专利名称：用于探测被分析物的元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用来探测包含在液体中的被分析物的元件和一种测量装置。所述被分析物可以以溶解或悬浮形式存在。此外，本发明还涉及一种制造和以电接触方式连接所述元件的方法。此外，本发明还涉及所述元件在探测被分析物中的应用。
DE 197 08 529 C1公开了一种液体和气体有机化合物用的流体传感器。所述流体传感器具有一个电导率随渗透液变化的电传感器电阻。所述传感器电阻施加在不导电基板上。它包括一种相关液体可以扩散通过且其中嵌有碳粒子的不导电体。传感器电阻可以借助于穿过基板的通孔与基板后侧的接触区相接触连接的电极进行接触连接。所述接触区在许多电极之间产生电连接。所述液控传感器只适于探测能改变传感器电阻的电导率的有机化合物。不适于探测其它被分析物。
Sosnowsky等人公开了一种用于溶液中的核酸的带电极排列的硅芯片，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci USA，94，1119-1123页。能特定结合被分析物的俘获分子借助于中间层固定在电极上。电极通过芯片表面的线路互相电接触连接。所述线路通过氮化硅层绝缘。通过向电极施加一个负或正电势，带电被分析物可以被吸引到带俘获分子的电极上并与俘获分子结合。未结合或非特定结合的被分析物可以通过极性反转从电极区域重新除去。利用荧光对特定结合的被分析物进行探测。
此外，已知摩托罗拉公司还出售一种名为eSensorTM的生物晶片，其中在其表面上排列有金电极。金电极横向地接触连接在生物晶片的表面。俘获分子借助于中间层固定在电极上。借助于与结合的被分析物结合在一起并具有电化学探测标记的记录分子探测通过俘获分子与电极结合的被分析物。以电化学方式探测所述记录分子的结合。
EP 0 136 362 B1公开了一种测量液体样品基质浓度的生物传感器。该生物传感器包括一个带电极系统的绝缘基板，其中所述电极系统具有至少一个工作电极和一个反电极。该电极系统被一个多孔基板覆盖，其中所述多孔基板中包含一种氧化还原酶、可以吸收液体并包含一种能够引发可以用该电极系统电化学地探测到的基板反应的酶。传感器还具有一种电子受体。所述氧化还原酶和电子受体都可溶于所述液体样品。
DE 36 87 646 T3涉及一种具有例如由EP 0 136 362 B1已知的电极系统的生物传感器，所述电极系统主要包括碳且至少测量电极的表面通过吸附覆有白蛋白或葡萄糖氧化酶。
由EP 0 136 362 B1和DE 36 87 646 T3已知的所述生物传感器的缺点在于所述多孔基板在每次测量之后必须更换，且所述生物传感器不适于测量不是所述氧化还原酶的基质的被分析物的浓度。而且，不利的是该生物传感器不适于测量小型化基板上的多种不同被分析物。
DE 196 21 241 A1涉及一种测量液体中的葡萄糖浓度的膜电极。所述膜电极包括一个基膜，其中基膜具有位于其一侧的至少一个贵金属电极、一个位于所述基膜和贵金属电极上的质子选择性离子膜、和一个位于所述离子膜上的包含有在适合介质中的葡萄糖氧化酶的双层膜。该膜电极仅仅适于测量葡萄糖的浓度而不适于探测液体中的其它被分析物。
在WO 01/75151 A2和DE 100 15 816 A1中公开了一种生物传感器芯片，其中后者是前者的优先权基础。传感器具有嵌在绝缘体材料制造的绝缘体层中的电极。DNA探测分子固定在每个电极上。所述传感器是硅基生物传感器芯片的一部分。连接在电极上的是可以输入要施加在电极上的电势的电极终端。所述电极终端与芯片内的一个集成电路相连接。不利的是，在这种情况下要使生物传感器芯片仅仅被用作单用途的传感器芯片，其制造成本太昂贵。但是，对于会腐蚀或改变探测分子的被分析物，为了可再现的测量，这可能是必需的。
EP 0 690 134 A1公开了一种多用电化学固体传感器，它具有一个不导电基板、一个工作电极和一个覆盖该工作电极的半透膜。所述工作电极包含固定在基板的一部分上的一种导电材料。导电材料的第一部分覆有电绝缘介质涂层，第二部分覆有活性层。活性层包含一种负载于分散在活性层内的镀铂碳粉颗粒上的催化有效量的酶。所述电化学固体传感器结构相对比较复杂，因此制造成本很高。
US 5,363,690公开了一种包含可更换的电化学传感器元件的气体探测器。所述可更换传感器元件和测量信号的计算单元之间的电接触借助于一个弹性连接体实现。所述元件不适于探测液体中的被分析物。
WO 01/13103 A1公开了具有由氧化的苯酚化合物构成的表面涂层的电极，其中涂层中结合了表面活性剂。所述添加剂可以防止检测特定的对洗涤剂敏感的被分析物。因此，该电极只能被用来探测特定的被分析物。
EP 0 402 917 A2公开了一种包含位于不导电载体上的至少两个间隔的导电线路的生物传感器。一个由表面活性物质制成的导电有机聚合层与所述导电线路电接触并覆盖所述线路之间的表面。此外，还配有一个封闭涂层以防止其与水发生电接触。在由表面活性物质制造的聚合层上结合了一个有机分子层，来自水介质的补充分子可以结合于其上。
EP 0 987 333 A2公开了一种用在电化学传感器中作厚膜导电体的组合物，它包含导电金属微粒、石墨、热塑性聚合物和表面活性物质。该组合物可被用于印刷电化学生物传感器用工作电极。但是，由于表面活性物质对特定被分析物的敏感性，这种传感器仅适于探测特定的被分析物。
