专利名称：磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒。 技术背景
磺胺二甲嘧啶(Sy lfamethazine SM2 )，作为磺胺类药物的一种，其性质稳定、 抑菌谱广、毒性小、口服易吸收且价格低廉，是畜牧业上应用最广泛、应用量最大的药物之一。但是由于它在体内的作用时间和代谢时间较长，易残留在动物体内，通过任何途径都可能在人体中蓄积。药物蓄积浓度超过一定值对人体机能是有害的，长期蓄积则会导致磺胺药抗药性的产生，造成耐药菌的流行性感染，且有潜在的致癌性。因此，欧盟对牛奶和肉类食品中的磺胺类药物制定了最高允许值，即磺胺类药物总量不得超过IOOyg/ kg，单个磺胺类药物的浓度不得超过25 μ g/ kg。2002年12月我国农业部公告第235号文件规定在所有食品动物的肌肉、脂肪、肝和肾中磺胺类最高残留限量100 μ g/kg，并将磺胺二甲嘧啶列作为重点监控的对象。
目前，检测SM2的方法有微生物法，物理化学法，如高压液相色谱(HPLC)、气-液色谱(GLC)、质谱(MQ、薄层色谱法(TLC)等，微生物法检测速度较快，但对磺胺药缺乏灵敏性和特异性，物理化学法则存在前处理繁琐，需要昂贵仪器及其专业操作等特点，检测大批样本较为困难，不利于大范围的推广应用。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、快速、适合大批量样品初筛的磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案一种磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，有一盒体，所述盒体中包括 (1)包被有磺胺二甲嘧啶抗原的酶标板；(2)磺胺二甲嘧啶特异性抗体；(3)酶标记物；(4)磺胺二甲嘧啶标准品溶液；(5)A底物显色液和B底物显色液；(6)终止液;(7)浓缩洗涤液；(8)浓缩复溶液；(9)浓缩提取液。
所述磺胺二甲嘧啶抗原由磺胺二甲嘧啶半抗原和载体蛋白通过重氮化法偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清蛋白或鼠血清蛋白。
所述磺胺二甲嘧啶特异性抗体为由所述磺胺二甲嘧啶抗原按常规的免疫方法制备得到单克隆抗体或多克隆抗体，其工作液为PH7. 4的含有0. 1-5% (w/w)脱脂奶粉的磷酸3缓冲液，磺胺二甲嘧啶特异性抗体与上述工作液的比为1:2000 (w/w)0
所述酶标记物为酶标记的抗鼠或抗兔的抗抗体，其工作液为pH7. 4的含有0. 1-5% 脱脂奶粉的磷酸缓冲液，酶标记物与上述工作液的比为l:4000(w/w)，标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
所述磺胺二甲嘧啶标准品溶液浓度分别为0yg/L、0.5 yg/LU.5 μ g/L、4. 5 μ g/L>13. 5 μ g/L>40. 5 μ g/L。
所述A底物为0. 06% (w/w)的过氧化氢，B底物为0. 4% (w/w)四甲基联苯胺。
所述浓缩提取液为NaOH浓度为0. 1M，pHIO的磷酸缓冲液，所述浓缩复溶液为含 0. 1%-0. 6% (w/w)DMSO的磷酸盐缓冲液，所述浓缩洗涤液为0. 9% (w/w)的NaCl溶液，所述终止液为2N的硫酸溶液。
本发明磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒的有益效果是本发明的检测磺胺二甲嘧啶残留的酶联免疫试剂盒采用的是直接竞争ELISA法，克服了其他试剂盒操作时间长、 前处理复杂的问题，整个操作过程只需30min，前处理无需配备特殊的仪器，操作简单、快速，适合现场大批量筛查，且试剂盒各试剂均是工作液形式，操作简单易行。
图1为磺胺二甲嘧啶标准曲线图。
具体实施方式
一种磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，有一盒体，所述盒体中包括(1)包被有磺胺二甲嘧啶抗原的酶标板；(2)磺胺二甲嘧啶特异性抗体；(3)酶标记物；(4)磺胺二甲嘧啶标准品溶液；(5)A底物显色液和B底物显色液；(6)终止液;(7)浓缩洗涤液；(8)浓缩复溶液；(9)浓缩提取液。
一、本发明试剂盒的制备过程如下1、制备包被有磺胺二甲嘧啶包被原的酶标板用PH9. 6的碳酸盐缓冲液将磺胺二甲嘧啶包被原稀释成0. 25mg/ml, 100 μ 1/孔加入到酶标板孔上，其中磺胺二甲嘧啶包被原优选卵清蛋白作为载体蛋白；4°C过夜或37°C孵育池，洗涤4-5次，拍干；加入含有10%小牛血清的封闭液，200 μ 1/孔，37°C孵育池；室温在真空干燥箱中抽干5h，用铝箔袋真空塑封。
2、抗原的制备 (1)免疫抗原的制备称取55. 6mg的SM2溶于1 ml lmol/L的HCl中，作为I液，并保持在4°C ； (2)称取 15mg亚硝酸钠溶于Iml蒸馏水中，缓慢滴加入A液，边滴加边搅拌，保持pH值低于3 ； (3)反应结束后用氨基磺酸消耗过量的亚硝酸，用淀粉碘化钾试纸检测，直至渗圈从深蓝色变成浅黄色为止，作为B液；(4)称取50mgBSA溶于^iil lmol/L pH9. 6碳酸钠缓冲液中，即配成 C液；(5)在4°C放置Ih后，将经过活化得到的B液逐滴加入C液中，反应过程中保持pH9， 在4°C搅拌反应Mi ； (6)用0. 01mol/L的PBS透析3天，每天换液2次，即制备得SM2-BSA。
