专利名称：通过置换而用于分析物检测的固体载体上的涂覆的金属表面的制作方法
技术领域：
本发明涉及固体载体上的涂覆的金属表面，所述金属表面可用于通过特异性针对分析物的可逆性结合的抗体从涂层上置换来检测水溶液中的分析物。置换的检测采用分析装置，例如压电晶体微量天平(PCM)装置或表面等离子体共振(SPR)生物传感器来实施，由此检测水溶液中分析物的存在。
背景技术：
SPR生物传感器是一种灵敏的实时技术，其可用于提取关于邻近特定金属表面的分子间相互作用的信息。其为测定浓度、结合和离解速率常数和亲合性以及抗原表位绘图和测定相互作用特异性提供了可能性[B.Liedberg and K.Johansen，Affinity biosensing based onsurfsce plasmon detection in″Methods in Biotechnology，Vol.7Affinity BiosensorsTechniques和Protocols″，K.R.Rogers和A.Muchandani(Eds.)，Humana Press Inc.，Totowa，NJ，pp.31-53]。将参与该研究反应的一种组分在SPR实验之前或之后固定在金属表面上。将固定的分子暴露于连续流体中，该流体中可注入相互作用的物质种类。该方法的基础在于光学探测和有意义的信号能够反映表面上介电功能或折射率的变化。表面上的分子间相互作用可导致这些改变。
PCM技术的基础在于微量天平装置中的振荡压电晶体，其中晶体包括例如石英、氮化铝(AIN)或铌酸钠钾(NKN)。当晶体是石英晶体时，该装置被称为QCM(石英晶体微量天平)。当晶体是石英晶体时，该装置被称为QCM(石英晶体微量天平)。PCM和QCM是重量分析性传感器，故此其对质量改变灵敏。QCM包括压电石英晶体平板，该平板的两面上均已放置了金属电极。施加在所述晶体板上的交变电势差能产生切变波。在特定的频率(如此厚度是半波长的奇数倍)下，晶体将发生共振[M.Rodahl，F.Hook，A.Krozer，P.Brzezinski and B.Kasemo，Quartz crystal microbalance setup for frequency andQ-factor measurements in gaseous and liquid environments，Review of Scientific Instruments 66(1995)pp.3924-3930]。能量上最适宜的半波长数是一。共振频率依赖于晶体的厚度，但通常在MHz范围内。平板表面上的质量改变将导致共振频率的移动。频率移动0.01赫兹可被很容易地检测到，这一事实使得QCM成为测定质量变化的灵敏传感器。大量专利及其它出版物公开了压电石英晶体(QCM)作为基于亲和性的化学传感器/检测器在例如多种免疫测定技术，以及细菌和病毒的检测中的用途。在大多数这些申请中，QCM-装置被用于分析在相互作用对(interaction pairs)例如抗体和抗原之间相互作用之后的晶体重量增加。
晶体被用作检测非常小的质量的微量天平。我们的实验中所使用的薄压电传感器晶体电极的每一面均用黄金蒸镀。可通过经电极施加AC-电压使晶体以其共振频率振荡。QCM-技术的潜在原则是当晶体的质量改变时，共振频率发生改变。通过利用该方法，可以监测晶体的生物分子层中的质量变化。已经报道了利用QCM的很多研究，其中晶体已涂覆了涂层，该涂层以特异性方式与分子或颗粒，例如细菌、病毒、抗体或抗原发生相互作用，这导致晶体的重量减少或增加，晶体重量改变得以检测。
由于常规免疫传感器的响应慢，即感压晶体的重量变化�。蚀瞬捎贸９婷庖叽衅骷觳庑》肿泳哂忻飨缘睦�。为了获得小分子的必要检测，必须提高系统的灵敏度。这可以通过使用置换反应得以实现，所述置换反应中大抗体分子通过解离和与分析物抗原的反应而从传感器表面分离，所述分析物抗原对抗体的亲和力高于与传感器表面结合的抗原(willner等.EP 0 843 816)。