所提到的电极或电极排列制作非常复杂。它们的制造部分需要平版印刷技术。制造成本太昂贵，以至于不能使其用作仅为一次性的电极或电极排列。对于高电极密度的情况，必须将电极的引出线设置在多个层中，即应用所谓的多层技术。因此，高电极密度只有具有相当的制造复杂性才有可能。为防止电极的导电线路与包含被分析物的溶液相接触，必须向线路上施加保护层。此外，对于特定应用，如作为微流体室的底，生物晶片必须具有光滑的表面。因此，必须施加一个补偿层以弥补由线路导致的不平整。
本发明的一个目的就在于消除所述现有技术的缺陷。本发明特别在于提供一种可简单并从而成本合算地制造的用于探测被分析物的带电极的元件。
此目的是通过权利要求1、18-22、35和38所述的特征实现的。权利要求2-17、23-34、36、37和39-51所述的特征可以带来有用的改进。
本发明提供一种用于探测液体中的被分析物的元件，它具有多个彼此绝缘并设置在一个所述液体不能透过的不导电板的第一侧上的电极，所述电极至少部分地具有对被分析物特定的涂层或对被分析物特定的分子，并能通过贯穿所述板的导电体彼此电接触连接和从板的第二侧分别导出。所述涂层或分子由于具有对被分析物或一种由于被分析物的存在而形成的物质例如被分析物的分解产物的特定吸引力，因此是对被分析物特定的。所述元件没有引出线。所述导电体可以与板和电极相连。术语“电极”应以纯功能的形式理解。应将其理解为是指电荷载体可以通过其而导入液体的导电体部分。从而，电极可以是位于不导电板的第一侧的那部分导电体。不过，电极还可以是连接在贯穿板的导电体上的另一导电体。这里，板是指具有第一和第二侧的任意的、特别是平的基体。在此处和下文中“部分地”是指，单独电极的一部分和电极总体的一部分都具有各自的特征。
根据本发明的元件简单并从而制造成本合算。没有必要为防止液体和电极馈电线之间发生接触而施加一个保护层。而且，也没有必要为产生板的平整表面而施加一个补偿层。由于免除了横向引出线，所以有可能以一种非常经济的方式将元件塑造成在电极之外的区域十分平整的形式。从而，该元件可以很容易地用作容纳液体的室的底而不必采用在这种情况下会有问题的液密性密封件。根据本发明的元件的另一个优点在于，可以获得比用横向导出的电极更高的电极密度，因为不必在电极之间为线路留出空间。所述的更高电极密度无需复杂的多层技术就可以提供。借助于根据本发明所述的具有高电极密度和对被分析物特定的涂层或对被分析物特定的分子以及可以单独导出的电极的元件，其中所述涂层或分子至少部分地具有不同的特定性，就可以提供一种用于同时检测多种不同被分析物的元件。根据本发明的元件可以以电极阵列的形式提供，其中电极在每种情况下都具有特定的分子或涂层，以探测不同被分析物或被分析物组合。
在生物传感器芯片的发展中，主要趋势是朝着实现更复杂的芯片结构。但是，它们的制造很复杂，最终对于一种常规传感器技术来说，特别是针对不同的被分析物，变得过于昂贵。已知的以硅基方式制造的芯片不具有任何贯穿芯片从而可以使位于芯片一侧的电极可以从另一侧导出的导电体。更确切些，至少部分硅载体是未穿孔的，且存在的电极最终都横向导出。由于没有任何导出线和同时允许从板的第二侧的接触连接，这使得根据本发明所述的元件的构筑非常简单，从而可以以适于一次性应用方式的合算成本制造此元件。对电极、它们的被分析物特定性涂层或被分析物特定性分子有侵蚀作用的测量可以仅用一个一次性应用的元件就可再现地进行。根据本发明的元件可以以芯片的形式制造，成本只是制造硅基芯片的成本的一小部分。因此该元件可以促进常规的传感器技术的突破。根据本发明的元件可被用在用于接触连接该元件的装置中。在这里，该装置提供了所有导出和测量信号所需要的但根据本发明的元件没有提供的零件。因此，更为昂贵的零件可以重复使用。
本发明的另一优点在于，从板的第二侧的接触连接使得可以实现短线通路。从而，就可以避免由电极从侧面导出的情况下的较长线通路所引起的电噪声。电噪声会降低检测的灵敏度，并由此甚至可妨碍被分析物的检测。在一个有利的改进中，导电体与电极一起构成一个片。电极和导体可以包含相同的材料。这成就了从第二侧的良好接触连接性能和非常合算的制造成本。在电极和板的第一侧的导电体之间不必建立电接触。
电极上的涂层或对被分析物特定的分子在各种情况下可以不同，从而使得各个电极彼此各不相同。从而，对被分析物特定的涂层和对被分析物特定的分子可以具有不同的特性，并使得可以(特别是同时)检测不同的被分析物。在这种情况下，可被检测的被分析物是由所述不同涂层或分子的特性所限定的一组中的一个。
所述涂层或对被分析物特定的分子可以包含特别是电化学惰性的俘获分子。在这里，俘获分子是被分析物或由于被分析物的存在而形成的一种物质如被分析物的分解产物从液体中所结合的分子。如果俘获分子在电化学检测被分析物时不产生信号，则它们是电化学惰性的。俘获分子可以是(特别是单股的)核酸、核酸类似物、配位体、半抗原、肽、蛋白质、糖、类脂物或离子交换剂。俘获分子可以共价地和/或定向地与电极结合。共价结合的优点在于俘获分子不能扩散离开电极。在使用根据本发明的元件所可能达到的电极间距离极小的情况下，即使俘获分子扩散开很小的程度也可能导致检测反应中断。定向结合应当理解为俘获分子各自都以俘获分子的一个特定位点例如以该分子的一端与电极结合。从而可以保证俘获分子上决定着结合被分析物的位点不受所述俘获分子与电极的结合的影响。俘获分子可以至少部分地借助于一个特别是电化学基本惰性的中间层与电极结合。所述中间层可以是由硅烷形成的。如果中间层在电化学检测被分析物时不产生信号，则它是基本电化学惰性的。
