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专利名称：蓝舌病病毒检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测蓝舌病病毒的器具，特别是涉及一种可快速检测蓝舌 病病毒检测试纸条。
二背景技术：
蓝舌病(Bluetongue disease, BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV) 引起家养和(或)野生反刍动物出血疾病的一种烈性动物传染病，是世界动物 卫生组织(O正)规定的上报疫病，对动物和动物制品国际间贸易具有非常重要 的社会经济影响作用，被各国政府有关机构均设为动物疫病监测和防控的重点， 在反刍动物的双边贸易中，各国出入境检验检疫机构规定出口国必须提供无感 染此病的健康证明。
蓝舌病最早于1876年发现于南非的绵羊，由于发病绵羊持续高热后，口 腔出现溃疡损伤，口腔粘膜及舌头发蓝，1906年定名为蓝舌病。幼年绵羊对蓝 舌病最为易感，绵羊感染后表现高热，精神萎顿，口腔粘膜充血、水肿，或表 现口腔粘膜表层坏死溃疡，咽水肿，唇及舌水肿呈紫色，蹄冠淤血、肿胀疼痛 致使跛行。平均发病率为30 40%，死亡率20 30%，有时死亡率高达90%， 发病绵羊还会被毛断裂，甚至全部脱落，严重影响羊毛和肉品质量。
BTV属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)。环状病毒属 14个群中，BTV群与鹿流行性出血热病毒群(Epizootic hemorrhagic disease virus, EHDV)亲缘关系最为密切，有较强的交叉反应性，非洲马瘟病毒(African horse sickness virus, AHSV)的形态学和BTV极为相似，二者也有较近的亲缘关 系。BTV血清型众多，目前国际公认至少存在24个血清型，点突变产生的漂 移和单个BTV基因片段发生重排是导致BTV遗传多样性的原因。蓝舌病多呈地方性流行，其发生、流行与库蠓等昆虫的分布、习性和生活 史关系密切，具有明显的季节性，即以晚夏与早秋多发。上世纪中期以来，蓝
舌病广泛存在于热带、亚热带和温带地区的50多个国家和地区，成为世界性 危害的虫媒性传染病。我国于1979年5月在云南省师宗首次发现蓝舌病，并 分离出BTV，从而确定了蓝舌病的存在，随后湖北、安徽、四川、山西等省区 也发现蓝舌病临床病例，目前，全国已有29个省(市)区已检出羊BTV抗体， 许多省份的牛群中亦发现BTV抗体阳性动物。我国政府十分重视蓝舌病的防治， 已把蓝舌病纳入进出口动物的必检传染病之一。
蓝舌病监测需要利用病毒分离鉴定、血清学检测和病毒核酸检测等实验室 检测手段进行确切诊断。目前实验室检测这三种病毒的方法有(1)病毒分离 与鉴定，病毒分离鉴定是OIE推荐的BTV诊断方法之一，其灵敏度高，但完成整 个检测过程需1 2月，具有检测周期长的局限性。(2)血清学检测主要包括 琼脂免疫扩散试验(AGID)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验(VNT) 等。AGID试验操作简便、敏感性高、成本低，不需要复杂实验设备，是最早得 到广泛推广应用的BTV抗体检测方法之一，也是OIE推荐使用的方法，其缺点是 与相关环状病毒如EHDV有交叉反应。竞争ELISA (C-ELISA)是OIE推荐的BTV 血清学诊断首选方法，是最敏感和特异的BTV抗体检测技术，其缺点在于高亲 和力单克隆抗体检测试剂不易获得。(3)用反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR) 检测细胞培养物或样品中的BTV核酸，RT-PCR和实时荧光定量PCR技术具有快 速、特异、灵敏(以及定量)等特点，在BTV核酸检测中得到广泛研究。
病毒分离与鉴定和PCR检测技术操作复杂、需要仪器和较长的时间，不适合 生产或现场的快速诊断需要。ELISA和AGID比病毒分离与鉴定和PCR技术简便、 快速，常用来检测BTV (ELISA)及其抗体，但仍不便于我国基层或现场普遍推 广应用。因为ELISA仍需要酶标仪和试剂，较复杂的操作步骤和经验，这些仪器、 试剂在基层或者缺乏，或者缺乏操作人员和保存条件。用斑点免疫金渗滤法即 免疫试纸的方法检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓縮和毛细管作用，将抗原_ 抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况而判断结果，因此该法比ELISA 更简便、快速和实用。
申请号为200410012604.4的文件公开了一种蓝舌病毒的检测方法及试剂 盒，先是细胞的培养及病毒的增殖；其次是制备待测样品和阴阳性对照物PCR 模板；第三是以逆转录合成待检样品dsRNA的cDNA;第四是进行聚合酶链反 应，扩增合成靶标序列。该方法检测准确，操作过程复杂，周期较长，非专业 人员很难操作，不适合生产或现场的快速诊断需要。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结果显示直观、准确，能快速检测 蓝舌病病毒的试纸条，该试纸条具有特异性强、敏感性高、使用简便、且检测 成本低廉的优点。
