
图1为EV71抗原检测标准曲线。
具体实施例方式本发明采用重组EV71 VPl抗原，利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，然后通过EV71 病毒A、B、C三种基因型的间接ELISA法筛�。竦昧四芊置谥泻虴V71三种基因型病毒并能特异性结合EV71病毒的细胞系及由所属细胞系产生的单克隆抗体。因此，本发明一方面提供了一种对EV71病毒各种基因型均有高结合效价的杂交瘤细胞株。对于本发明的上述杂交瘤细胞株，申请人于2010年12月31日在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)(湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学，保藏中心) 对其进行了保藏，保藏号为CCTCC No :C201123。本发明另一方面提供了由上述的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体，或其活性片段或其保守性突变体。进一步地，本发明的抗体可根据其抗原结合区域(例如重链和轻链可变区)发展出的各种衍生抗体，可以用于被动免疫治疗或者预防EV71病毒感染，如人源化抗体。由于本发明的单克隆抗体对于EV71病毒A、B、C三种基因型均有高水平的中和效果，所以本发明提供了本发明的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合在制备用于检测EV71病毒A、B、C三种基因型的抗原的试剂、药剂或试剂盒中的应用。本发明的再一方面提供了试剂或试剂盒，其包括本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合。所述试剂或试剂盒可用于检测EV71病毒抗原或 EV71的IgG、IgM，从而可进一步用于诊断EV71病毒感染。
在本发明的又一方面，本发明的试剂或试剂盒，优选的，包括标记的本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。对于本发明所述的标记，其是指生物标记或化学标记。例如酶标记的或荧光标记的(例如荧光素标记)。优选的，所述酶标记为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记。本发明还提供了用于检测EV71病毒抗原的方法，其中使用了本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体，或标记的本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。优选的，采用双抗体夹心法进行检测EV71病毒抗原。本发明还提供了 EV71相关抗体的检测方法，检测EV71相关抗体的方法，优选的， 采用捕获法进行抗EV71病毒IgG、IgM的检测。即以抗人IgG或IgM抗体作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgG或IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入EV71特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标(或荧光标记)的抗 EV71单克隆抗体，最后加入底物显色。为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。实施例1 杂交瘤细胞系的获得、单克隆抗体的制备1、免疫原的制备选取了当前流行的肠道病毒71型C4亚型，采用人工化学合成的方法合成了编码肠道病毒71型VPl蛋白的核苷酸序列，具体是根据基因片段人工合成的需要，将设计的基因分段合成，体外拼接成完整的序列，构建了重组表达质粒。然后由工程菌大肠杆菌进行发酵生产，发酵结束后发酵液离心收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体，包涵体蛋白经过稀释复性后，经过亲和层析纯化。2、动物免疫采用重组VPl蛋白进行BALB/c小鼠免疫。免疫程序首次免疫取重组VPl蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化，免疫BALB/c小鼠，50 μ g/只，腹腔注射；间隔14天后进行第二次免疚取重组VPl蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，50 μ g/只，腹腔注射；7 天后采血，采用间接ELISA法测定抗体的抗EV71活性。对检测抗体效价最高的小鼠不加佐剂，用重组VPl蛋白进行静脉注射加强免疫。3、细胞融合取免疫鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤按比例融合，铺96孔细胞培养板， 采用HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，第七天采用间接ELISA法检测细胞上清以筛选阳性细胞。间接法采用A、B、C三种基因型病毒纯化液分别单独包被，筛选同时呈阳性的细胞孔。 间接ELISA法如下将A、B、C三种基因型EV71病毒纯化液包被酶标板，加入阳性血清对照、阴性血清对照，同时设置空白对照孔，37°C反应后洗涤酶标板，加入羊抗小鼠IgG-HRP ； 反应45分钟后洗涤酶标板，加入TMB显色液37°C显色5分钟，用2M硫酸终止反应，仪器上读取0D450的吸光度。结果，阳性血清对照的OD值为1. 2以上，阴性血清对照的OD值为0. 05以下。经过筛�。竦玫哪康南赴晁杂Φ腛D值如表1所示。表1初筛所得5细胞株所对应的OD值
权利要求
1.一种EV71病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞A7-E3，保藏号为CCTCC No :C201123。
2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体、或其保守性突变体、或其活性片段。
3.一种用于检测EV71抗原或EV71的IgG或IgM的试剂盒、试剂或药剂，包含权利要求 2所述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段。
4.根据权利要求3所述的试剂盒、试剂或药剂，其中所述的EV71选自A、B、C三种基因型的EV71病毒；其中，所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型 EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒、试剂或药剂，其所述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的。
6.根据权利要求5所述的试剂盒、试剂或药剂，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记，或是荧光标记。
7.权利要求2所述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段在制备用于预防或治疗EV71感染的人源化抗体中的用途，其中EV71是指A、B、C三种基因型的EV71病毒；其中， B型EV71病毒选自Bi、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，C型EV71病毒选自Cl、C2、C3、C4和 C5型EV71病毒。
8.—种检测EV71病毒抗原的方法，是采用双抗体夹心法进行EV71病毒抗原的检测，其中使用了权利要求2所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体，或标记的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。
9.一种检测EV71相关抗体的方法，是采用捕获法进行抗EV71病毒IgG、IgM的检测， 其中使用了权利要求2所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体或标记的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种EV71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。该杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞A7-E3，保藏号为CCTCC No.C201123。本发明给EV71病毒抗原检测以及捕获法进行抗EV71病毒IgG、IgM的检测提供一种高特异性、高灵敏度的优质的抗体。
文档编号G01N33/577GK102229915SQ20111017025
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者吕棠山, 吴志军, 周林福, 徐芝勇 申请人:浙江大学
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