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专利名称：Hbv感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型及其构建方法
HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型及其构建方
法
技术领域：
本发明涉及一种HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型及其构
建方法。
背景技术：
代谢组学作为一门新兴的系统生物学技术，通过对体液及组织中的小分子代谢产物(一般是指相对分子量小于1000的低分子化合物)的整体组成进行动态的跟踪监测，结合模式识别多元变量统计分析方法，来检测和分析机体在受到环境及病理刺激时内源代谢产物的改变。代谢组学常用的技术包括核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR) 和质谱技术(mass spectrometry，MS)。而1H NMR由于其损伤性小，重复性高及无偏向性等优点，使得代谢组学技术已经广泛应用于临床研究，尤其在临床疾病代谢标志物的寻找， 疾病的分型和严重程度的区分，代谢机制的探讨以及预后及疗效的评估等领域。近年来，以 NMR技术结合模式识别分析方法(pattern recognition, PR)成功地被应用于多种疾病的研究，包括心血管系统、神经系统、多器官肿瘤、自身免疫性疾病等。乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)感染性或酒精性肝硬化是当今世界两大慢性肝脏疾病。二者具有相同的临床症状，如肝腹水、高血胆红素水平等。但二者的发病机理不同，酒精性肝硬化是由肝细胞中的乙醇引起的基因毒性或氧化产物富集导致，而HBV 感染性肝硬化是由于肝细胞对HBV的免疫反应导致。进一步研究表明，HBV感染性肝硬化相比较酒精性肝硬化的致癌率要高。但是，传统的对HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的致病机理研究较少，从而难以对二者针对性的诊断治疗提供支持。

发明内容基于此，有必要提供一种HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型及其构建方法，从代谢产物组的水平对HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化进行区分研究。一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，包括如下步骤步骤一采集HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者及健康人的外周血，并进行离心处理，分别得到外周血血清，冷冻保存；步骤二 对采集得到的外周血血清中代谢产物进行核磁共振分析；步骤三对核磁共振分析得到的一维氢谱数据进行傅里叶变换、相位调整、基线校正及定标处理，再将得到的数据进行主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理，将得到的三组处理结果进行比对分析，得到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型。在优选的实施方式中，所述步骤二具体是将采集的外周血血清进行室温冻融，加入重水用于锁场，再在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱。在优选的实施方式中，所述在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱是在25°C下用Varian Unity INOVA 600 核磁共振光谱仪并使用 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 序列记录一维氢谱，弛豫延迟120ms，谱宽为8，OOOHz ；核磁共振谱图以乳酸在1. 33ppm处的双峰定标， 积分区间为9. 0-0. 5ppm,积分间距为0. 005ppm,去掉5. 2-4. 7ppm 一段包含残余的水峰。在优选的实施方式中，所述傅里叶变换是使用TopSpin软件对谱图的自由感应衰减信号进行傅立叶变换，并且在进行傅立叶变换时所有谱图均乘以增宽因子为0. 3Hz的指数窗函数以提高信噪比。在优选的实施方式中，所述主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理过程中的设定的阈值为0. 05。一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型，使用上述任一项所述方法得到的相对于健康人血清，HBV感染性肝硬化患者与酒精性肝硬化患者的区别代谢产物构建得到。在优选的实施方式中，所述区别代谢产物包括肌酸、异丁酸盐、乙酰醋酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺。在优选的实施方式中，所述区别代谢产物中，相比较酒精性肝硬化，HBV感染性肝硬化血清中肌酸、异丁酸盐表达上调，乙酰醋酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺的表达下调。通过代谢组学分析方法对HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者和健康人的代谢产物进行分析，从而找到与HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化发病机理相关的潜在标志性代谢产物，构建HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型，找到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的发病及代谢差异，从而进一步为HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的针对性诊断治疗提供支持。

图1为健康对照组、HBV感染性肝硬化组及酒精性肝硬化组的1H NMR图谱，其中， A 健康对照组，B =HBV感染性肝硬化组，C 酒精性肝硬化组；图2为基于各血清样品的1H NMR图谱得到的PCA得分图，其中，N 健康对照组，A 酒精性肝硬化组，HBViHBV感染性肝硬化组；图3A为HBV感染性肝硬化组与健康对照组的PLS-DA得分图，其中，N 健康对照组，HBViHBV感染性肝硬化组；图;3B为图3A排列实验的交叉验证结果图；图3C为酒精性肝硬化组与健康对照组的PLS-DA得分图，其中，N 健康对照组，A 酒精性肝硬化组；图3D为图3C排列实验的交叉验证结果图；图3E为酒精性肝硬化组与HBV肝硬化组的PLS-DA得分图，其中，HBV:HBV感染性肝硬化组，A 酒精性肝硬化组；图3F为图3E排列实验的交叉验证结果图；图4A为HBV肝硬化组与健康对照组的OPLS-DA得分图，其中，N 健康对照组， HBViHBV感染性肝硬化组；图4B为图4A中的用于区分两组份的相关系数载荷图；图4C为酒精性肝硬化组与健康对照组的OPLS-DA得分图，其中，N 健康对照组，A 酒精性肝硬化组；图4D为图4C中的用于区分两组份的相关系数载荷图。
