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专利名称：一种多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地讲，本发明涉及一种靶向肿瘤血管内皮生长因子受体-2 (VEGFR-2)的多肽以及该多肽的应用。
背景技术：
肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一。传统的肿瘤治疗方法包括手术治疗、放射治疗和化学治疗。上述的肿瘤治疗方法存在各种弊端，例如，手术治疗只适用于体积较大、影像技术可检测的良性实体瘤，对于体积较小的肿瘤或者转移性肿瘤无能为力；放射疗法对体积较大的肿瘤有效但对局部组织的损伤较大；化学疗法需要全身给药，针对性差，给患者造成巨大的毒副作用。鉴于以上肿瘤治疗方法中的缺陷，研究人员一直努力开发可用于肿瘤早期定位诊 断及有效治疗的药物和办法。肿瘤靶向分子的出现为解决这一难题提供了思路，其中，肿瘤靶向治疗是一种基于肿瘤靶向分子的治疗技术，其具有特异性强、效果显著、基本不损伤正常组织的特点。寻找表达于肿瘤细胞表面的特异蛋白是实现肿瘤靶向治疗的关键。肿瘤血管内皮生长因子受体(VEGFR)是特异地表达于肿瘤细胞内的蛋白质，通过抑制VEGFR的活性可以有效地阻断肿瘤血管的生长。VEGFR具有多种亚型，在所有VEGFR的亚型中，仅肿瘤血管内皮生长因子-2 (VEGFR-2，又称FLK-1/KDR)既在细胞的生长和分化中起重要作用又与内皮细胞的增殖和血管的生成有关，请参见Shibuya M. Vascular endothelial growthfactor receptor-2: its unique signaling and specific ligand, VEGF-E.CancerSci2003; 94(9) :751_756，以及Pradeep CR，Sunila ES，Kuttan G. Expression of VascularEndothelial Growth Factor(VEGF)and VEGF Receptors in Tumor Angiogenesis andMalignancies. Integrative Cancer Therapies2005; 4 (4) : 315。在肿瘤组织中，VEGFR-2 主要表达于肿瘤血管内皮细胞，而在肿瘤上皮细胞中不表达或低表达。这说明VEGFR-2在促进血管发生及再生中起着非常重要的作用，所以开发针对VEGFR-2的抑制剂将有效抑制肿瘤的生长。目前，已经开发出针对VEGFR-2的单克隆抗体，请参见Prewett M, HuberJ, LiY, Santiago A, 0’Connor W, King K, Overholser J, Hooper A, Pytowski B, WitteL. Antivascular Endothelial Growth Factor Receptor(Fetal Liver Kinasel)Monoclonal Antibody Inhibits Tumor Angiogenesis and Growth of Several Mouse andHuman Tumors. Cancer Research. Volume59:AACR; 1999. p5209_5218。但该单克隆抗体的毒副作用及长期效应仍需进一步鉴定。鉴于多肽在靶向药物治疗上与抗体相比具有分子量小、抗原性低、作用迅速、较易体外及生物合成等优点，并且可以具有普通蛋白质的功能，因此多肽可以直接用作抗肿瘤药物，也可以与其他方法合用而作为靶向引导分子使用。因此，开发靶向VEGFR-2的多肽十分必要。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种靶向VEGFR-2的多肽及该多肽在制备用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中的应用。本发明的一方面提供了一种多肽，该多肽具有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列。本发明的另一方面提供了一种上述多肽在制备用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中的应用。根据本发明的多肽可以与VEGFR-2特异性地结合，从而可以有效地抑制肿瘤血管的生长。此外，由于根据本发明的多肽可以与VEGFR-2特异性地结合，所以根据本发明的多肽可以应用于用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中。


