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专利名称：一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，特别涉及一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia, CML)是一种多能干细胞增殖异常引起的恶性肿瘤，对该疾病的真正认识源于费城染色体(Philadelphia Chromosome,Ph)的发现，数据显示90%以上的CML病例中都有Ph的存在，该染色体是由9号染色体和22号染色体相互易位形成，即t (9,22) (q34:qll)，易位使9号染色体长臂末端(9q34)的c-abl原癌基因在第2位外显子的5’端发生断裂，然后与22号染色体长臂末端(22qll)的c-BCR融合基因的3’端发生融合形成bcr/abl融合基因，其中部分CML患者BCR融合基因 中的断裂点融合成转录成el9a2，称之为UBCR融合基因，主要见于Ph +的慢性中性粒细胞白血病。该融合基因编码一个嵌合体蛋白质P230，它具有较高的酪氨酸蛋白激酶活性，使一系列底物蛋白磷酸化，由此激活多条信号传导途径，使细胞在不依赖细胞因子的情况下发生过度增殖和分化，并且使正常的细胞凋亡受到抑制。放疗与二甲磺酸丁酯等药物用于CML的早期治疗，尽管它们可以改善症状，提高患者生命质量，但不能延长患者生命。后来的轻基脲(Hydroxycarbamide,HU)与造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)以及在少数患者中使用的重组体干扰素(recombinant interferon alpha, rIFNα )为延长患者生命起到了很大的作用。一种蛋白激酶抑制剂伊马替尼(Tyrosine Kinase inhibitor, TKI)被证明具有高且相对特异性的生物活性，因此迅速应用于临床，它是通过抑制过度激活的酪氨酸及酶活性来控制白血病细胞生长，诱导其凋亡的一种药物。它对大多数bcr/abl融合基因阳性的CML患者有效。研究表明，CML患者经伊马替尼治疗达到细胞学完全缓解后，随着治疗时间的延长，bcr/abl融合基因定量的结果呈逐渐下降的趋势，最终甚至完全检测不到。然而，bcr/abl融合基因激酶结构突变、bcr/abl融合基因扩增和过度表达会引起患者对伊马替尼耐药。而且相关研究也提到，CML患者处于不同病理期时，骨髓增殖情况也不同，白血病细胞的增殖也存在差异，处于CML慢性期和加速期的患者bcr/abl融合基因表达量显著低于急变期。因此，通过检测U BCR融合基因水平，可以指导临床针对患者个体水平合理选择药物剂量或是否联合其他药物治疗，同时，也可以为诊断CML的白血病细胞增殖情况和病理分期提供依据。较之使用常规定性PCR方法对U BCR融合基因进行半定量检测或免疫学方法对bcr/abl蛋白进行定量检测,突光定量PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)技术也具有较高的灵敏度和特异度。实时荧光定量PCR技术实现了 PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速并降低了污染等特点，但目前尚未有荧光定量PCR方法检测慢性粒细胞白血病中U BCR基因的相关报道。

发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下本发明实施例提供的一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括U BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中U BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；U BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；U BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。进一步地所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID N0:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQID NO: 9所示；内部阳性控制序列的Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。进一步地，所述U BCR融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。进一步地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。进一步地，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/L MgCl2 4 μ L, IOX逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV 逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ L。进一步地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有U BCR融合基因的总RNA样品。进一步地，所述荧光定量PCR的混合液(以反应体系终浓度表示)为·ΛΧ的PCR预混合液(原液为 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶以及无 RNase 去离子水。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是本发明实施例提供的一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，应用荧光定量PCR技术检测U BCR融合基因的mRNA水平，可以指导临床针对患者个体水平合理选择药物剂量或是否联合其他药物治疗，同时，也可以为诊断CML的白血病细胞增殖情况和病理分期提供依据。较之使用免疫学方法对bcr/abl蛋白进行定量，其还具有以下的优点(I)敏感性高可重复敏感度为O. 01%,即10000个细胞中有一个含U BCR融合基因就可以被检测出。(2)特异性强使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好且假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高而且防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染，同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。(4)全程监控本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小时完成。本发明的试剂盒能快速、准确、定量检测U BCR融合基因mRNA水平，有效杜绝了假 阳性和假阴性的发生，用于慢性粒细胞白血病的诊断及治疗过程中微小残留病的监测，为慢性粒细胞白血病的诊断、制定治疗方案及疗效评价和预后提供了重要的检测手段。


为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图IA是本发明实施例2提供的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；图IB是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品的荧光曲线图；图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例I.本发明试剂盒的制备I、特异性的引物和荧光探针的设计根据基因序列(ABL基因序列、BCR基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM_005157.4 ;BCR基因ID分别为613，参考序列号为NG_009244. I)分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分本发明试剂盒组成如下①RNA 提取试剂=Trizol 试剂(Invitrogen 公司，产品货号15596_026/100ml)，每Iml骨髓组织加入ImlTrizol快速提取慢性粒细胞白血病患者骨髓组织RNA。