本发明的技术方案是
一种检测蓝舌病病毒的试纸条，包括支撑层、附着在支撑层上的吸附层， 所述吸附层是由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次 拼接而成，所述纤维素膜层上标记有用蓝舌病病毒抗体溶液印制的隐形检测印 迹，纤维素膜层上还标记有用羊抗小鼠、兔抗小鼠、羊抗牛或兔抗牛IgG溶液
印制的隐形对照印迹，所述金标抗体纤维层上附着有与隐形检测印迹对应的以 胶体金标记的抗蓝舌病病毒的多克隆抗体或单克隆抗体。
所述蓝舌病病毒抗体为蓝舌病病毒的单克隆抗体或多克隆抗体。
所述纤维素膜层为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜和聚偏二氟 乙烯膜中的任意一种制成。
所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成。
所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成。
所述吸水层用吸水纸制成。
所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成。 所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样 品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3 0.7cm处印制有样品标记线。
所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列组合为"II "、 "=="、 "//"、 "- I "、 "+ "、"丄"、""、"參參"、"&"和"^"中的任意一种。
本发明的检测试纸条具有下列优点
(1) 检测特异性强，敏感性高。该快速检测试纸条以胶体金印迹高亲和力的 特异性单抗/多抗为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键 形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单抗/多抗特异性和 亲和力(结合力)影响很小，且具有较高的印迹率。因此，快速检测试纸条具 有较高的特异性和敏感性，可检测到2纳克的相应病毒的蛋白。
(2) 操作简便，快速。使用本发明试纸条时无需附加任何其它仪器和试剂， 只要将其测试端插入待检样品液中30秒左右，然后在5分钟左右即可判定检测 结果。
(3) 结果显示直观、准确。试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为 检测的阳性和阴性印迹，即在纤维素膜上只显示一条棕红色对照印迹C，表示病 毒在被检测样品液中未检出；如果试纸条上出现两条棕红色印迹(即出现对照 印迹C和检测印迹T)，表示检测结果呈阳性，即说明待检样品中检测出BTV; 如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。 检测结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(4) 减少投资和检测成本。使用该快速检测试纸条，不需另配其它仪器、设 备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；专业和非专业人士均可随时 随地进行现场检测，无需支付专家诊断检査费或送样品去诊断室的路费，节省 检测成本，检测费用低。
(5) 应用范围广，便于普遍推广应用。本发明操作简单，将原本复杂的只有 在实验室通过专业人员才能完成的检测过程，简化成为"一步式"或"傻瓜式"的测 试产品，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、 海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具 有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
6四

图l、蓝舌病病毒检测试纸条俯视示意图。
图2、蓝舌病病毒检测试纸条剖面结构示意图。
图中1:支撑层，2:样品纤维吸附层，3:金标抗体纤维层，4:纤维素 膜层，5:吸水层，6:检测线，7:对照线，8-1:测试端保护膜，8-2:手柄端保 护膜，9:样品标记线。
五具体实施例方式
实施例l: 一种检测蓝舌病病毒的试纸条，参见图1和图2，图中l为以硬 质塑胶薄片条制成的支撑层，样品纤维吸附层2用玻璃棉制成，金标抗体纤维 层3用玻璃棉制成，其上附着有胶体金标记的抗BTV单克隆抗体(Wl)，纤维 素膜层4用硝酸纤维素膜制成，吸水层5用吸水滤纸制成，将纤维吸附层2、金 标抗体纤维层3、纤维素膜层4、吸水层5各层依次粘贴在支撑层1上，彼此拼 接的交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上以抗BTV多克隆抗体IgG溶 液(Xi)标记隐形检测印迹6 (代号T)，并以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液标记 出隐形对照印迹7 (代号C);隐形检测印迹6与隐形对照印迹7的排列形式为 "I I "。覆盖在样品纤维吸附层2和金标抗体纤维层3上的(测试端)保护膜 8-1为白色，在样品吸附纤维层2和金标抗体纤维层3交界处对应的保护膜8-1 上偏向于样品吸附纤维层2 —侧0.5cm处印有样品标记线9，样品标记线9的右 端印有箭头及max字样，吸水层5 (手柄端)上覆盖有其它颜色的(如黄色) 保护膜8-2。