通过结合附图进行的示例性实施例的以下描述，本发明的这些和/或其他方面和优点将变得清楚和更易于理解，其中图I是示出偶联有磁珠的多肽与细胞结合情况的显微照片；图2示出了经磁力架分离得到的沉淀和上清液中的细胞量；图3a示出了通过核磁成像仪对细胞进行检测得到的图片；图3b示出了不同浓度的超顺磁纳米颗粒经核磁成像仪成像的图片。
具体实施例方式根据本发明的具有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的多肽通过细菌表面展示随机肽库和流式细胞分选技术筛选得到，得到的多肽可以与肿瘤血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)特异性地结合。因此，根据本发明的多肽可以有效地抑制肿瘤血管的生长，并可以应用于用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中，例如，根据本发明的多肽可以应用在肿瘤药物靶向运输体系中。下面示例性实施例中未注明条件的实验方法可以按本领域内的常规的实验方法进行，例如，可以参照 Sambrook 等人的《Molecular cloning:a laboratory manual)) (NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。在以下实施例中，SOC 培养基如无特别说明则指在灭菌后加入了 34 u g/mL氯霉素和34mg/mL葡萄糖的培养基。LB液体和固体培养基指灭菌后加入34 V- g/mL氯霉素的培养基。I、构建细菌表面展示随机肽库首先，对外膜蛋白(OmpX, outer membrane protein X)进行改造,在OmpX的C端和N端分别连接上GGSG连接分子，并在OmpX第2个环(loop)的s53和s54残基之间打开，形成游离于胞外的 C00H 端和 NH2 端，成为 CPX (circularly permuted outer membraneprotein OmpX)骨架(请参见 Rice et al. (2006)protein Sci. 15，825-836)。然后，将包含与VEGFR-2有较好亲和性的序列FF/YEXWGVK的氨基酸序列连接到CPX骨架的N端。具体地讲，将序列FF/YEXWGVK两侧分别连接有任意5个亲水氨基酸的多肽连接到CPX的N端。编码上述多肽的序列用PCR方法扩增得到。PCR反应的模板是质粒PB33CPX-SAP印，该质粒的详细信息请见Rice J, J. and Daugherty, PS. (2008) Directed Evolution of a BiterminalBacterial Display Scaffold Improves the Display of Diverse Peptides, ProteinEng. Des Sel. 2008，21 (7)，435-42，正向引物为CGTAGCTGGCCAGTCTGGCCAGNVSNVSNVSNVSNVSTTYTTY/TAYGARNNSTGAGGNGTNAARNVSNVSNVSNVSNVSGGAGGGCAGTCTGGGCAGTC，其中，N 代表 A、T、C、G 中的任意核苷酸，V 代表 A、C 或G, S代表C或G，Y代表T或C，R代表A或G;反向引物为GGCTGAAAATCTTCTCTC。PCR扩增产物用SfiI酶切后连接到经相同酶切的pB33CPX载体中下游的alajGFPl(BeSSette，P.H.etal. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterialdisplay. (2004)Protein Eng. Des. Sel. 17, 731-739)多克隆位点上。改造后的 pB33CPX质粒在araBAD (阿拉伯糖启动子)的控制下可以同时表达CPX表面展示多肽及alajGFPl绿色突光蛋白(Dane, K. Y. et al. Isolation of cell specific peptide ligands usingfluorescent bacterial display libraries (2006)J. Immunol Methods. 309，120-129)。