专利名称：多个传染病项目同时检测的酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种多个传染病项目同时检测的酶促化学发光免疫分析定性诊断
试剂盒。
背景技术：
艾滋�。椿竦眯悦庖呷毕葑酆现�(Acquired Immure Deficiency Syndrome,AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起的严重疾病。AIDS可通过性传播、血液传播和母婴传播三种途径感染人类。HIV(l+2)抗体的检出是艾滋病诊断的必要条件，目前的艾滋病病原学诊断技术主要包括HIV病毒分离、HIV病毒载量测定、HIV核酸测定，以及病毒抗原检测和病毒特异性抗体检测等。其中抗体检测是常规检测方法，包括ELISA、 CLIA、 PA、 IFA和斑点印迹在内的检测技术用于筛选实验，免疫印迹试验(WB)用于确认实验，抗体检测以外的方法用于特殊情况的检测。 梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋体(又称苍白螺旋体，TP)引起的常见性传播疾病之一。其临床病程漫长，临床表现极为复杂，几乎可侵犯全身各种组织和器官，并产生多种多样复杂的临床症状和体症，可反复发作。梅毒是一种全身性的疾�。缙谥饕址钙し粽衬ぃ砥谇址改谠嗥鞴伲现卣呖梢鹧现氐男难芟低澈蜕窬低乘鸷�。
乙型肝炎是一种严重的常见的肝脏疾�。壳叭蛉丝谥校�20亿人已经在其生命中的某个时期感染过乙型肝炎病毒(HBV)，其中，大约3.5亿仍然为慢性感染者，成为病毒的携带者。全世界四分之三的人口生活在感染的高发区。每年HBV急性临床病例超过4百万，携带者中大约25%，也就是每年100万人死于慢性活动性肝炎、肝硬化或原发性肝癌。我国是世界上乙肝病毒感染最严重的国家，约有1. 2亿人为乙肝病毒携带者，占世界的三分之一。其中3000万为慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌，每年有30万人死于慢性肝�。渲性�13万人为原发性肝癌患者。 丙型肝炎是一种主要经血液传播、由丙型肝炎病毒引起的严重肝脏疾病。全世界目前有l亿丙型肝炎病毒携带者，中国约占四千万人。80%的丙型肝炎病毒携带者会患上慢性肝炎，其中约10-30%的病人将发展为肝硬化，5-10%的肝硬化患者可发展成肝癌。
这些传染性疾病已严重威胁人类的健康，对付传染病最有效的方法就是切断其传播途径，传染病标志物的检测对疾病的早发现，早治疗、早预防尤显重要，传统的检测方法主要是单个项目进行检测，操作繁琐，检测时间长，成本高，而且容易出现操作错误。
临床上对上述血清标志物的检测常常都一份样本需同时检测几个项目，最常见的检测项目组合有血源筛查四项(HIV抗体、TP抗体、HCV抗体和HBsAg)，肝五项(HBsAg、HBsAb、 HBeAg、 HBeAb和HBcAb)和传染病八项(HIV抗体、TP抗体、HCV抗体、HBsAg、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb和HBcAb)。血源筛查四项常用于供血者和患者手术前的常规检测，乙肝五项是国内一个最常见的检测组合，目前广泛用于临床检测，传染病八项也常常患者手术前的检测项目，在很多医疗机构已经成为一项入院常规检测。
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与传统检测方法相比，本发明采用先进的微孔板化学发光免疫分析法，在一次试验中可以同时对一份样本进行多个传染病项目的检测，同时得到检测结果；具有与传统试剂盒一样的灵敏度和特异性，但操作易用性大大提高，縮短了操作时间、操作程序，可灵活地组合几种不同的检测项目。有利于大规模推广应用。本发明的反应与传统化学发光法几乎一样，应用表面特殊处理的标准不透明96孔微孔板作为载体，保证了反应的方便性与快捷性，兼容市场上通用的所有型号洗板机或全/半自动板式化学发光免疫分析系统；解决了其它基于玻片或膜等的生物芯片反应步骤的手工操作过多且操作复杂、可重复性差、均一性差等问题。
发明内容
本发明的目的是提供了简便、快捷、准确的同时检测多个传染病项目的酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒。 本发明是由96孔位的支撑架及放置其上的可拆卸的不透明微孔板条组成，其中，每12孔为一个反应条，每个反应条负载相同的抗原或抗体，检测同一个传染病项目，可以同时检测4-8种传染病项目。 本发明精心设计的96孔板酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒，高度灵敏和特异，操作简便快速，可在一次试验中同时检测4-8种传染病项目是否含有待测物，费用低廉。它简便快速，多个检测项目同时加样，同时洗板，减少加样时间，避免反复使用样本造成样本的污染和顺序颠倒等操作失误，根据多项检测结果对受检者进行综合判断，便于样本结果的处理等优点。本发明特别适合体检中心，临床医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有实用价值的检测手段。
图1、2本发明实施例1的结构示意图。
图3本发明实施例2的结构示意图。
图4本发明实施例3的结构示意图。
具体实施例方式
实施例1制备血源筛查4项同时检测酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒
—、酶标记物的制备 用改良的过碘酸钠氧化法标记人类免疫缺陷病毒1+2型抗原、梅毒螺旋体抗原、抗人IgG、乙型肝炎表面抗体。 酶标记物稀释液配制称量12. 12g的Tris，9g NaCl， 200mL新生牛血清，0. 5mLTween 20和lmL Proclin 300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，调pH值7. 0 7. 5加双蒸水至1L，溶解混匀。 分别采用棋盘实验选择四种酶标记物的工作浓度。每个产品分装一瓶，共分装四
