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专利名称：一种萃取和常压柱层析法纯化微囊藻毒素mclr的方法
技术领域：
本发明涉及分析化学领域，具体地，本发明涉及一种萃取和常压柱层析法纯化微 囊藻毒素MCLR的方法。
背景技术：
我国地表水体由于日趋严重的富营养化而加剧了水华的频繁发生。水华发生时， 藻类大量繁殖和腐烂，导致水味腥臭，水体透明度降低，并影响水体中的溶解氧，造成水生 生态严重恶化。某些藻类(如蓝藻)死亡后，由于细胞溶解而释放的藻毒素，对人类健康造 成很大的影响。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一类在蓝藻水华污染中出现频率高、产 生量大和造成危害严重的藻毒素，它能够特异性的与蛋白磷酸酶PP1和2A的丝氨酸/苏氨 酸亚基结合，从而抑制它们的活性，促进肿瘤的发生。鉴于MCs对人体健康的潜在危害，目 前国内外针对MCs毒性以及控制对策开展了广泛的研究。然而高纯度MCs样品的稀有成为 制约MCs研究发展的瓶颈，因此需要开发出简单有效地提纯MCs的方法，以满足对于MCs纯 品的需求。微囊藻毒素LR(Microcystin LR， MCLR)是MCs中毒性最大的一种毒素，极具代 表性。 目前，将MCs粗品经过固相萃取等简单净化，再应用不同类型的C18分离柱在高效 液相色谱(HPLC)上根据MCs紫外吸收出峰时间收取对应的流动相是提纯MCs有效的方法， 包括制备型和半制备型液相色谱等。这些方法虽然可以获得较高纯度的MCs，但仪器和分离 柱价格昂贵，在一般的实验室条件下难于实现，而且每次提纯的MCs量也很少，不能满足批 量制备MCs纯品的要求。

发明内容
本发明的目的在于提供一种萃取和常压柱层析法提纯MCLR的方法。
根据本发明的方法包括以下步骤 1)破碎藻细胞将藻细胞悬液高速离心10 20min，弃去上清液，用超纯水清洗沉 淀，再离心，重复2 4次，得到藻细胞残渣，采用超声或反复冻融等方法进行细胞破碎；
2)向破碎的藻细胞中加入甲醇，使甲醇的终浓度为40 100%、优选80%，进行藻 毒素的振荡提取，收集提取后的上清液，可以1 3次，合并各次的上清液，在3(TC下蒸发去 除甲醇； 3)对步骤2)得到的水溶液进行液液萃取，以去除部分亲有机相的杂质，抽取水 相，得到MCLR水溶液，重复该步骤4 8次； 4)对步骤3)得到的MCLR水溶液进行C18固相(用100%甲醇活化)萃取，用0 20%的甲醇洗脱杂质，最后用50 80%甲醇洗脱MCLR，以去除部分极性与MCLR相差较大 的物质，将得到的MCLR洗脱液蒸发至干，并用100%甲醇溶解，得到MCLR甲醇溶液；
5)将步骤4)得到的MCLR甲醇溶液上样至S印hadex LH-20凝胶层析柱，进行层析 分离，以100%甲醇为流动相，流速为0. 5mL/min，收集MCLR活性峰，浓縮蒸干后溶于超纯水
3中，得到MCLR水溶液；以及 6)将步骤5)得到的MCLR水溶液上样至DEAE离子交换层析柱(DEAES印harose CL-6B离子交换层析柱)，用超纯水进行平衡，再用3mmol/L NaCl溶液洗脱，流速为1. 5mL/ min，收集MCLR活性峰，制得MCLR纯品。 根据本发明的方法，在步骤3)中，使用正己烷、二氯甲烷或三氯甲烷、优选正己烷 进行液液萃取，萃取比例为水相有机相=2 : 1。 根据本发明的方法，在步骤4)中依次使用0%、5%、20%的甲醇洗脱杂质。
本发明提供的萃取和常压柱层析法提纯MCLR的方法，其中使用的液液萃取法可 以有效地实现除色和脱脂。所使用的S印hadex LH-20凝胶是集吸附和分子筛双重作用于 一体的填料，并且可用有机溶剂作流动相，能够去除色度和干扰物。DEAES印harose CL-6B 是一种弱阴性离子交换材料，容量大，能分离mg级的MCLR，该材料对离子强度极敏感，只需 用低浓度盐溶液即可将MCLR洗脱。大量研究发现，采用萃取和常压柱层析法提纯MCLR，具 有良好的重现性。MCLR的回收率可达60 85%。 与其他MCs提纯方法相比，本发明提供的方法优点在于，该法具有简便有效、经 济实用、在一般实验条件下即可实现并且相对稳定的特点，能够制备毫克级MCLR纯品，经 HPLC分析，其纯度达85X以上。