发明内容
本发明提供了固体载体上的涂覆的金属表面，所述金属表面可用于分析装置中，通过监测与涂层上的抗原可逆性结合的抗体经解离和与分析物抗原的反应而从涂层上置换来检测水溶液中的分析物抗原。
在本说明书和权利要求中，词语抗体意指包括完整抗体和抗体的抗原-结合部分或合成抗原-结合分子。
因此，本发明的一个方面涉及固体载体上的涂覆的金属表面，其中涂层由牢固附着于金属表面的蛋白质层组成，所述蛋白质层与连接分子偶合，所述连接分子与低分子量抗原结合，其中连接分子与蛋白质层结合且借助官能性端基与抗原结合并在官能性端基间包含1、2或3个碳原子的脂族烃，其中抗原任选地可逆性地与特异性针对抗原的抗体结合。
蛋白质层与金属表面的牢固附着可通过将蛋白质，例如白蛋白、酪蛋白、多种球蛋白、LDH、卵清蛋白与净化的金属表面接触由此将蛋白质粘附于表面，或者蛋白质可被固定在预置官能性的表面(包括例如硫醇、羧酸和/或氨基)上，或者通过与表面上的聚合物结构交联而植在表面上来实现。
连接分子通过连接分子上官能性端基例如硫醇、羧酸、氨基和氢氧化物基团与蛋白质上的官能团，例如硫醇、羧酸、羟基和氨基之间的反应而与蛋白质层偶合。
连接分子通常首先通过连接分子上官能性端基例如硫醇、羧酸、氨基和羟基或离去基团，例如卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、活化的羧酸例如酸酐和酰氯与抗原上的官能团，例如氨基、酮基和羟基之间的反应而与低分子量抗原结合。在反应前，例如在抗原缺少用于反应的官能团的情况下，也许必须在低分子量抗原上引入或生成活性官能团，。
本发明的涂层中连接分子的重要特性是其(除了用于蛋白质层和抗原之间反应的官能性端基外)具有1、2或3个碳原子的短脂族烃链。如果涂层中的连接基团长于3个碳原子，则对抗体的亲和力过高以至于在暴露于水溶液中的分析物抗原时仅能监测到抗体的有限置换，这降低了灵敏度。
根据本发明的固体载体上的涂覆的金属表面通常在使用前与抗原-特异性抗体分开存放。然而，当用于置换分析时，固体载体上的涂覆的金属表面包括与涂层的抗原可逆性结合的特异性抗体。
根据本发明的固体载体上的涂覆的金属表面的金属优选选自金、银、铝、铬和钛。本发明中优选的金属是金。
除了经由与连接分子的结合而被固定外，涂层的抗原与分析物抗原相同或是其衍生物。因此涂层的抗原可被衍生化以便调节水溶液中结合的抗体的解离。
与根据本发明的涂层的连接分子结合的抗原可以是相同的或不同且可与相同的蛋白质层或蛋白质层的不同片结合，即抗原可与相同的特异性抗体结合或者可以是与不同的特异性抗体结合的两种或多种结合的抗原的混合物，从而可以检测水溶液中某些不同分析物抗原的存在。在抗体携带不同标记(例如荧光标记)的情况下，能够检测不同抗体的置换。然而，几种不同抗体的混合物通常被用于对任何靶抗原的样品的筛选(例如任何麻醉药品或爆炸物样品的筛选)是充分的情况中。通过用带有不同抗原的蛋白质点的离散斑点或阵列涂覆金属表面从而将不同抗体彼此分离。在本发明的优选实施方案中，涂层的抗原选自任选衍生化的爆炸物和麻醉药品。在涂层所选择的抗原与特异性抗体结合过强以至于阻碍了水溶液中抗体的解离的情况下，抗原分子可经化学修饰，例如通过修饰官能团例如酯或氨基(通过除去，或置换原始基团)或通过清除抗原分子的部分，或在抗原分子中引入新的官能团或侧链，以降低其对抗体的亲和力。