瓶或四种酶标记物混合在一瓶中。 二、传染病项目复合对照品的制备 用人类免疫缺陷病毒抗体(Anti-HIV)、梅毒螺旋体抗体(Anti-TP)、丙型肝炎病毒抗体(Anti-HCV)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性血清经灭活后，配制成血源筛查4项复合阳性对照，用正常人血清或新生牛血清配制成复合阴性对照，2mL/瓶分装。
三、固相微孔板条的制备 如图1所示，在反应条A、B板条上的微孔中包被上HIV l+2型抗原，C和D板条上的微孔中包被上梅毒抗原(TP15， TP17， TP47蛋白)，在E和F板条上的微孔中包被上丙型肝炎病毒抗原，在G和H板条上的微孔中包被上乙型肝炎病毒表面抗体。如检测样本量较少，可在A D排依次按上HIV、 TP、 HCV和HBsAg的固相微孔板条，如图2所示。四种检测项目包被板条尾翼上分别贴上标有"HIV、 TP、 HCV、 sAg"的小标签。
四、化学发光底物液 化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0. 3mM 4_羟基联苯、0. 05mM 4-碘苯硼酸、0. 2M pH8. 7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8. 0 10. 0 ; 化学发光底物B液，包括3. 5mM过氧化脲、0. 1 % Tween20、0. 2M pH7. 2磷酸盐缓冲液，其pH值为7. 0 7. 6。
五、20倍洗涤液 称量24g Tris，4g的KC1， 160g NaCl于洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀，调整PH至7. 4。 六、半成品及成品组成 上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成血源筛查四项同时检测酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒。组装成试剂盒后需抽检合格后才能出厂。 实施例2制备乙肝五项同时检测酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒
—、酶标记物的制备 用改良的过碘酸钠氧化法标记乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体。 酶标记物稀释液配制称量12. 12g的Tris，9g NaCl， 200mL新生牛血清，0. 5mLTween 20和lmL Proclin 300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，调pH值7. 0 7. 5加双蒸水至1L，溶解混匀。 分别采用棋盘实验选择四种酶标记物的工作浓度。每个产品分装一瓶，共分装四瓶，其中酶标乙型肝炎病毒e抗体可同时用于乙型肝炎病毒e抗原和e抗体的检测。
二、传染病项目复合校准品的制备 采用基因工程HBsAg、基因工程HBeAg用新生牛血清稀释至一定浓度，配制成乙肝抗原复合阳性对照，用多克隆HBsAb、多克隆HBeAb和多克隆HBcAb用新生牛血清稀释至一定浓度，配制成乙肝抗体复合标准品，用乙肝五项全阴性正常人血清或新生牛血清配制成乙肝复合阴性对照，分别分装阴阳性对照品，2mL/瓶。
三、固相微孔板条的制备 如图3所示，在板条A的微孔中包被乙型肝炎病毒表面抗体，在板条B中包被乙型肝炎病毒表面抗原，在板条C微孔中包被乙型肝炎病毒e抗体，在板条D微孔中先包被乙型肝炎病毒e抗体，再包被适量的乙型肝炎病毒e抗原，在板条E的微孔中包被乙型肝炎病毒核心抗原，板条A-E分别用于检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，并在板条尾翼上分别
5打上标签"sAg， sAb， eAg， eAb， cAb，，。
四、化学发光底物液 化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0. 3mM 4-羟基联苯、0. 05mM 4-碘苯硼酸、0. 2M pH8. 7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8. 0 10. 0 ; 化学发光底物B液，包括3. 5mM过氧化脲、0. 1 % Tween20、0. 2M pH7. 2磷酸盐缓冲液，其pH值为7. 0 7. 6。
五、20倍洗涤液 称量24g Tris，4g的KC1， 160g NaCl于洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀，调整PH至7. 4。 六、半成品及成品组成 上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成同时检测乙肝五项酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒。组装成试剂盒后需抽检合格后才能出厂。 实施例3制备传染病八项同时检测酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒
配制HIV抗体、TP抗体、HCV、HBsAg、HBeAg混合阳性对照，用于HIV、TP、HCV、HBsAg和HBeAg，配制HBsAb、 HBeAb、 HBcAb为乙肝抗体混合阳性对照，用新生牛血清配制阴性对照。分别分装阴阳性对照品，2mL/瓶。 酶标记物和固相微孔板条的制备方法同实施例1和2，将包被好的微孔板条按HIV、TP、HCV、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb顺序依次安插于96孔支撑架A H排上，如图4。 试剂盒中其余成分的制备方法同实施例1和2。