将改造过的包含多肽(序列FF/YEXWGVK两侧分别连接有任意5个亲水氨基酸的多肽)的编码序列的PB33CPX质粒转化入大肠杆菌MC1061菌株[F_araD139 A (ara-leu) 7696galE15 galK16 A (lac)X74 rpsL (StrR) hsdR2(rK-mKt)mcrA mcrBl](Casadaban and Cohen, 1980)，从而完成细菌表面展示随机肽库的构建。该细菌展示肽库包含大约2 X IO8种多肽。2、通过磁珠分选降低细菌表面展示随机肽库的容量使用从Invitrogen公司购得的商品号为F6347的蛋白荧光生物素标记试剂盒(Fluoreporter mini-biotin-xx protein labeling Kit)对 VEGFR-2 蛋白进行生物素化(biotinylated)，其中，VEGFR-2蛋白(编码核苷酸265bp_2493bp)是从PR0SPEC公司购得，商品号为PKA-242。从上述细菌表面展示随机肽库中取100 U L接种到IOOmL SOC培养基中，在37°C、200转/分的条件下过夜培养。从过夜培养的细菌中取出2-3mL并加入IOOmL LB培养基中，在37°C、200转/分的条件下培养2小时至OD6tltl值在0. 5-0. 6之间。以200 u g/mL的量加入阿拉伯糖在室温(约25°C)、200转/分的条件下诱导培养约lh，其OD6tltl值达到0. 8-1. 0，按照一个OD等于I X IO9个细胞计算出细菌总数。按照蛋白细菌为大约500:1 (个数比)的比例将细菌与生物素化的VEGFR-2蛋白混合，使混合液中VEGFR-2蛋白的浓度为10nM，在静音旋转混合器上4°C共同孵育45分钟。孵育结束后在3800转/分、4°C的条件下离心，移除上清液，并将沉淀重悬在ImL PBS缓冲液中。沉淀中部分细菌的表面具有特异性结合有与生物素化的VEGFR-2蛋白的多肽。接下来,利用链霉亲和素与生物素特异结合的原理,用从Invitrogen公司购得、商品名为Dynabeads MyOne 、商品号为656-01的包被有链霉亲和素的磁珠将这部分细菌吸附下来。按照磁珠细胞为大约1:100 (个数比)的比例将磁珠与重悬在PBS缓冲液中的细菌混合，4°c共同孵育45分钟后放入磁架(从Invitrogen公司购得)中，与磁珠结合的细菌在磁力作用下可以吸附到靠近磁架的管壁，弃除上清。用PBS缓冲液清洗沉淀3次后用ImL LB重悬，取出IOii L稀释100倍，在测量0D_值后涂在固体LB平板上，37°C过夜培养，第二天根据长成的细菌克隆数量计算磁珠分选后的细菌库容量。剩下的细菌重悬在5mL的SOC培养基中，在37°C、200转/分的条件下过夜培养。3、流式筛选前细菌准备及蛋白染色
取100 ii L过夜培养的细菌接种到5mL的LB培养基中，在37°C、200转/分的条件下培养约2h至0D_值在0. 4-0. 6之间，以200 u g/mL的量加入阿拉伯糖，室温下诱导细菌表面展示随机多肽库的表达，约Ih后细菌的0D_值为0. 8-1. 0，计算细菌总体个数。从经阿拉伯糖诱导表达的细菌中取10 y L，在3000转/分、室温的条件下离心5分钟，弃除上清，将沉淀重悬在ImL PBS缓冲液中。按照蛋白细菌为大约10:1 (个数比)的比例将生物素化的VEGFR-2蛋白与重悬在PBS缓冲液中的细菌混合，在4°C、温和旋转(例如，20转/分)共孵育45分钟。然后，在4°C、3000转/分的条件下离心5分钟，弃除上清，将沉淀重悬在IOOii L SAPE染液中，在4°C、温和旋转(例如，20转/分)的条件下共同孵育45分钟。孵育结束后，在4°C、3000转/分的条件下离心5分钟，弃除上清。根据流式细胞仪对细胞分选的每秒300-5000个的要求，将沉淀重悬在相应体积的PH值为7. 4的PBS缓冲液中，本实施例中，将沉淀重悬在500 ii L PBS缓冲液中，制备成细菌悬浮液以进行流式分选。

4、流式分选具有靶向VEGFR-2蛋白的多肽的细菌及多肽的测序 用未与VEGFR-2蛋白孵育的阴性细菌设置对照，调节流式细胞仪的整阈值(threshold),FSC.SSC和滤光片设置，让整群细菌出现在以FSC和SSC为横、纵坐标的散点图中，同时设置一个以相对荧光强度(FITC)构成的直方图，让阴性对照的荧光强度最小。将阴性细菌上样，记录10000个事件(events)的散射光与荧光强度的数值。将上述经蛋白染色的重悬在PBS缓冲液中的细菌上样。部分细菌表面展示的多肽可以特异结合VEGFR-2蛋白，这部分结合了生物素化VEGFR-2蛋白的细菌在488nm光源激发下发出的荧光强度比没有结合蛋白的细菌的荧光强度高。通过调节流式细胞仪的电压，利用流式细胞仪的分选功能将高荧光值的细菌分选出来，即，将表面结合有生物素化VEGFR-2蛋白的细菌分选出来。