在一优选的改进中，所述涂层包括电极的至少一个半透覆盖层。所述半透覆盖层在不同情况下可以具有不同的渗透性，从而使不同电极的覆盖层的渗透性可以不同。所述覆盖层可以有选择性地透过直至某一指定大小的分子。在这种情况下可能涉及了聚合物基体与分子筛的反应。因此，就有可能只允许例如由被分析物的特定分解所产生的小分子透过到达电极，从而使得特定地只有这些分子被探测到。根据本发明的这种元件可以用于跟踪反应器中进行的反应的过程控制。
导电体可以设置在板的穿孔中，其中所述穿孔从板的第二侧向第一侧特别是成圆锥形地逐渐变细。在这种情况下，导电体只能设置在由穿孔的收尖形式所形成的断口的收尖区域。不过，它还可以自由地突入该断口。断口的收尖形式有利于从第二侧的电接触连接，因为，为了接触连接而导向电极方向的导电体即使在其最初只不过是侵入了该断口时，也导向了电极。
板可以设置在微流体室的底上或构成微流体室的底。由于其能够获得特别平整的实施方案和相应的良好密封性能，根据本发明的元件非常适合于这种应用。
所述元件也可以是一个芯片。这在此应理解为具有电子微观结构但并不必包括半导体材料的小板。在这种情况下，电极可以以电极阵列的形式排列。
板上可以每cm2具有10个以上，优选20、40、80、100或160个以上，特别优选1000个以上，尤其是10000个以上电极。所述电极可至少部分地由颗粒构成。所述颗�？梢跃哂卸员环治鑫锾囟ǖ耐坎慊蚝卸员环治鑫锾囟ǖ姆肿�。在这种情况下，颗粒彼此可以松散地或固定地相连接。所述松散连接可以例如通过颗粒是顺磁性的且由磁力保持在电极或导电体上来提供。
此外，电极可以至少部分地由非金属导体特别是碳构成。含碳电极尤其非常适合于检测生物分子。电极可以至少部分地是含铅笔、玻璃碳、碳纤维的碳浆或塑料复合电极，优选含单质碳、特别是石墨或炭黑形式的单质碳的聚碳酸酯电极。所述炭黑可以是工业炭黑或合成炭黑。
本发明还涉及一种测量装置，它包含根据本发明的元件，其中电极包括至少一个参比电极和至少一个反电极以及许多工作电极。所述测量装置包括多个电流/电压转换器、一个恒电位仪和一个用来测量流过工作电极的电流的装置。电极与恒电位仪电连接，以在工作电极和参比电极之间产生预定的电压外形，在每个工作电极的下游连接一个电流/电压转换器以使所有工作电极保持在同一电势。在这种情况下，要产生一个同时施加在所有工作电极上的相同的预定电压外形只需要一个恒电位仪。由于所有工作电极保持在同一电势，因此就有可能例如并联地测量流过这些工作电极的电流。为此，每个工作电极实际上都可以通过电流跟随器连接到电路接地，以各自单独测定这些信号。
本发明还涉及一种制造根据本发明所述的元件的方法，它具有以下步骤a)制造由基本上平行排列的细长形电极材料和环绕该电极材料的绝缘材料构成的复合材料，该复合材料是通过如下步骤制造的-用固化绝缘材料封闭固体电极材料，-将固体电极材料插入固体绝缘材料的基本平行的断口或穿孔中，或插入可塑性变形绝缘材料中，-将浆状或液体固化电极材料填入固体单片绝缘材料或具有一致排列的穿孔的层叠板型绝缘材料的基本平行的断口或穿孔中，-通过熔融、灌注或粘性结合夹衬板连接具有一含绝缘材料的夹衬板的电极材料，或-将由被绝缘材料围绕的电极材料构成的复合材料挤出，和b)通过切、锯或借助于分离盘，或者通过拆开层叠板型绝缘材料，将复合材料基本垂直于电极材料的纵向进行分离。
所述固体电极材料可以是例如许多平行排列并用环氧树脂密封的铅笔芯。所述可塑性变形绝缘材料可以在引入过程中调整自己适应电极材料的形状，和/或在引入后通过将它们挤压在一起调整到适应所述形状。这样，确保了液体密闭终端。在此处和下文中，电极材料的“固化”应理解为最初的液体或浆状电极材料随时间凝固，即其硬度增加。这可以例如通过较高温度下为浆状的电极材料的聚合、干燥或冷却来实现。不过，电极材料在固化后的最终态可以仍然比较软。
所述固体单片绝缘材料可以通过注射成型法制造。在将电极材料填入层叠板型绝缘材料中时，穿孔的排列形式应使在层叠绝缘材料的一侧填入的电极材料能填满所有穿孔。电极材料可以例如通过挤出而压入穿孔中。能用于此目的的方法可以是钢笔芯制造中的已知方法。
夹衬板可以通过加热或化学方式(例如通过添加一种初始溶解夹衬板的溶剂)熔融。
当通过挤出由被绝缘材料围绕的电极材料构成的复合材料来制造复合材料时，导电电极材料和绝缘材料两者都是可塑性变形的，因此使得两种物质可以一同挤出成为复合材料。这使得制造成本非�：纤�。
此外，本发明还涉及一种制造根据本发明所述的元件的方法，它具有以下步骤a)提供一个具有穿孔的不导电板，b)向板的第一侧施加一种浆状固化电极材料，c)将电极材料压入穿孔中，和d)除去存在于穿孔之间、使所述穿孔中的电极材料彼此导电接触的所述电极材料。
所述固化可以例如通过聚合、干燥或冷却来实现。步骤c)可以与步骤b)的实施同时进行，也可以在步骤b)之后。所述方法可以以丝网印刷法的方式进行，只不过施加的是电极材料而不是油墨。
本发明还涉及一种制造根据本发明所述的元件的方法，它具有以下步骤a)提供一个具有穿孔的不导电板，b)在板的第一侧放置一个具有至少部分地与所述穿孔相应的孔眼的孔眼掩模，或放置一个具有至少部分地与所述穿孔相应的可透区域的丝网印刷掩模，以使所述孔眼或区域与板的所述穿孔至少部分地一致，c)向所述孔眼掩模或丝网印刷掩模上施加一种浆状固化电极材料，
d)将电极材料通过所述孔眼或可透区域压入穿孔，和e)从板上除去孔眼掩模或丝网印刷掩模。
本方法具有下列好处，即通过步骤e)，显著简化了过量电极材料的去除，且由于孔眼掩模或丝网印刷掩模的高度，电极被提升到板的第一侧上，所以使得较大电极表面成为可能。由于，对于同一板，在重复实施步骤b)-e)过程中利用所述孔眼掩模或丝网印刷掩模使不同穿孔被覆盖和仍保持开放，所以可以将不同的电极材料压入穿孔。特别是电极材料可以具有不同的对被分析物特定的分子。