②cDNA 第一链合成试剂盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，产品货号K1622):25mmol/L MgCl2 4μ L, IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，RNA 酶抑制剂(RNasin，一种酸性糖蛋白)0. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积 11 μ L0③引物、探针和标准品包括融合基因U BCR引物、内参基因ABL引物、内部阳性控制序列引物及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下U BCR融合基因上游引物序列为5’ -GTGGCCACGGACATCCA-3’(序列表中序列I);U BCR融合基因下游引物序列为5’-GATGCTACTGGCCGCTGAAG-3’(序列表中序列2)；
U BCR 融合基因 Taqman 荧光探针FAM 5’-AGGCAGCCTTCGAC-3’-TAMRA (序列表中序列3)；内部阳性控制序列为5’ -GUGGCCACGCACAUCGAGGCACUGAAGGCACCGUUCGACGUCAAAGCCCAUGAGCGGCCAGUAGCAUC-3’(序列表中序列 7)；内部阳性控制序列上游引物序列为5’ -GTGGCCACGCACATCGA-3’(序列表中序列8)；内部阳性控制序列下游引物序列为5’ -GATGCTACTGGCCGCTCTAG-3’(序列表中序列9)；内部阳性控制序列Taqman荧光探针TET5’ -AGGCACCGTTCGAC-3’ TAMRA (序列表中序列10)；ABL 基因序列为5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL基因上游引物序列为5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4);ABL基因下游引物序列为5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 荧光探针FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6)。其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的U BCR融合基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman荧光探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有UBCR融合基因的总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例I中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂=Trizol试剂(Invitrogen公司，产品货号15596-026/100ml),按每Iml骨髓组织加入Iml Trizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有U BCR融合基因的慢性粒细胞白血病的骨髓组织RNA，作为阳性对照。⑤U BCR融合基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测U BCR融合基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0· 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的U BCR融合基因上游引物(序列表中序列I)、O. 25ρπιο1/μ L的U BCR融合基因下游引物(序列表中序列2)、0· 3pmol/yL的U BCR融合基因Taqman荧光探针(序列表中序列3)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0· 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0· 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA),其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。⑥ABL内参基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL内参基因上游引物(序列表中序列4)、
O.25pmol/ μ L的ABL内参基因下游引物(序列表中序列5)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman 荧光探针(序列表中序列6)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，加入ABL基因标准品模板2 μ L,其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成ix的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0· 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0· 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，通常取1-2 μ L的模板(内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA)，其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。3、PCR扩增程序的设定在Iightcycler仪器上先经过50°C 10s, 95°C IOmin,然后再经过95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。实施例2.用实施例I制备的试剂盒检测U BCR融合基因mRNA的表达量
以检测30例慢性粒细胞白血病患者骨髓组织标本结果为例。用实施例I提供的本发明的试剂盒检测U BCR融合基因mRNA表达量的检测流程为首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床慢性粒细胞白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图IA和图IB所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示)，然后再配制U BCR融合基因荧光定量PCR反应液进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33 35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算U BCR融合基因及ABL基因的Ct值，两者之差即为ACt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①慢性粒细胞白血病患者骨髓组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提慢性粒细胞白血病患者骨髓组织样品的总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用O. 1% DEPC处理的水调节抽提的各样品RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L，IOX逆转录酶缓冲液 2yL，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0.5yg 和AMV逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水 混匀置冰箱_20°C保存。取IyL浓度为2μ/πι1内部阳性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24 μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2 μ L，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制齐[J