爆炸物优选选自三硝基甲苯(TNT)、二硝基甲苯(DNT)、六氢-1，3，5-三硝基-1，3，5-三嗪(RDX)、八氢-1，3，5，7-四硝基-1，3，5，7-四嗪(HMX)、季戊四醇四硝酸酯(PETN)和硝化甘油(NG)，而麻醉药品优选选自可卡因、海洛因、苯异丙胺、脱氧麻黄碱、大麻酚、四氢大麻酚(THC)和亚甲二氧基-N-甲基苯异丙胺(Ecstacy)。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的固体载体上涂覆的金属表面的固体载体是压电晶体电极或玻璃板或棱镜。当晶体是石英晶体时，压电石英晶体电极上的涂覆的金属表面适用于QCM装置中，而玻璃板或棱镜上的涂覆的金属表面则适用于SPR装置中。
本发明的另一发明涉及将根据本发明的固体载体上的涂覆的金属表面作为分析装置的部分通过监测抗体自涂层的置换而用于检测水溶液中对特异性抗体的亲和力高于涂层的抗原的分析物抗原的用途。
而本发明的另一方法涉及在水溶液中检测分析物抗原的方法，包括通过在水溶液中将抗原特异性抗体与涂覆的金属表面接触而活化(如果需要)缺少结合的抗体的根据本发明的固体载体上的涂覆的金属表面，使抗体与涂层的抗原结合，除去过剩的抗体，将可能包含对抗体的亲和力高于涂层的抗原的分析物抗原的水溶液与可逆性结合于涂层的抗体接触，使抗体解离并与分析物抗原反应，和通过分析装置来检测涂覆的金属表面上质量的损失。在本发明方法的一个实施方案中，分析装置选自压电晶体微量天平装置和表面等离子体共振生物传感器。压电晶体例如是石英、氮化铝(AIN)或铌酸钠钾(NKN)。
在本发明优选实施方案中分析装置包括流动室，其中放置了根据本发明的固体载体上的涂覆的金属表面。
以下将通过若干附图和实验描述来举例说明本发明，但应当理解这并非意在将本发明限制于具体描述的内容。
附图简述
图1显示了某些麻醉药品，海洛因，苯异丙胺，Ecstacy和脱氧麻黄碱和麻醉药品-连接分子，海洛因-连接分子，苯异丙胺-连接分子，Ecstacy-连接分子和吗啡-连接分子的化学式。
图2显示了某些其它麻醉药品，大麻酚，四氢大麻酚和可卡因，和可卡因-连接分子的化学式。
图3显示了某些爆炸物，2，4，6-三硝基甲苯(TNT)和2，4-二硝基甲苯(2，4-DNT)的化学式。
图4是与粘附于金表面的与蛋白质结合的抗原-连接分子的典型涂层的示意图。抗原经由连接分子与蛋白质的结合被放大显示。
图5显示了注入抗可卡因的抗体(0.02mg/ml)和随后注入可卡因(10pg/μl)的相对频率变化。流速为50μl/分钟，注入体积(环路体积)为100μl。
图6显示了注入抗体和随后注入TNT(10pg/μl和100pg/μl)的相对频率变化。流速为250μl/分钟。
实验一般描述在QCM系统中实施实验，所述系统的电极已被优化以增强对低分子量化合物的灵敏度。免疫测定系统以置换原理为基础。
免疫测定系统包括电极，经由短连接分子和蛋白质层而被固定在电极的金表面的抗原衍生物将该电极官能化。然后将针对抗原的单克隆抗体原引入抗原功能化的电极。
通过采用与KLH(钥孔嘁血蓝蛋白)连接(通过比用于本发明的涂层的1～3个碳原子的连接子更长的连接)的相同抗原免疫小鼠制备针对抗原的单克隆抗体。该抗体合成方法是众所周知的方法[参见例如Hybridoma Technology in the Biosciences & Medicine.T.A.Springer，editor，Plenum Press，1985.]。我们的实验所使用的抗体表现出对抗原亚纳摩尔的亲和力，且具有非常确定的特异性。
当将电极暴露于溶液中的游离抗原(分析物)时，可以观测到由于表面结合的抗体的置换而出现的重量的降低。电极重量的这种降低可通过晶体共振频率的增加进行监测(图5，6)。
在本实验中，针对要检测的抗原(分析物抗原)的抗体首先被物理性地经弱相互作用而结合于表面固定的抗原衍生物，即本发明的涂层的抗原。但这些弱结合的抗体/抗原复合物与溶液中的抗原(分析物抗原)接触时，由于具有对溶液中分析物抗原更强的亲和力，弱结合的抗体部分将离开表面涂层。这将减少QCM-晶体的质量，产生频率的增加。该概念以抗体对溶液中的抗原(分析物)的亲和力高于其对表面固定的抗原(高离散常数，Kd)的亲和力这一事实为依据。优化抗体和表面之间的亲和力以便通过与低浓度的分析物抗原接触能产生重量损失，同时与不包含抗原的缓冲液接触时不发生太多重量损失是极为重要的。因此优化抗体对表面结合的抗原的亲和力是非常重要的。