本发明还涉及一种制造根据本发明所述的元件的方法，它具有以下步骤a)提供一个不导电板，b)在板上制造穿孔，c)在穿孔中制造通路以制造贯穿板的导电体，和d)向板的第一侧的通路中施加浆状固化电极材料，在步骤b)中所述穿孔可以通过钻孔、特别是利用激光束来制造。
通路就是由不导电板的第一侧和第二侧形成于此的两个层之间的一个导电连接。通路通常用在电路板或集成电路中。通路的制造方法是普遍已知的。就根据本发明所述的方法来说，优选使制造的通路不伸出由板的第一侧构成的平面之外。通路的横向伸展应当足够小，使得优选通过丝网印刷法施加在第一侧上通路末端的电极的形成不受影响。由于通路往往在其内部具有管状开口，所以上述影响是有可能的。如果所述开口过大，施加到通路的浆状或液体电极材料可能穿过所述开口，并且，不是将后者密封，而是可能导致所述板或根据本发明所述的元件变得可透过液体。优选所述通路在它们位于板的第一侧的末端具有一个特别是平的、连续的即没有开口的表面。
所述通路可以包含例如一个薄铜层。优选在步骤c)中，通路是通过在穿孔中电沉积或向穿孔中插入一种相应的导体而制成的。电极材料可以通过压印或如丝网印刷的方法施加。两种技术都在电极的制造中已知。在此，它们使得可以特别合算和精确地制造根据本发明所述的元件。对于压印的情形，排成与期望的电极图案相应的图案的浆状电极材料被衬垫吸收。然后通过在预定图案形式的衬垫上进行压制，将电极材料施加在不导电板上。通过如丝网印刷的方法所制造的电极称为“丝网印刷电极”。
可以向电极材料上施加一个特别是对被分析物特定的涂层。也可以向电极材料中引入对被分析物特定的分子。两种操作都可以在上述每个步骤之前、之后或之间进行。在本发明意义上的电极材料包括用来制造电极的材料和由其形成的电极。俘获分子，特别是电化学惰性俘获分子，可以作为涂层或对被分析物特定的分子施加或引入到电极材料中。在各种情况下，可以向电极或电极材料施加不同的涂层。在各种情况下，可以向电极材料中引入不同的对被分析物特定的分子。所用俘获分子可以是特别是单股的核酸、核酸类似物、配位体、半抗原、肽、蛋白质、糖、类脂物或离子交换剂。俘获分子可以共价地或定向地结合在电极材料上，或者以合成方式或电化学方式沉积在电极材料上。优选俘获分子借助于特别是电化学基本惰性的中间层至少部分地与电极材料结合或合成在中间层上。中间层优选是由硅烷制成的。电极材料上可以涂有至少一层半透覆盖层。这也可以在除了具有俘获分子的涂层之外施加。在各种情况下，所述电极材料或电极可以用具有不同的渗透性的半透覆盖层涂覆。由电极材料形成的每个电极可以具有不同的涂层。
本发明还涉及一种电接触连接根据本发明所述的元件的方法，多个可以单独导出的导电体与元件的板的第二侧发生接触，从而使导电体在这种情况下至少部分地接触连接电极，使得电极可以单独地电导出。优选导电体以一种允许弹簧变位的方式安装并与板的第二侧发生接触，从而使它们在这种情况下实现弹簧变位。举例来说，具有突出管脚的接触板可用于此目的。所述电接触连接还可以通过弹性连接器，特别是ZEBRA弹性连接器来实现。弹性连接器包含交替的导电和不导电弹性体特别是硅氧烷弹性体层。所述弹性连接器可以以片状的形式形成，上述各层与表面垂直。导电层中加入了例如由银、金或碳制造的导电纤维或颗粒。ZEBRA弹性连接器是由Fujipoly AmericanCorporation，900 Milik Street P.O.Box 119，Carteret，NJ 07008，USA出售的。通过向板的第二侧施加ZEBRA弹性连接器并在板与ZEBRA弹性连接器之间的接触区施加轻微的压力，使电极与导电层发生电接触。电极可以通过导电层接触连接而电导出到电子计算单元。
此外，本发明还涉及根据本发明所述的元件在探测液体中的至少一种被分析物中的应用，所述液体在元件的板的第一侧与电极发生接触，且所述电极从所述板的第二侧电接触连接。在这种情况下，液体优选是在被分析物或由于被分析物的存在而形成的一种物质，如被分析物的一种分解产物，与电极中存在的俘获分子相结合的条件下与电极发生接触的。与俘获分子结合在一起的所述被分析物或物质的检测可以以电学方式，如通过电导率测量，或以电化学方式、光学方式、光电方式、利用酶、利用电致发光或化学发光来实现。所述检测也可以通过上述检测方法的组合来实现。对于电化学检测的情形，有利地是所述被分析物或物质与电极之间可直接接触。对于光学检测，可以测量电极上的光学信号，例如荧光。在这种情况下，所述被分析物或物质是例如通过用光学检测辨认出荧光被分析物或荧光物质借助于俘获分子所特定结合的电极来确定的。由于电极可以指定给某一特定的俘获分子，所以就可以确定出所述被分析物或物质。在此检测方法中，电极是用来电吸引和/或推斥带电被分析物或物质的。通过向电极上施加相应的电势，带电被分析物或带电物质可以被电转移到俘获分子区域。通过被分析物或物质在俘获分子区域逐渐集中，可以加速被分析物或物质与其的结合。未结合的或弱结合和非特定结合的被分析物或物质可以通过向电极施加排斥电势而从其上去除。在这种情况下，有利的是俘获分子通过一个被分析物或物质不可渗透的中间层固定在电极上。这防止了所述被分析物或物质与电极直接接触时被电化学转化。这也使得可以施加高电势，以将所述被分析物或物质快速转移到俘获分子上。