0.5 μ L，01igo(dT)15 O. 5 μ g和AMV逆转录酶I. 5U，补加无RNase去离子水至总体积20 μ L，于42°C保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA。反应结束后,加热至99°C, 5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱-20°C保存。取I μ L浓度为2 μ g/ml的阳性对照RNA，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L, IOX逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱-20°C保存。③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为
1.OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用实施例I提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图IA和图IB所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示)。④U BCR融合基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含I XPCR预混合液(Qiagen 公司，产品货号210212, 2XPCRPremix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，U BCR 融合基因上游引物终浓度0. 2μπι01/1，υ BCR融合基因下游引物终浓度O. 2μπι01/1，υ BCR融合基因Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L,被测样品RNA反转录合成的cDNA I. O μ L，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物终浓度均为0. 2ymol/L，内部阳性控制序列Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L,终浓度为0. 2 μ mol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA(②中反转录合成的cDNA),加入超纯水至总体积20 μ L。在Iightcycler突光定量PCR仪上反应扩增条件；95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因弓丨物终浓度O. 2 μ mol/L,探针终浓度O. 2 μ mol/L, ABL基因cDNA l.OyL,加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，U BCR融合基因上、下游引物终浓度均为O. 2 μ mol/L，U BCR融合基因Taqman荧光探针终浓度O. 3 μ mol/L,阳性对照RNA反转录合成的cDNA LOyL或者阴性对照去离子水I. O μ L，加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s，60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集突光信号。⑦数据收集处理和分析PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出融合基因UBCR相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于O. 0001为阳性表达，小于O. 0001为阴性表达(具体参见表I)表I为荧光定量PCR分析UBCR融合基因在慢性粒细胞白血病中的表达·
样品U BCR模板 ABL模板 U BCR/ABL
_[曼性粒细胞白血病一3795436 ' 319458540 O. 01188 _丨曼性粒细胞白血病一414746 ' 260645734 O. 00159 _丨曼性粒细胞白血病 ~19533 . 334561573 O. 00006 一丨曼性粒细胞白血病 ~149078 ' 298565890 O. 00050 _丨曼性粒细胞白血病一243584 ' 316876506 O. 00077 一丨曼性粒细胞白血病一298190 ' 306671049 O. 00097 一丨曼性粒细胞白血病一2975500 _ 317650194 O. 00937 _[曼性粒细胞白血病一4354097 ' 281537187 O. 01547 一丨曼性粒细胞白血病一4994514 ' 268977310 O. 01857 _[曼性粒细胞白血病一38733652 ' 246698765 O. 15701 一丨曼性粒细胞白血病一85634681 . 316406153 O. 27065 _[曼性粒细胞白血病一4069043 ' 256487947 O. 01586 _丨曼性粒细胞白血病 ~18626 ' 219839543 O. 00008 _丨曼性粒细胞白血病 ~108644436 . 324579017 O. 33472 _丨曼性粒细胞白血病一43056782 . 237556842 O. 18125 _丨曼性粒细胞白血病一2569821 ' 286631489 O. 00897 _[曼性粒细胞白血病 ~1639078 ' 298565890 O. 00549 _丨曼性粒细胞白血病一95794 ' 279537187 O. 00034 _[曼性粒细胞白血病一20416 . 288976590 O. 00007 _丨曼性粒细胞白血病 ~18653 ' 328506467 O. 00006 _丨曼性粒细胞白血病一3921709 ' 248546156 O. 01578 _丨曼性粒细胞白血病一412645 ' 248654321 O. 00166 _丨曼性粒细胞白血病 20465319652351 0.0000权利要求
1.一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括UBCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中 U BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示； U BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示； U BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID N0:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ IDNO: 10所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述UBCR融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/LMgCl2 4μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ L。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有U BCR融合基因的总RNA样品。
7.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为1X的PCR 预混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和无RNase去离子水。
全文摘要
本发明公开了一种检测U BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括U BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。U BCR融合基因主要见于Ph+的慢性中性粒细胞白血病，该基因编码具有较高的酪氨酸蛋白激酶活性，使细胞在不依赖细胞因子的情况下发生过度增殖、分化，并且使正常的细胞凋亡受到抑制。采用荧光定量PCR检测U BCR融合基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。所述试剂盒为慢性中性粒细胞白血病的诊断及预测预后以及化疗方案的确定提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
文档编号G01N21/64GK102925557SQ201210374358
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者童永清, 李艳 申请人:童永清, 李艳