用于隐形对照印迹的羊(或兔)抗小鼠/羊/牛IgG抗体，及用于检测印迹和 金标抗体纤维层的抗BTV的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法如下 1)羊抗小鼠IgG的制备
以饱和硫酸铵法提取小鼠血清中的IgG:取1份血清加2份PBS液(pH 7.2) 混匀，加等体积饱和硫酸铵液混匀，置4'C冰箱内2小时，在4。C、 10000r/min 离心15min，弃上清液；以适量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其 最终浓度为33%，置4。C冰箱内2小时，在4'C、 10000r/min条件下离心15min，弃上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4。C冰箱内用PBS液(pH7.2)过夜 透析，换液2 3次，在4。C、 10000r/min条件下离心15min，收集上清液，以 紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以50吗 100^ig (IgG) / (kg体重)经皮下或 肌肉注射抗体阴性健康羊或家兔3 4次，末次免疫20天后，静脉采血，以ELISA 测定其血清抗体效价在1: 2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血 清，以饱和硫酸铵法提取羊抗小鼠的IgG (其提取方法与上述提取小鼠血清IgG 相同，不再重述)，用于标记本发明试纸条的隐形对照印迹。 兔抗小鼠、兔抗羊或兔抗牛的IgG抗体的制备与此相同。
2) 抗BTV单克隆抗体的制备
以50 100pg/只的灭活BTV免疫Balb/c系小鼠三次，每次间隔15 30天； 第三次加强免疫后3 4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，用75%酒精浸泡 5 10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min， 收集脾细胞；将"108的脾细胞与2xl(^ 5xl(f的NSO浆细胞瘤细胞混合， 1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37。C水浴中缓缓加入0.7 lmL的 40% 50%PEG4000 (pH 8.5 9.0)作用lmin，然后缓慢加入无血清1640培养 基15ml，以终止PEG的作用，37。C水浴5 10min， 1000r/min离心10min弃上 清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100 20(HiL/ 孔)，置于37'C 5。/。CO2培养箱中培养7 10天后，以5 10pg/mL的纯化BTV VP7蛋白包被96孔酶标板，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养 上清，挑取强阳性细胞克隆(OD450^0.5)，进行连续三次的有限稀释法克隆化， 所生产的杂交瘤细胞染色体数为92 98，其分泌的抗BTV VP7的单克隆抗体 Wl特异地与BTV反应，而不与鹿流行性出血热病毒群(EHDV)病毒发生交 叉反应，亲和力常数达109~1()，轻链亚型为k或X，重链亚型为IgG。 IgG2a、 IgG2b、 IgG3，用于制备金标单克隆抗体(Wi)。
3) 抗BTVVP7金标单克隆抗体(Wi)和金标单克隆抗体纤维膜的制备 以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50 100mL沸腾的0.01 0.05%氯金
酸水溶液中加入2 4mL的0.5 2%柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K2C03调胶体金pH值至8.5 9.5，以1:1000 1300的印 迹比将待印迹的抗BTVVP7的单克隆抗体Wl加入pH8.5 9.5的金溶胶中，印 迹10min后，力n 20%PEG10000至终浓度0.05%， 4。C下、1500 3000r/min离心 20min，除去未结合的胶体金颗粒，4。C下、15000r/min离心1小时，弃上清液， 获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标 蛋白，分别获得胶体金印迹的抗BTVVP7的单克隆抗体。将1:100 500稀释的 胶体金印迹的上述单克隆抗体吸附于精制玻璃棉(尼龙纤维或聚酯纤维)中，4 'C下低温真空干燥，即制得金标单克隆抗体纤维膜。