图1为粗提液液相色谱图。 图2为液液萃取前后MCLR水样扫描图。 图3为C18固相萃取净化后液相色谱图。 图4为S印hadex LH-20凝胶层析洗脱曲线。 图5为LH-20凝胶层析后液相色谱图。 图6为DEAE离子交换层析洗脱曲线。 图7DEAE离子交换层析后液相色谱图。
具体实施方式

实施例1 1、取铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)悬液2500mL，在4800r/min转速下离 心10min，弃去上清液，用超纯水清洗并离心，弃去上清液，得到藻细胞残渣，用超声细胞粉 碎仪进行细胞破碎； 2、用25mL80%甲醇对步骤1中的藻细胞悬液振荡提取4h，4800r/min转速下离心 10min，收集上清液(粗提液液相色谱图如图1所示)；
3、重复一次步骤2; 4、合并步骤2和步骤3两次提取的上清液，得到MCLR粗提液，在3(TC下旋转蒸发 去甲醇； 5、用三氯甲烷对步骤 的水溶液进行液液萃取，水相三氯甲烷=2 : l，抽取下 层水相(液液萃取前后MCLR水样扫描图如图2所示)；
6、重复步骤5三次；
7、先用10mL甲醇活化C18固相萃取(SPE)小柱(lOOOmg)，再用20mL超纯水清洗 柱体，流速3mL/min，经步骤6处理的MCLR水样以ImL/min流速过SPE小柱，依次用lOOmL 超纯水、100mL 5X甲醇、100mL 15%甲醇洗杂质，最后用25mL 80%甲醇洗脱MCLR，蒸发浓 縮至干，用100%甲醇溶解(C18固相萃取净化后液相色谱图如图3所示)；
8、将骤7得到的浓縮液lmL上样至S印hadex LH-20凝胶层析柱(1. 8cmX50cm)， 甲醇为流动相，流速为0. 5mL/min，收集MCLR活性峰，旋转浓縮蒸干后溶于5mL超纯水 (S印hadex LH-20凝胶层析洗脱曲线如图4所示，LH-20凝胶层析后液相色谱图如图5所 示)；9、取步骤8得到的5mLMCLR水溶液上样至DEAE离子交换层析柱(3cmX 15cm)，用 350mL超纯水平衡，再用3mmol/L NaCl溶液洗脱MCLR，流速为1. 5mL/min，收集MCLR活性 峰，制得MCLR纯品(DEAE离子交换层析洗脱曲线如图6所示，DEAE离子交换层析后液相色 谱图如图7所示)。
实施例2-3 除分别使用二氯甲烷和三氯甲烷进行液液萃取外，其它步骤与实施例所述方法相 同，提取MCLR。
实施例4 1、取铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)悬液2500mL，在4800r/min转速下离 心10min，弃去上清液，用超纯水清洗并离心，弃去上清液，得到藻细胞残渣，用反复冻融法 进行细胞破碎； 2、用25mL40%甲醇对步骤1中冻融后的藻细胞悬液振荡提取4h，4800r/min转速 下离心10min，收集上清液；
3、重复一次步骤2; 4、合并步骤2和步骤3两次提取的上清液，得到MCLR粗提液，在3(TC下旋转蒸发 去甲醇； 5、用正己烷对步骤4的水溶液进行液液萃取，水相正己烷=2 : l，抽取下层水 相； 6、重复步骤5三次； 7、先用10mL甲醇活化C18固相萃取(SPE)小柱(1000mg)，再用20mL超纯水清洗 柱体，流速3mL/min，经步骤6处理的MCLR水样以lmL/min流速过SPE小柱，依次用100mL 超纯水、100mL 5X甲醇、100mL 20%甲醇洗杂质，最后用25mL 50%甲醇洗脱MCLR，蒸发浓 縮至干，用100%甲醇溶解； 8、将骤7得到的浓縮液lmL上样至S印hadex LH-20凝胶层析柱(1. 8cmX50cm)， 甲醇为流动相，流速为0. 5mL/min，收集MCLR活性峰，旋转浓縮蒸干后溶于5mL超纯水；
9、取步骤8得到的5mLMCLR水溶液上样至DEAE离子交换层析柱(3cmX 15cm)，用 350mL超纯水平衡，再用3mmol/L NaCl溶液洗脱MCLR，流速为1. 5mL/min，收集MCLR活性 峰，制得MCLR纯品。