该方法中的权衡是背景信号水平。当表面结合的抗体具有对固定的抗原过高的亲和力时，由于游离抗原导致的抗体置换非常困难，故此就需要较大量的游离抗原以便从表面上置换抗体。另一方面，若表面结合的抗体表现出对表面结合的抗原过于低的亲和力，其将在即使不存在游离抗原的情况下非�？斓乩肟砻�。所述系统中弱生物相互作用的动力学是很有趣的，结合和释放同时发生，预测和优化技术上用于生物传感器的系统是很难的。
用金属例如金(其被化学修饰以便使蛋白，特别是抗体的吸附最小化)涂覆石英晶体电极。此外，还用具有对兴趣抗体弱抗原功能的抗原衍生物对表面层进行官能化。不发生对其它抗体的吸附(非特异性吸附)是非常重要的。测试了大量多种表面修饰以发现抗原官能化的表面涂层(其为除蛋白质性的)(无非特异性吸附)。
我们通过将与三硝基甲苯(TNT)、二硝基甲苯(DNT)、海洛因、苯异丙胺、脱氧麻黄碱、亚甲二氧基-N-甲基苯异丙胺(Ecstacy)、四氢大麻酚(THC)和可卡因相关的抗原的结果植于多种蛋白(其用于修饰QCM装置中电极表面)上测试了方法。将抗原经由与抗原结合的连接子上的羧酸基团而移至蛋白质的氨基上。
实验详述可卡因与蛋白质例如多种白蛋白γ-球蛋白，和其它已被良好定性的蛋白质结合通常，我们采用水溶性碳二亚胺EDC[(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺]以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将抗原与蛋白质结合以生成羧化的抗原衍生物的活性酯中间体(例如图1和2中的羧化的药物-连接分子)。然后将抗原的活化NHS-酯加入蛋白质的水溶液中，随后用缓冲液透析。
将抗原(20摩尔)与60μmol NHS和50μmol EDC在二甲基甲酰胺(0.5ml)中在室温下反应2小时。将蛋白质(20mg)(例如白蛋白)溶于3ml 0.1M NaHCO3中，pH 8。将活化的可卡因DMF-溶液与蛋白质溶液在室温下混合4小时，然后用缓冲液透析24小时。
QCM-电极的涂覆用多种溶剂和水冲洗压电电极的金表面，然后在室温下将该电极浸入蛋白质结合物的溶液(浓度为0.1-3mg/ml)中1小时，随后在蒸馏水中充分冲洗，然后将其干燥。
检测方法将涂覆的压电电极固定在通过约10μl内体积的室的流中。用软橡皮O型圈将室体积封闭，仅将电极的一侧与流动系统接触。将流速调整至5～500μl/分钟之间(硫酸缓冲液，PBS)。循环(5～100μl)将样品注入室中(流速为5～500μl/分钟)。通过对频率改变的检测持续监测表面修饰的电极的反应(重量增加或重量损失)。
结果当注射抗可卡因的抗体(浓度0.02mg/ml，循环体积0.1ml)时，立即发生抗体的选择性吸附，致使频率出现显著降低(参见图5)。当在注射抗体后将缓冲液持续流经室时，通常可观测到频率的轻微增加，这显示了抗体的轻微损失。然而，当注射可卡因样品(浓度10pg/pl和100pg/pl，循环体积0.1ml)时，可观测到频率增加。
当注射抗TNT的抗体和注射TNT样品时，图6中显示了相同的模式。
实施可卡因衍生物(即与连接分子和蛋白质，白蛋白结合的可卡因)之间的一系列结合。图2中显示了一种可卡因-连接分子。仅仅是含有短于4个碳原子(除官能性端基(图2中的羧酸基)中可能的碳原子外)的脂肪链的衍生物显示出由暴露于分析物(可卡因)导致的抗体显著置换。
还检测了含有结合与分子的长连接子的其它可卡因，结果显示在暴露于溶液中的游离可卡因时未导致抗体的置换。结论，从这些实验中可清楚地得出当使用长连接子时，固定的可卡因抗原和其抗体之间亲和力过高以至于不能用于置换分析。