4) 抗BTV多克隆抗体(Xi)的制备
采用灭活的BTV细胞毒，单独多次免疫接种抗体阴性健康羊。末次免疫20 天后静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000或1:1024以上，心脏采 血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体(方 法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)。
5) 上述检测试纸条的检测操作方法
a检测样品液的制备无菌取病畜的全血，分离血清，并以生理盐水作 1:10 50倍稀释待测。若取病畜的组织(如脾脏等)将其剪碎、研磨，以生理盐 水制成1:2 5倍的待检测样品悬液，置4'C或室温澄清或离心；
b检测操作将检测试纸条测试端插入待检测样品澄清液或血清中，插入深 度不超过样品标记线9，约30秒后取出试纸条，水平放置约1 5分钟，同时观 察结果。
c结果判断如果在检测试纸条纤维素膜上只显示出一条/个棕红色对照印 迹C，表示测检结果呈阴性，说明在被检样品液中未检测出BTV;如果检测试 纸条上的纤维素膜出现两条/个棕红色印迹(即出现对照印迹C和检测印迹T)， 表示检测结果呈阳性，即说明在待检样品中检测出BTV;如果纤维素膜上没有 任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。
6) 所述检测试纸条测试的原理如下
当该检测试纸条测试端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过层析作用带动待检病畜病毒及金标抗体纤维膜中的金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并最 终渗入手柄端吸水层中，扩散过程中待检病毒可与该病毒相对应的金标单抗相
结合，进而与纤维素膜上检测印迹中的抗该病毒的多抗IgG结合，从而显示出 棕红色的检测印迹T;而对照印迹中的羊抗或兔抗小鼠IgG则可与金标单抗(Wi) 结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检样品液中没有BTV，试纸条只显示出 一条/个棕红色对照印迹C;如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明 试纸条已失效或操作失误。
实施例2: —种检测蓝舌病病毒的试纸条，其结构、制备方法与实施例l基 本相同，不同之处在于样品纤维吸附层2用聚酯纤维制成，金标抗体纤维层3 由尼龙纤维制成，上面附着以胶体金标记的抗BTV金标多克隆抗体(Xi);纤 维素膜层4采用硝酸纤维素膜，以抗BTV单克隆抗体IgG溶液(Wi)喷涂出1 条检测印迹6，并以兔抗羊IgG溶液喷涂出对照印迹7，检测印迹6与对照印迹 7的排列形式为"//"。其它包括检测样品的制备、操作方法和结果判定等，均与 实施例1相同，不重述。
实施例3: —种检测蓝舌病病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例l基本 相同，不同之处在于金标抗体纤维层3用聚酯纤维制成，其上附着有胶体金 标记的抗BTV单克隆抗体(Wl);纤维素膜层4用聚偏二氟乙烯膜制成，上面 以对应的抗BTV多克隆抗体IgG溶液(Xi)标记出一个检测印迹，并以羊(或 兔)抗小鼠IgG溶液印上对照印迹。检测印迹6与对照印迹7的排列形式为"="。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
实施例4: 一种检测蓝舌病病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例3基本 相同，不同之处在于金标抗体纤维层3用尼龙纤维制成，其上附着有胶体金 标记的抗BTV多克隆抗体(Wl);纤维素膜层4用聚偏二氟乙烯膜制成，其上 以抗BTV单克隆抗体IgG溶液(Xi)印制出一条检测印迹6，并以兔抗羊IgG 溶液标记出对照印迹7，检测印迹与对照印迹的排列组合为"參參"。其它包括 检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
实施例5: —种检测蓝舌病病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例3基本
10相同，不同之处在于金标抗体纤维层3用尼龙纤维制成，其上附着有胶体金
标记的抗BTV单克隆抗体(Wl);纤维素膜层4用聚偏二氟乙烯膜制成，上面
以识别另一表位的抗BTV单克隆抗体IgG溶液(Xi)印制出检测印迹，并以羊
(或兔)抗鼠IgG溶液标记出对照印迹，检测印迹与对照印迹的排列组合为 "一 J "、 " + "、"丄"、""、和"^"中的任意一种。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。 实施例6: —种检测蓝舌病病毒试纸条结构和实施例l基本相同，不同之处 在于支撑层1由不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2由尼龙纤维制成， 纤维素膜层4采用纯纤维素膜制成，以羊抗牛或兔抗牛IgG溶液印制的隐形对 照印迹。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例l，不重述。 实施例7: —种检测蓝舌病病毒试纸条结构和实施例l基本相同，不同之处