电极上可以涂有一个半透覆盖层。这使得可以有选择性地只检测透过所述覆盖层的被分析物、被分析物的分解产物或所述物质。所述检测可以以电学方式、电化学方式、光学方式、光电方式、利用酶、利用电致发光或利用化学发光实现。也可以通过上述检测方法的组合来实现。优选每个电极上涂有渗透性不同的半透覆盖层。
被分析物可以是生物分子，特别是核酸、蛋白质、抗原、糖、类脂物、细胞或病毒。它可具有一种标记物质。标记物质可以为例如一种酶或一种氧化还原活性标记物。在元件的使用中，可能会以电化学方式探测到氧化还原反应或氢气的催化释放。所述电化学检测可以例如通过差动脉冲伏安法(DPV)、计时电位滴定溶出分析(CPSA)或检测电阻或阻抗的变化来实现。
电化学检测可以包括以下步骤a)提供一个根据本发明所述的元件，该元件具有至少一个反电极和一个参比电极以及许多工作电极，b)使液体与工作电极、反电极以及参比电极发生接触，c)同时在工作电极和参比电极之间施加一个预定电压外形，和d)测量流过工作电极的电流，测量过程中将所有工作电极都保持在同一电势。
优选选择基本上只有所述被分析物或物质能引起信号的电势间隔来进行电化学检测的测量。
优选地，电极、特别是含碳电极在检测被分析物之前用洗涤剂处理过。这可以在含有被分析物的液体与电极接触之前或在它们接触之时进行。所述洗涤剂处理可以代替电化学调节。它比电化学调节更简单、更快捷而且成本也更合算。电极可以贮存在含洗涤剂的液体中，例如浸在所述液体中。优选所述洗涤剂是离子型洗涤剂。洗涤剂有利地以0.1-10％的浓度存在。优选洗涤剂在水中的临界胶束浓度小于10mmol/l，特别是小于5mmol/l，更优选小于3mmol/l。所述洗涤剂可以是十二烷基硫酸钠。
参照附图对本发明的典型实施方案进行更详细地说明，其中
图1a-e是一种制造根据本发明所述元件的方法的示意图，图2a-b是一种通过切断由电极材料和绝缘材料制成的复合材料来制造根据本发明所述元件的方法的示意图，图3a-d是一种制造由平行排列的细长形电极材料和绝缘材料制成的复合材料的方法的示意图，图4a-d是一种通过挤出和切断上面制造的复合材料来制造根据本发明所述检测装置的方法的示意图，图5a-c示出一种用来制造检测装置的基板，图6a-d是一种类似丝网印刷的制造根据本发明所述元件的方法的示意图，图7a-b是一种用于电接触连接根据本发明所述的检测装置的方法和元件的示意图，图8a-b是一种制造具有4×4个电极的芯片的方法的示意图，
图9示出芯片的模型，图10示出使用所述芯片并联地对鲱鱼精于DNA进行双DPV测量的结果，和图11a-c是具有根据本发明所述检测装置的微流体室的示意图。
图1a示出一个可塑性变形的电绝缘基体10，它具有第一侧12和第二侧14。图1b示出四个由钢笔芯制成的电极15。图1c示出其中通过机械压力插入了电极15的基体10，插入的方式是使得每个电极都投射到第一侧12和第二侧14上。在插入电极15之后，可以固化基体10。图1d示出最终的检测装置17的俯视图，图1e是该装置的侧视图。如图2a所示，装置17可以沿线16多次垂直切断，从而被分成如图2b所示的根据本发明所述的圆盘式装置。在这种情况下，每个电极15都与相应的圆盘的上侧和下侧相接触。
在图3a是一个电极15的横截面图，图3b是它的俯视图，电极15具有包括绝缘材料的夹衬板18。图3c和3d是由所述电极构成的复合材料的横截面图和俯视图，所述复合材料是通过连接夹衬板18产生的。箭头20指示了复合材料上为由其制造根据本发明所述的圆盘式元件17而可以将其切断的位置。
图4a显示了具有四个平行的第一穿孔22的电绝缘基体10。所述基体10可以例如包含塑料并通过注射成型法制造。可以将一种包括导电电极材料15的组合物压入基体10的第一穿孔22中。这例如可以通过现在钢笔芯制造中常用的挤压法来实现。电极材料15可以是一种用来制造钢笔芯的材料。此外在电极材料15实际固化前，可以在箭头20所示位置垂直于充满电极材料15的第一穿孔22将基体10切断。从而得到根据本发明所述的圆盘式元件17，其透视图如图4c，其俯视图如图4d。作为机械切断所述由电极材料15和基体10制成的复合材料的替代，多个具有第一穿孔的圆盘式基体10可以上下层叠，以保持第一穿孔22一致。当在所述层叠的一端填入电极材料15时，圆盘式基体10的所有第一穿孔22也都被填满。然后可以在电极材料固化前将所述层叠拆开。
图5c是一个板型基体10的横截面图，该基体具有第一侧12和第二侧14。图5b是此基体10从第二侧14的俯视图，图5a是它从第一侧12的俯视图。基体10具有从第一侧12到第二侧14渐宽的圆锥形穿孔22。在图6a中，板型基体10在第一侧12上覆盖了孔眼掩模24，所述孔眼掩模具有与第一侧12上的穿孔22相符的孔26。图6b显示了被施加到孔眼掩模24上的导电性浆状电极材料15。图6c显示了被以类似丝网印刷的方法压入孔眼26和穿孔22之后的电极材料15。图6d显示了去除孔眼掩模24之后的根据本发明所述的元件17。
图7a和7b示出一种用来电接触连接36检测装置17的元件。在这种情况下，所述电接触连接元件36包含由电绝缘材料制成的弹性基体28。导电管脚30平行排列在所述基体28中并在所述基体的底面上电连接到触点34。管脚被弹簧32从弹性基体中挤出。管脚30优选逐渐变细直到在用来接触连接的一侧成为一个点。在图7b中所示的通过电接触连接元件36的检测装置17的接触连接是通过相互挤压两个元件17、36来实现的。在这种情况下，管脚30与电极15发生接触。在这种情况下弹性基体28被挤压。从而，在这种情况下管脚30可以贯穿检测元件17内向第一侧12逐渐变细的穿孔22，并与电极15发生接触。由于管脚30的形状逐渐变细为点、逐渐变细的穿孔22和电极15的形状，在管脚30和电极15之间形成了一个扩大的接触区。