具体实施方式下面主要结合附图及具体实施例对HBV感染性与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型及其构建方法作进一步详细的说明。本发明通过代谢组学分析方法对HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者和健康人的代谢产物进行分析，从而找到与HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化发病机理相关的潜在代谢产物，构建HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型，找到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的发病及代谢差异，从而进一步为HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的针对性诊断治疗提供支持。一实施方式的HBV感染性与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型构建方法包括如下步骤步骤Sl 采集HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者及健康人的外周血，并进行离心处理，得到外周血血清，冷冻保存。外周血血清中含有大量的反应当前被采集者身体状态的代谢产物，有小分子代谢产物，如氨基酸、脂类、小分子酶等，也有多分子代谢产物，如蛋白质、多肽、大分子脂肪酸等。通过对血清中代谢产物的分析，并与健康人进行比较，可以获得患者与健康人的差异表达的代谢产物；或者通过对同一种疾病的不同病理起源的患者血清代谢产物进行分析，得到其差异表达的图谱模型，为疾病的针对性诊断和治疗提供进一步的支持。步骤S2 对采集得到的外周血血清进行核磁共振分析。首先将采集的外周血血清进行室温冻融，加入重水(D2O)用于锁场，在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱。步骤S3 对得到的一维氢谱数据进行傅里叶变换、相位调整、基线校正及定标处理，再将得到的数据进行主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理，得到 HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型。以下为HBV感染性与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型及其构建方法的具体实施例部分。一、HBV感染性肝硬化组、酒精性肝硬化组和健康对照组的选择HBV感染性肝硬化组21例酒精性肝硬化组20例健康对照组20例其中，病例来源于2009年9月-2010年8月深圳市人民医院消化科与传染科；肝硬化的评判标准基于组织学诊断或者由临床、实验及影像学综合检测结果评定；HBV感染性肝硬化评定标准是血清中存在HBV表面抗原和HBV的DNA ；酒精性肝硬化组评定标准是至少5年内每天摄入酒精大于50g或者至少两年内每天摄入酒精大于80g而导致肝硬化的患者；实验时排除了由于其他并发症存在的肝硬化病例，如抗HBc/HBd阳性的慢性肝脏疾病患者、自身免疫缺陷型肝炎患者、Wilson疾病患者、HBV感染合并酒精性肝硬化的患者、肝癌患者等；下表1为HBV感染性肝硬化组、酒精性肝硬化组与健康对照组的临床和生化参数检测表 权利要求
1.一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一采集HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者及健康人的外周血，并进行离心处理，分别得到外周血血清，冷冻保存；步骤二 对采集得到的外周血血清中代谢产物进行核磁共振分析；步骤三对核磁共振分析得到的一维氢谱数据进行傅里叶变换、相位调整、基线校正及定标处理，再将得到的数据进行主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理，将得到的三组处理结果进行比对分析，得到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型。
2.如权利要求1所述的HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二具体是将采集的外周血血清进行室温冻融，加入重水用于锁场，再在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱。
3.如权利要求2所述的HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，其特征在于，所述在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱是在25°C下用Varian Unity INOVA 600核磁共振光谱仪并使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列记录一维氢谱，弛豫延迟120ms，谱宽为8，OOOHz ；核磁共振谱图以乳酸在1. 33ppm处的双峰定标，积分区间为 9. 0-0. 5ppm,积分间距为0. 005ppm,去掉5. 2-4. 7ppm 一段包含残余的水峰。
4.如权利要求1所述的HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，其特征在于，所述傅里叶变换是使用TopSpin软件对谱图的自由感应衰减信号进行傅立叶变换，并且在进行傅立叶变换时所有谱图均乘以增宽因子为0. 3Hz的指数窗函数以提高信噪比。
5.如权利要求1所述的HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，其特征在于，所述主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理过程中的设定的阈值为0. 05。
6.一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型，其特征在于，使用权利要求1-5 中任一项所述方法得到的相对于健康人血清，HBV感染性肝硬化患者与酒精性肝硬化患者的区别代谢产物构建得到。
7.如权利要求6所述的HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型，其特征在于，所述区别代谢产物包括肌酸、异丁酸盐、乙酰醋酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺。
8.如权利要求7所述的HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型，其特征在于，所述区别代谢产物中，相比较酒精性肝硬化，HBV感染性肝硬化血清中肌酸、异丁酸盐表达上调，乙酰醋酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺的表达下调。
全文摘要
本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，通过采集HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者及健康人的外周血进行核磁共振分析，再对核磁共振得到的谱图进行多重变量的统计学分析，得到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型。通过代谢组学分析方法对HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者和健康人的代谢产物进行分析，从而找到与HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化发病机理相关的标志性代谢产物，构建HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型，从而进一步为HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的针对性诊断治疗提供支持。此外，本发明还涉及一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型。
文档编号G01N24/08GK102305802SQ20111024919
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者戴勇, 齐素文 申请人:重庆医科大学