在于样品吸附纤维层2由聚酯纤维膜制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式
l，不重述。 实施例8: —种检测蓝舌病病毒试纸条结构和实施例3基本相同，不同之处
在于测试端的样品吸附纤维层2用尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用聚偏二
氟乙烯(PVDF)纤维膜。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例l，不重述。
实施例9: 一种检测蓝舌病病毒试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处 在于样品吸附纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例l，不重述。
权利要求
1. 一种检测蓝舌病病毒的试纸条，包括支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层是由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于所述纤维素膜层上标记有用蓝舌病病毒抗体溶液印制的隐形检测印迹，纤维素膜层上还标记有用羊抗小鼠、兔抗小鼠、羊抗牛或兔抗牛IgG溶液印制的隐形对照印迹，所述金标抗体纤维层上附着有与隐形检测印迹对应的以胶体金标记的抗蓝舌病病毒的多克隆抗体或单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的检测蓝舌病病毒的试纸条，其特征在于所述蓝舌 病病毒抗体为蓝舌病病毒的单克隆抗体或多克隆抗体。
3. 根据权利要求1所述检测蓝舌病病毒的试纸条，其特征在于所述纤维素 膜层为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意 一种制成。
4. 根据权利要求1所述的检测蓝舌病病毒的试纸条，其特征在于所述样品 吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成。
5. 根据权利要求1所述的检测蓝舌病病毒的试纸条，其特征在于所述支撑 层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成。
6. 根据权利要求1所述的检测蓝舌病病毒的试纸条，其特征在于所述吸水 层用吸水纸制成。
7. 根据权利要求1所述的检测蓝舌病病毒的试纸条，其特征在于所述金标 抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成。
8. 根据权利要求1所述的检测蓝舌病病毒的试纸条，其特征在于所述样品 吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层 与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3 0.7cm处印制有样品标记线。
9. 根据权利要求l-8任一项所述的检测蓝舌病病毒的试纸条，其特征在于所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列组合为"II "、"="、"//"、"-1 "、"+"、"丄"、""、"參參"、和"众"中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了一种检测蓝舌病病毒的试纸条，包括支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层是由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜层上标记有用蓝舌病病毒抗体溶液印制的隐形检测印迹，纤维素膜层上还标记有用羊抗小鼠、兔抗小鼠、羊抗牛或兔抗牛IgG溶液印制的隐形对照印迹，所述金标抗体纤维层上附着有与隐形检测印迹对应的以胶体金标记的抗蓝舌病病毒的多克隆抗体或单克隆抗体。本发明试纸条可现场操作，能快速检测蓝舌病病毒，结果显示直观、准确、特异性强、敏感性高，使用简便、且检测成本低廉；应用范围广，便于普遍推广应用。
文档编号G01N33/577GK101424689SQ200810231379
公开日2009年5月6日 申请日期2008年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者刘庆堂, 吕茂民, 尹惠琼, 红 张, 张改平, 姝 杨, 杨继飞, 柴书军, 章金刚, 东 赵, 邢广旭, 郝慧芳 申请人:河南省农业科学院;中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所