图8a显示了用来以绝缘材料例如环氧树脂封装电极15的在组装之前的一套覆层39和电极架40，图8b是组装之后的示意图。其中一个覆层39具有开口41，用于填入绝缘材料中。由电极和绝缘材料通过绝缘材料的聚合而制成的复合材料可被切断，从而制造出具有4×4个电极的芯片形式的圆盘式检测元件17。这种元件17显示于图9中。在这种情况下，钢笔芯充当电极材料。将其中一个芯片的电极在pH4.6的0.1M醋酸钠缓冲液中以1.2V的电压电化学处理或调节1min。将另一个芯片的电极用10％的SDS处理1min。为使电极硅烷化，室温、轻微振动条件下将芯片在含有1％(v/v) 3-(缩水甘油基氧丙基)-三甲氧基硅烷(Fluka)、1％(v/v)去离子水(Millipore)和98％(v/v)乙醇(Merck)的溶液中培养1h。然后将它们在80℃干燥30min。
具有序列5′cct icc cca atc cct tta tt 3′-aminolink(SEQID NO1-aminolink)的低聚核苷酸TNF2(其中i代表次黄嘌呤核苷部分)作为俘获分子偶联在经硅烷化的电极上。低聚核苷酸是一种包含人体肿瘤坏死因子α基因的c-DNA的序列，所述序列具有一个aminolink。为了偶联，将pH值为9.5、含150pmol/ml低聚核苷酸的0.1M Na2CO3溶液每次取一滴放在芯片的每个电极上。然后室温下将芯片在湿润的室中培养一小时。在这种情况下，低聚核苷酸的自由氨基与硅烷形成共价键。为分离没有形成共价键的低聚核苷酸，室温下将芯片在2ml 10％的SDS中培养一小时。为浸透仍然存在的结合部位，室温下将芯片在1％的牛血清白蛋白(BSA)或乙醇胺在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液中培养一小时。
为研究电极处理对电化学核酸检测的灵敏度和再现性的影响，将芯片在10nmol/ml补充核酸TNF2k(SEQ ID NO2)在含洗涤剂的混合缓冲液(Roche)中的溶液里培养，结合的核酸TNF2k是通过DPV确定的。每次用所述电化学或洗涤剂处理过的电极进行十个测量。洗涤剂处理导致灵敏度与用电化学处理相比增加10％以上。此外，使用洗涤剂处理过的电极还改进了测量的再现性。用洗涤剂处理过的电极进行测量的标准偏差比用电化学处理的低3倍。
图10示出使用图9所示的元件17对鲱鱼精子DNA并联地进行DPV测量时所测定的两条伏安曲线。为此，元件17的电极材料通过所述电极材料第二侧的弹簧触点管脚与电子计算单元相连。其中一个电极连接为参比电极。将2μg/μl的鲱鱼精子DNA在TE缓冲液(10nMTrisCl，1mM EDTA，pH8)中的溶液取100μl施加到元件的第一侧并培养10min。在鸟嘌呤和腺嘌呤的氧化的基础上，利用DPV在多个电极上平行地检测所述DNA。在这种情况下，测到了与其位置一致的显著的鸟嘌呤和腺嘌呤氧化峰。
图11a示出一个具有多个电极15和液体通道的断口46的组装后的微流体室42的俯视图。图11b是微流体室42的上部44的俯视图，图11c是由根据本发明所述的元件17形成的所述室的下半部的俯视图。
序列表<110>november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin<120>检测被分析物的元件<130>432739EH<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人<220>
<221>modified_base<222>(4)<223>i<400>1cctnccccaa tccctttatt 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人<400>2aataaaggga ttggggcagg 20
权利要求
1.一种用来检测液体中的被分析物的元件(17)，它具有多个彼此绝缘并排列在不透液体的不导电板(10)的第一侧(12)上的电极(15)，所述电极(15)至少部分地具有对被分析物特定的涂层或对被分析物特定的分子并能通过贯穿所述板(10)的导电体从该板的第二侧(14)电接触连接和单独导出，所述涂层或分子由于对被分析物或由于被分析物的存在而形成的物质具有特定的亲合力，所以对被分析物是特定的，且所述元件没有引出线。
2.根据权利要求1所述的元件(17)，所述导电体与电极(15)一起构成为一片。
3.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中电极(15)上的所述涂层或对被分析物特定的分子在各种情况下均是不同的。
4.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中所述涂层或对被分析物特定的分子包括特别是电化学惰性的俘获分子。
5.根据权利要求4所述的元件(17)，其中所述俘获分子是特别为单股的核酸、核酸类似物、配位体、半抗原、肽、蛋白质、糖、类脂物或离子交换剂。
6.根据权利要求4或5所述的元件(17)，其中所述俘获分子共价地和/或定向地结合在电极(15)上。
7.根据权利要求4-6之一所述的元件(17)，其中所述俘获分子至少部分地通过特别是电化学基本惰性的中间层与电极(15)结合在一起。
8.根据权利要求7所述的元件(17)，其中所述中间层由硅烷构成。