将分选出的细菌-蛋白复合体接种到5mL SOC培养基中过夜培养，培养期间蛋白降解，细菌得以富集。将富集的细菌再次进入流式分选流程。经过4轮筛选之后，细菌与多肽的结合率达到60%时，收集菌液并将收集的菌液接种到5mL LB培养基中，过夜培养。从过夜培养的细菌中取出IOii L涂布在LB固体培养基上，在37°C过夜培养。从平板上随机挑选40个单克隆细菌，分别接种到5mL LB液体培养基中，在37°C、200转/分的条件下过夜培养，并对过夜培养的细菌进行多肽的测序，这里，在上海生工工程有限公司对多肽进行测序。其中，序列为RSRNAFFELWGVKRETPG的多肽Vl出现频率最闻。5、验证靶向VEGFR-2的多肽在上海生工生物有限公司分别合成序列为RSRNAFFELWGVKRETPG的多肽Vl和序列为GGSSSGSSGGGSSGS的多肽Cl。使用Invitrogen公司的商品号为650. 11的DYNAL试剂盒将多肽Vl和Cl分别与磁性聚苯乙烯小球偶联(磁珠)。具体偶联过程如下a)取20 ii L (0. 2mg)直径为Iym的羧基化的磁性聚苯乙烯小球放入I. 5mL离心管中，用磁铁收集磁珠，吸出上清液，用ImL pH为6. 0浓度为15mM的MES缓冲液清洗磁珠两次；b)用100 ii L pH为6. 0浓度为15mM的MES缓冲液重悬磁珠，加入100 U L浓度为10mg/mL的EDC，室温旋转震荡30分钟，通过磁铁分离后收集磁珠；c)取Inmol的多肽Vl和Cl分别分散在500 u L pH为6. 0浓度为15mM的MES溶液中；d)将多肽溶液加入磁珠中，室温下旋转震荡过夜；f)磁铁分离收集磁珠，将1000 ill含0. 1% (体积百分比)的吐温20的PBS缓冲液加入磁珠并在旋转震荡仪上混匀进行清洗两次，每次10分钟，用磁铁分离，移走上清，从而得到偶联有多肽的磁珠； g)将偶联有多肽的磁珠放置在ImL含1% (体积百分比)BSA和0. 1% (体积百分比)吐温的pH值7. 4的PBS缓冲液中保存。分别取10 ii L偶联有磁珠的多肽Vl和Cl悬浮在200 U L PBS缓冲液中，加入种植在12孔板中的高表达VEGFR-2的黑色素瘤细胞B16和人肺成纤维细胞HLF中，其中，细胞 种植密度为每孔I万个，培养基为含10%胎牛血清的DMEM。然后，在4°C孵育7-10分钟，PBS冲洗4次，每次5分钟，在显微镜下观察连接有磁珠的多肽与细胞的结合情况。图I示出连接有磁珠的多肽与细胞结合情况的显微照片，其中，图I中标注有B16C1的照片示出了偶联有磁珠的多肽Cl与黑色素瘤细胞B16的结合情况，标注有B16V1的照片示出了偶联有磁珠的多肽Vl与黑色素瘤细胞B16的结合情况，标注有HLFCl的照片示出了偶联有磁珠的多肽Cl与人肺成纤维细胞的结合情况，标注有HLFVl的照片示出了偶联有磁珠的多肽Vl与人肺成纤维细胞的结合情况。从图I中可以看出，仅标注有B16V1的照片中分布有磁珠，这说明偶联有磁珠的多肽Vl与黑色素瘤细胞B16结合，多肽Vl具有很好地靶向于肿瘤细胞的作用，另外，这也验证了根据本发明的多肽Vl靶向于VEGFR-2。与磁珠偶联后的多肽Vl在与细胞表面表达的VEGFR-2结合后，在磁力作用下就可以将这部分细胞捕捉下来。根据此原理，将B16和HLF消化后用ImL PBS缓冲液重悬，制成包含大约2xl06个细胞的悬液，将偶联有磁珠的多肽Vl和多肽Cl分别加入此细胞悬液中，4°C在静音混合器上孵育10分钟，用从Invitrogen公司购买的磁力架进行分离，测量分离得到的沉淀和上清液中的细胞量。图2示出了经磁力架分离得到的沉淀和上清液中的细胞量,纵坐标表示沉淀和上清中细胞数量与总细胞数的百分比,横坐标中的HLFCl表示偶联有磁珠的多肽Cl与人肺成纤维细胞共同孵育得到的细胞，HLFVl表示偶联有磁珠的多肽Vl与人肺成纤维细胞共同孵育得到的细胞，B16V1表示偶联有磁珠的多肽Vl与黑色素瘤细胞B16共同孵育得到的细胞，B16C1表示偶联有磁珠的多肽Cl与黑色素瘤细胞B16共同孵育得到的细胞，HLF和B16分别表示未与多肽进行共同孵育的细胞。如图2中所示，与偶联有磁珠的多肽Vl共同孵育的黑色素瘤细胞B16几乎全部存在于沉淀中，这是由于偶联有磁珠的多肽Vl与黑色素瘤细胞B16特异性地结合，通过磁力架吸附磁珠将黑色素瘤细胞B16带入沉淀中。这进一步地说明了多肽Vl具有很好地靶向于肿瘤细胞的作用，另外，也进一步验证了根据本发明的多肽Vl靶向于VEGFR-2蛋白。6、靶向VEGFR-2蛋白的多肽用于肿瘤的定位显影按以下步骤将多肽Vl和Cl分别与超顺磁纳米粒子(直径为Ilnm的Fe2O3颗粒)的偶联a)取100 L超顺磁纳米粒子于I. 5mL的EP管，超声30分钟，磁力架分离收集超顺磁纳米粒子，吸出上清液；b)用ImL pH为6. 0浓度为15mM的MES缓冲液清洗超顺磁纳米颗粒两次，磁力架分离收集超顺磁纳米粒子，吸出上清液；