实施例4同时检测试剂盒的使用方法 当样本需要同时检测HIV抗体、TP抗体、HCV抗体和HBsAg时，使用实施例1试剂 当样本需要同时检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb时，使用实施例2试剂 当样本需要同时检测HIV抗体、TP抗体、HCV抗体、HBsAg、 HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、HBeAb和HBcAb时，使用实施例3试剂盒。 实施例1 3同时检测酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒的使用方法如下
取出试剂盒室温平衡20 30分钟，拆开包装，取出所用板条，剩余板条用自封袋
密封，4t:保存。 1、每个检测项目设阴性对照1 L阳性对照1孔，取每份样本分别加入板条相应孔内，每孔50 iU，同一份血可以不换加样枪头连续加样，不同样本间需更换枪头，再往阴性对照孔内加入复合阴性对照50 iU，阳性对照孔内加入相应的复合阳性对照50 ii 1，振荡混匀后，置入37。C温育30分钟。 2、用稀释后的洗涤液进行洗板，可手工洗板，也可用全自动洗板机进行洗板，每孔加入洗涤液50iU，浸泡至少10秒，后弃液或吸干，如此反复3 5次。
3、每孔加入相应的酶工作液50 iU，置37。C温育30分钟。
4、如步骤3洗板5次
5、每孔加入已1 : 1混合的化学发光底物液50 lOOul，置室温反应5分钟。
6、用微孔板化学发光分析仪进行读数，根据Cutoff值判断样本中是否还有待测 物。
权利要求
一种多个传染病项目同时检测的酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒，其特征在于，所描述试剂盒是一个可以同时检测4-8种传染病项目的酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述4-8种传染病项目同时检测包括血源筛查4项同时检测；乙肝五项同时检测；传染病八项同时检测。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被有不同抗原或抗体 的微孔板、辣根过氧化物酶标记的相应抗原或抗体的混合物、阴性对照血清、混合的阳性对 照血清，浓縮洗涤液以及作用于辣根过氧化物酶的化学发光底物液。
4. 如权利要求2所述的传染病项目，其特征在于，所述血源筛查4项为人类免疫缺 陷病毒(HIV)抗体、梅毒螺旋体(TP)抗体、丙型肝炎病毒(HCV)抗体、乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)。
5. 如权利要求2所述的传染病项目，其特征在于，所述乙肝五项为乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(HBeAb)、 乙型肝炎核心抗体(HBcAb)。
6. 如权利要求2所述的传染病项目，其特征在于，所述传染病八项为人类免疫缺陷病 毒抗体、梅毒螺旋体抗体、丙型肝炎病毒抗体、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎表面抗体、乙型 肝炎e抗原、乙型肝炎e抗体、乙型肝炎核心抗体。
7. 如权利要求3所述的试剂盒，其微孔板是由96孔位的支撑架及放置其上的可拆卸的 不透明微孔板条组成，在每个可拆卸的不透明反应条上设置反应孔，在每个反应孔上包被 有相应的抗原或抗体，其特征在于每12孔为一个反应条，每个反应条负载相同的抗原或 抗体，检测同一个传染病项目，不同的反应条组合可以4-8种传染病项目同时检测。
8. 如权利要求3所述的试剂盒，其辣根过氧化物酶标记的相应抗原或抗体的混合物包 含人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体、梅毒螺旋体(TP)抗体、丙型肝炎病毒(HCV)抗体、乙型肝 炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗 体(HBeAb)和乙型肝炎核心抗体(HBcAb)，其特征在于其混合物分成2瓶，HBsAg、HBeAg的 标记物和HIV、 TP、 HCV、 HBcAb中任意混合物装成一瓶，HBsAb、 HBeAb和HIV、 TP、 HCV、 HBcAb 中任意混合物装成另一瓶。
9. 如权利要求3所述的试剂盒，其混合的阳性对照血清包含人类免疫缺陷病毒(HIV) 抗体、梅毒螺旋体(TP)抗体、丙型肝炎病毒(HCV)抗体、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝 炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗体(HBeAb)和乙型肝炎核心 抗体(HBcAb)，其特征在于其混合物分成2瓶，HBsAg、HBeAg和HIV、TP、HCV、HBcAb中任意 混合物装成一瓶，HBsAb、 HBeAb和HIV、 TP、 HCV、 HBcAb中任意混合物装成另一瓶。
全文摘要
本发明提供了一种多个传染病项目同时检测的酶促化学发光免疫分析定性诊断试剂盒。本发明是由包被不同的相应抗原或抗体的微孔板条、混合的辣根过氧化物酶标记物、阴性对照血清、混合的阳性对照血清、浓缩洗涤液和化学发光底物组成。其特征在于每12孔为一个反应板条，每个反应板条负载相同的抗原或抗体，检测同一个传染病项目，不同的反应条组合，可以同时检测4-8种传染病项目。本发明能方便、快捷同时检测多种传染病项目。
文档编号G01N33/576GK101750493SQ200810240128
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者于尚永, 唐宝军, 应希堂, 胡国茂, 詹先发, 郑金来 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司
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