9.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中所述涂层包括电极(15)的至少一个半透覆盖层。
10.根据权利要求9所述的元件(17)，其中所述半透覆盖层在各种情况下具有不同的渗透性。
11.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中所述导电体设置在板(10)的穿孔(22)中，所述穿孔(22)从板(10)的第二侧(14)向第一侧(12)特别是成圆锥形逐渐变细。
12.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中所述板(10)设置在微流体室(42)的底上或构成微流体室的底。
13.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中所述板(10)是一个芯片。
14.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中所述板(10)上每平方厘米具有10个以上，优选20、40、80、100或160个以上，特别优选1000个以上，尤其是10000个以上的电极。
15.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中所述电极(15)至少部分地由颗粒构成。
16.根据上述权利要求之一所述的元件(17)，其中所述电极(15)至少部分地由非金属导体特别是碳构成。
17.根据权利要求16所述的元件(17)，其中所述电极至少部分地是铅笔电极、玻璃碳电极、含碳纤维的电极、碳膏电极或塑料复合电极，优选含单质碳，特别是石墨或炭黑形式的单质碳的聚碳酸酯电极。
18.一种包含上述权利要求之一所述的元件(17)的测量装置，其中电极(15)包括至少一个参比电极和至少一个反电极以及多个工作电极，所述测量装置包括多个电流/电压转换器，一个恒电位仪和一个用来测量流过工作电极的电流的装置，且所述电极(15)与恒电位仪电连接以在工作电极和参比电极之间产生预定的电压外形，其中所述电流/电压转换器之一与每个工作电极的下游相连，以将所有工作电极保持在同一电势。
19.一种制造根据权利要求1-17之一所述的元件(17)的方法，它具有以下步骤a)制造由基本上平行排列的细长形电极材料(15)和环绕电极材料(15)的绝缘材料构成的复合材料，该复合材料是通过如下步骤制造的-用固化绝缘材料包封固体电极材料(15)，-将固体电极材料(15)插入固体绝缘材料的基本平行的断口或穿孔(22)中，或插入可塑性变形的绝缘材料中，-将浆状或液体固化电极材料(15)填入固体单片绝缘材料或具有一致排列的穿孔(22)的层叠板型绝缘材料的基本平行的断口或穿孔(22)中，-通过熔融、灌注或粘性结合夹衬板连接具有包含绝缘材料的夹衬板(18)的电极材料(15)，或-将由被绝缘材料(18)围绕的电极材料(15)构成的复合材料挤出，和b)通过切、锯或借助于分离盘，或者通过拆分所述层叠板型绝缘材料，以基本垂直于电极材料(15)的纵向分离所述复合材料。
20.一种制造根据权利要求1-17之一所述的元件(17)的方法，它具有以下步骤a)提供一个具有穿孔(22)的不导电板(10)，b)向板(10)的第一侧(12)施加浆状固化电极材料(15)，c)将电极材料(15)压入穿孔(22)中，和d)除去存在于穿孔(22)之间、使所述穿孔中的电极材料(15)彼此导电接触的所述电极材料(15)。
21.一种制造根据权利要求1-17之一所述的元件(17)的方法，它具有以下步骤a)提供一个具有穿孔(22)的不导电板(10)，b)在板(10)的第一侧(12)上放置一个具有至少部分地与所述穿孔(22)相应的孔(26)的孔眼掩模(24)，或放置一个具有至少部分地与所述穿孔相应的可透区域的丝网印刷掩模，以使所述孔(26)或所述区域与板(10)的所述穿孔(22)至少部分一致，c)向所述孔眼掩模(24)或丝网印刷掩模上施加一种浆状固化电极材料(15)，d)将电极材料(15)通过所述孔或可透区域压入穿孔(22)，和e)从板(10)上除去孔眼掩模(24)或丝网印刷掩模。
22.一种制造根据权利要求1-17之一所述的元件(17)的方法，它具有以下步骤a)提供一个不导电板(10)，b)在板(10)中制造穿孔，c)在穿孔中制造通路以制造贯穿板(10)的导电体，和d)向板(10)的第一侧(12)的通路中施加浆状固化电极材料(15)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在步骤b)中所述穿孔是通过钻孔、特别是利用激光束来制造的。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中在步骤c)中所述通路是通过在穿孔中的电沉积或通过向穿孔中引入一种相应的导体而制造的。
25.根据权利要求22-24之一所述的方法，其中所述电极材料是通过压印或如丝网印刷的方法施加的。
26.根据权利要求19-25之一所述的方法，其中被施加到电极材料(15)上的对被分析物特定的涂层或对被分析物特定的分子被引入到电极材料(15)中。
27.根据权利要求26所述的方法，其中俘获分子，特别是电化学惰性的俘获分子，以涂层或对被分析物特定的分子形式而被施加或引入。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中在各种情况下不同的涂层被施加到电极材料(15)上，或在各种情况下不同的对被分析物特定的分子被引入到电极材料(15)中。