用相似的方式在海洛因抗原的OH-基团和N-极端对其实施官能化。结果清楚地显示当连接分子含有少于4个的碳原子时，检测的置换出现显著增加。
本发明的最终抗原/抗体涂覆的金属表面的检测结果1.相对于选择性抗体非常小的抗体非选择性吸附。
2.在用于长时间置换反应(例如＞8小时，室温，在流动室内)的水溶液中具有活性3.当无分析物时，抗体的较少脱附(基线漂移)。(例如在流动室中的水溶液中0.5％/分钟)4.当加载抗原时，干燥状态下稳定(室温(RT)＞3个月)。
权利要求
1.一种固体载体上的涂覆的金属表面，其中涂层由牢固附着于金属表面的蛋白质层组成，所述蛋白质层与连接分子偶合，所述连接分子与低分子量抗原结合，其中连接分子与蛋白质层偶合且和借助官能性端基与抗原结合并在官能性端基间包含1、2或3个碳原子的脂族烃，其中抗原任选地可逆性地与特异性针对抗原的抗体结合。
2.根据权利要求1的固体载体上的涂覆的金属表面，其中金属选自金、银、铝、铬和钛。
3.根据权利要求1或2的固体载体上的涂覆的金属表面，其中抗原是相同或不同的且与相同的蛋白质层或蛋白质层的不同片结合，且选自任选地衍生化的爆炸物和麻醉药。
4.根据权利要求3的固体载体上的涂覆的金属表面，其中爆炸物选自三硝基甲苯(TNT)、二硝基甲苯(DNT)、六氢-1，3，5-三硝基-1，3，5-三嗪(RDX)、八氢-1，3，5，7-四硝基-1，3，5，7-四嗪(HMX)、季戊四醇四硝酸酯(PETN)和硝化甘油(NG)。
5.根据权利要求3的固体载体上的涂覆的金属表面，其中麻醉药选自可卡因、海洛因、苯异丙胺、脱氧麻黄碱、大麻酚、四氢大麻酚(THC)和亚甲二氧基-N-甲基苯异丙胺(Ecstacy)。
6.根据权利要求1～5任一项的固体载体上的涂覆的金属表面，其中固体载体是压电晶体电极或玻璃平板或棱柱。
7.根据权利要求1-6任一项的固体载体上的涂覆的金属表面作为分析装置的部分通过监测抗体自涂层的置换而用于在水溶液中检测对抗体的亲和力高于涂层的抗原的分析物抗原的用途。
8.一种检测水溶液中分析物抗原的方法，包括通过在水溶液中将抗原特异性抗体与涂覆的金属表面接触而活化，如果需要，缺少结合的抗体的根据权利要求1-6任一项的固体载体上的涂覆的金属表面，使抗体与涂层的抗原结合，除去过剩的抗体，将可能包含对抗体的亲和力高于涂层的抗原的分析物抗原的水溶液与可逆性结合于涂层的抗体接触，使抗体解离并与分析物抗原反应，和通过分析装置来检测涂覆的金属表面上质量的损失。
9.根据权利要求8的方法，其中分析装置选自压电石英晶体微量天平装置和表面等离子体共振生物传感器。
10.根据权利要求8或9的方法，其中分析装置包括流动室，其中放置了根据权利要求1-6任一项的固体载体上的涂覆的金属表面。
全文摘要
本发明涉及一种固体载体上的涂覆的金属表面，其中涂层由与金属表面牢固粘附的蛋白质层组成，所述蛋白质层与连接分子结合，该连接分子与低分子量抗原结合，其中连接分子与蛋白质层结合并经由官能性端基与抗原结合，包括官能性端基之间的1、2或3个碳原子的脂族烃，其中抗原与特异性针对抗原的抗体任选地可逆性结合。固体载体上的涂覆的金属表面可作为分析装置，例如压电晶体微量天平装置或表面等离子体共振生物传感器的部分而被用在检测分析物抗原的方法中，通过监测抗体自涂层的置换在水溶液检测对抗体的亲和力高于涂层的抗原的分析物抗原。
文档编号G01N33/547GK1675548SQ03819827
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月18日 优先权日2002年6月19日
发明者P·曼松, A·-S·约翰松, B·桑登, S·洛尼亚坎 申请人:瑞典生物传感器应用股份公司
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