c)用100 ii L pH为6. 0浓度为15mM的MES缓冲液重悬超顺磁纳米粒子，并加入100 u L提前用预冷的水配置的lOmg/mL的EDC，室温下旋转震荡30分钟，磁力架分离收集超顺磁纳米粒子，吸出上清；d)用40 ii L浓度为2mg/mL的多肽Vl和Cl分别加入500 u L PH为6. 0浓度为15mM的MES缓冲液中，分散均匀后加入步骤c中得到的超顺磁纳米粒子中，室温下旋转震荡过夜；e)第二天磁力架分离收集分别偶联有多肽Vl和Cl的超顺磁纳米粒子，吸出上清。f)用ImL含0. 1% (体积百分比)的吐温20的PBS缓冲液在室温下清洗超顺磁纳米颗粒两次，每次旋转震荡10分钟，用磁力架分离，吸出上清，将沉淀用900 y L含1%(体积百分比)BSA的PBS缓冲液重悬，并在4°C保存。在6孔板中种植B16和HLF细胞，每孔种植大约5xl05个细胞，培养基为加入10% 胎牛血清的DMEM，第二天在不同孔中分别加入Fe粒子浓度为128 y g/mL的上述连接有不同多肽的超顺磁纳米粒子。在37°C下与细胞共同孵育2h后，PBS缓冲液冲洗4遍以去除那些未结合到细胞的超顺磁纳米粒子。800rpm离心3分钟收集细胞，重悬在0. 6mL PBS缓冲液和0. 6mL 2%多聚甲醛固定液中，4°C放置lh,PBS缓冲液冲洗3遍，800rpm离心3分钟。向沉淀中加入300 u L PBS缓冲液和200 u L融化的浓度为2%的低熔点琼脂糖，混匀后加入核磁管中。通过核磁成像仪对上述经孵育的细胞进行检测。图3a示出了在相同的条件下通过核磁成像仪对上述经孵育的细胞进行检测得到的T2加权图片，图3b示出了不同浓度的未偶联有多肽的超顺磁纳米颗粒的经核磁成像仪成像的图片。其中，图3a中的三个照片从左至右依次分别为与多肽Vl共同孵育后的人肺成纤维细胞的成像图片、与多肽Cl共同孵育后的黑色素瘤细胞B16的成像图片和与多肽Vl共同孵育后的黑色素瘤细胞B16的成像图片。从图3a中可以看出，与多肽Vl共同孵育后的黑色素瘤细胞B16的成像图片的亮度最暗，这说明多肽Vl可以引导超顺磁纳米粒子结合到黑色素瘤细胞B16的细胞表面。因此，根据本发明的多肽Vl可以与磁性粒子结合作为造影剂而用于肿瘤的定位显影。通过以上对本发明的示例性实施例的描述可以看出，根据本发明的序列为RSRNAFFELWGVKRETPG的多肽可以靶向于肿瘤细胞的VEGFR-2蛋白，因此，可以有效地抑制肿瘤血管的生长。此外，由于根据本发明的多肽可以靶向于肿瘤细胞的VEGFR-2蛋白，所以根据本发明的多肽可以应用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中，例如，根据本发明的多肽可以与磁性粒子结合作为造影剂而用于肿瘤的定位显影。序列表<110>中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所<120> 一种多肽及其应用〈160〉I<210>1<211>18<212>PRT〈213〉人工序列〈220〉
〈223〉靶向肿瘤血管内皮生长因子受体2的多肽〈400〉I
Arg Ser Arg Asn Ala Phe Phe Glu Leu Trp Gly Val Lys Arg Glu Thr Pro GlyI51015。
权利要求
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的多肽在制备用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种多肽及其应用。该多肽具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。该多肽可以靶向肿瘤血管内皮生长因子受体2，因此，该多肽可以有效地抑制肿瘤血管的生长，并且可以应用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中。
文档编号G01N33/574GK102775474SQ201210270640
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者原丽华, 朱毅敏, 濮科锋, 王安欣, 陈丽莎 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所