29.根据权利要求26-28之一所述的方法，其中所用的俘获分子为特别是单股的核酸、核酸类似物、配位体、半抗原、肽、蛋白质、糖、类脂物或离子交换剂。
30.根据权利要求26-29之一所述的方法，其中所述俘获分子共价地和/或定向地结合在电极材料(15)上，或者合成或电化学沉积在电极材料(15)上。
31.根据权利要求26-30之一所述的方法，其中所述俘获分子至少部分地通过特别是电化学基本惰性的中间层与电极材料(15)结合在一起，或合成在中间层上。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述中间层由硅烷构成。
33.根据权利要求19-32之一所述的方法，其中所述电极材料(15)上涂有至少一个半透覆盖层。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述电极材料(15)在各种情况下涂有渗透性不同的半透覆盖层。
35.一种电接触连接根据权利要求1-17之一所述的元件(17)的方法，其中多个可以单独导出的导电体(30)与所述元件(17)的板(10)的第二侧(14)发生接触，从而使得在这种情况下的导体(30)至少部分地与电极(15)接触连接，使得电极(15)可以单独地电导出。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述导体(30)以一种允许弹簧变位的方式安装并与板(10)的第二侧(14)发生接触，从而使得在这种情况下它们实现弹簧变位。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述电接触连接是通过弹性连接器，特别是ZEBRA弹性连接器实现的。
38.根据权利要求1-17之一所述的元件(17)在检测液体中的至少一种被分析物中的应用，其中所述液体在元件(17)的板(10)的第一侧(12)与电极(15)发生接触，且所述电极(15)从所述板的第二侧(14)电接触连接。
39.根据权利要求38所述的应用，其中所述液体是在被分析物或由于被分析物的存在而形成的物质与电极(15)中存在的俘获分子相结合的条件下与电极(15)发生接触的，且与俘获分子结合在一起的所述被分析物或所述物质的检测是通过电学方式、电化学方式、光学方式、光电方式、利用酶、利用电致发光或利用化学发光或通过它们的组合来进行的。
40.根据权利要求38或39所述的应用，其中至少一个电极(15)上涂有一个半透覆盖层，并且只选择性地检测透过所述覆盖层的被分析物、被分析物的分解产物或物质，所述检测是通过电学方式、电化学方式、光学方式、光电方式、利用酶、利用电致发光或利用化学发光或通过它们的组合进行的。
41.根据权利要求38-40之一所述的应用，其中所述被分析物是生物分子，特别是核酸、蛋白质、抗原、糖、类脂物、细胞或病毒。
42.根据权利要求38-41之一所述的应用，其中所述被分析物具有一种标记物质。
43.权利要求38-42之一所述的应用，其中电化学检测氧化还原反应或氢气的催化释放。
44.根据权利要求38-43之一所述的应用，其中所述电化学检测通过差动脉冲伏安法(DPV)、计时电位滴定溶出分析(CPSA)或检测电阻或阻抗的变化来实现。
45.根据权利要求38-44之一所述的应用，其中所述电化学检测包括以下步骤a)提供一个根据权利要求1-17之一所述的元件(17)，该元件(17)具有至少一个反电极和一个参比电极以及多个工作电极，b)使液体与工作电极、反电极以及参比电极发生接触，c)同时在工作电极和参比电极之间施加一个预定电压外形，和d)测量流过工作电极的电流，测量过程中将所有工作电极都保持在同一电势。
46.根据权利要求38-45之一所述的应用，其中选择基本上只有所述被分析物或物质引起信号的电势间隔来进行电化学检测的测量。
47.根据权利要求38-46之一所述的应用，其中特别是含碳的电极(15)在检测被分析物之前用洗涤剂处理过。
48.根据权利要求47所述的应用，其中所述洗涤剂是离子型洗涤剂。
49.根据权利要求47或48所述的应用，其中所述洗涤剂以0.1-10％w/v的浓度存在。
50.根据权利要求47-49之一所述的应用，其中所述洗涤剂在水中的临界胶束浓度小于10mmol/l，特别是小于5mmol/l，优选小于3mmol/l。
51.根据权利要求47-50之一所述的应用，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠。
全文摘要
本发明涉及一种用来探测液体中的被分析物的元件(17)，它具有多个排列在不透液体的不导电板(10)的第一侧(12)上但彼此绝缘的电极(15)。所述电极(15)至少部分地具有一个对被分析物特定的涂层或对被分析物特定的分子。贯穿板(10)的导电体可以，从板的第二侧(14)，电接触并单独输出。所述涂层或分子对被分析物或由于被分析物的存在而形成的一种物质有特定亲合力。此外，所述元件没有渗漏。
文档编号G01N27/02GK1768261SQ03820113
公开日2006年5月3日 申请日期2003年6月27日 优先权日2002年6月28日
发明者J·许莱因, C·库格勒, B·梅里克, H·科萨克, J·哈斯曼, B·格拉斯尔, D·库尔梅尔 申请人:诺文伯股份公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