实施例5 1、取铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)悬液2500mL，在4800r/min转速下离 心10min，弃去上清液，用超纯水清洗并离心，弃去上清液，得到藻细胞残渣，用超声细胞粉碎仪进行细胞破碎； 2、用25mL100%甲醇对步骤1中破碎后的藻细胞悬液振荡提取4h，4800r/min转速 下离心10min，收集上清液；
3、重复一次步骤2; 4、合并步骤2和步骤3两次提取的上清液，得到MCLR粗提液，在3(TC下旋转蒸发 去甲醇； 5、用二氯甲烷对步骤4的浓縮液进行液液萃取，水相二氯甲烷=2 : l，抽取下 层水相； 6、重复步骤5三次； 7、先用10mL甲醇活化C18固相萃取(SPE)小柱(1000mg)，再用20mL超纯水清洗 柱体，流速3mL/min，经步骤6处理的MCLR水样以lmL/min流速过SPE小柱，依次用100mL 超纯水、100mL 5X甲醇、100mL 15%甲醇洗杂质，最后用25mL 100%甲醇洗脱MCLR，蒸发 浓縮至干，用100%甲醇溶解； 8、将步骤7得到的浓縮液lmL上样至S印hadex LH-20凝胶层析柱 (1. 8cmX 50cm)，甲醇为流动相，流速为0. 5mL/min，收集MCLR活性峰，旋转浓縮蒸干后溶于 5mL超纯水； 9、取步骤8得到的5mLMCLR水溶液上样至DEAE离子交换层析柱(3cmX 15cm)，用 350mL超纯水平衡，再用3mmol/L NaCl溶液洗脱MCLR，流速为1. 5mL/min，收集MCLR活性 峰，制得MCLR纯品。
权利要求
一种萃取和常压柱层析法纯化微囊藻毒素MCLR的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)破碎藻细胞；2)向破碎的藻细胞中加入甲醇，使甲醇的终浓度为40～100％，进行藻毒素的振荡提取，收集提取后的上清液，蒸发去除甲醇；3)对步骤2)得到的溶液进行液液萃取，抽取水相，得到MCLR水溶液；4)对步骤3)得到的MCLR水溶液进行C18固相萃取，用0～20％的甲醇洗脱杂质，最后用50～100％甲醇洗脱MCLR，将得到的MCLR洗脱液蒸发至干，并用100％甲醇溶解，得到MCLR甲醇溶液；5)将步骤4)得到的MCLR甲醇溶液上样至Sephadex LH-20凝胶层析柱，进行层析分离，收集MCLR活性峰，浓缩蒸干后溶于超纯水中，得到MCLR水溶液；以及6)将步骤5)得到的MCLR水溶液上样至DEAE离子交换层析柱，收集MCLR活性峰，制得MCLR纯品。
2 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，向破碎的藻细胞中加入甲醇，使甲醇的终浓度为80%。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，使用正己烷、二氯甲烷或三氯甲烷进行液液萃取。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，使用正己烷进行液液萃取。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，萃取比例为水相有机相=2 ! 1。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4)中依次使用0%、5%、20%的甲醇洗脱杂质。
全文摘要
本发明涉及分析化学领域，具体地，本发明涉及一种萃取和常压柱层析法纯化微囊藻毒素MCLR的方法。所述方法包括以下步骤1)破碎藻细胞；2)使用甲醇粗提；3)液液萃取；4)C18固相萃取；5)Sephadex LH-20凝胶层析，收集MCLR活性峰；以及6)DEAE离子交换层析，收集MCLR活性峰，制得MCLR纯品。本发明提供的方法优点在于该法具有简便有效、经济实用、在一般实验条件下即可实现并且相对稳定的特点，能够制备毫克级MCLR纯品，经HPLC分析，其纯度达85％以上。
文档编号G01N30/00GK101750460SQ20081022795
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者梁文艳, 王金丽, 陈莉 申请人:北京林业大学