(2)检测抗原的制备同免疫抗原的制备。
3、磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的制备动物免疫载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周龄的雌性Blab/c小鼠，间隔2周免疫1次，三免后断尾取血测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合。
细胞融合取小鼠的脾细胞和本实验室保存的SP2/0细胞，进行融合，间接ELISA 法测定上清选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克�。敝两⒉ヒ豢够前范奏奏さ牡タ寺】固宓脑咏涣鱿赴�。
单克隆抗体的大量制备选取个体较大的雌性Blab/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20°C保存。
4、样品前处理(1)肉类、肝脏、肾脏等组织将样品组织除去脂肪后勻浆，称取2g勻质物，加入細1的提取液，涡旋振荡5min，室温 (20-25°C)下 3000g 离心 5min，取上清 Iml 用 lmol/L HCL 调 PH 在 7. 0-7. 5，70°C-80°C下水浴lOmin，室温(20-25°C)下3000g离心5min，取上清液50 μ 1进行检测。
(2)尿样前处理将尿样3000rpm离心5min至清亮，取上清用复溶液稀释5倍后，取50 μ 1进行检测。
(3)饲料前处理将样品组织除去脂肪后勻浆，称取2g勻质物，加入細1的提取液，涡旋振荡5min，室温 (20-25°C)下 3000g 离心 5min，取上清 Iml 用 lmol/L HCL 调 PH 在 7. 0-7. 5，70°C-80°C下水浴lOmin，室温(20-25°C)下3000g离心5min，取上清液50 μ 1进行检测。
(4)牛奶前处理将牛奶用复溶液稀释5倍后，室温(20-25°C)下3000g离心5min，取上清液50 μ 1进行检测。
5、溶液的配制(1)浓缩提取液的配制配置含NaOH浓度为0. 1Μ，pHIO的磷酸盐缓冲液。
(2)浓缩复溶液的配制配置含0. 1%-0. 6% (w/w) DMSO的磷酸盐缓冲液，PH为7. 4，磷酸盐浓度为0. 1M。
(3)磺胺二甲嘧啶标准液的配制准确称取IOOmg磺胺二甲嘧啶标准样，溶于100ml甲醇中，用缓冲液稀释成40. 5 μ g/ L、13. 5 μ g/L>4. 5 μ g/LA. 5 μ g/L、0. 5 μ g/L,0 μ g/L。
6、酶联免疫试剂盒的组装(1)各试剂在装瓶过程中都是无菌操作。
(2)单条8孔的板条真空塑封，6或12条装；浓缩洗涤液2瓶20ml ；浓缩提取液1瓶20ml ；浓缩复溶液1瓶20ml ；A、B底物显色液各一瓶7ml ；磺胺二甲嘧啶特异性抗体工作液1瓶3ml ；酶标抗抗体工作液1瓶7ml ；终止液一瓶7ml ；磺胺二甲嘧啶标准品6瓶，Iml/ 瓶；100 μ g/L高浓度标准品1瓶，Iml/瓶；说明书一份；微孔板封口膜一张，板框一块。
(3)检测合格后封装，在4°C保存。
7、试剂盒检测方法(1)取出试剂盒中试剂恢复至室温，至少在室内放置30min；(2)按需要取出板条，放置在酶标板上；(3)按需要的量将磺胺二甲嘧啶特异性抗体和酶标物按1:5比例混合；(4)向孔内依次加入磺胺二甲嘧啶标准品(或待测样品)50μ1，加入磺胺二甲嘧啶特异性抗体和酶标物的混合物(1 5) 60 μ 1，轻轻振荡混勻，37°C避光孵育20min ；(5)洗涤4次，拍干；(6)将底物A显色液和底物B显色液按1 1比例混合，100 μ 1/孔加入显色，37°C避光孵育IOmin ；(7)加终止液50μ 1终止反应，酶标仪450nm和595nm下进行双波长测定，根据标准曲线进行定量或定性。
(8)检测结果分析定量分析分别计算标准品和待测样品的平均吸光度值，标准品或样品的吸光度值 (B)除以0标准品的吸光度值再乘以100%，即为百分吸光度值，百分吸光度值=(Β/Β0) X100%。以百分吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示。 将待测样本的百分吸光度值代入标准曲线，即可求出对应的浓度，再乘以稀释倍数即为样本的实际残留。
定性分析用待测样本的平均吸光度值和标准品的吸光度值相比较，即可得出待测样本的浓度范围。
检测结果也可以用专业的计算机软件进行计算，测试范围为0. 5μ g/ml-40. 5μ g/ ml，整个检测过程只需30min。
二、试剂盒的灵敏度试验灵敏度以最低检测限(mg/kg或yg/kg)表示。分别测定20份鸡肉组织、猪肉组织、猪肝、猪尿、饲料、牛奶等空白样品，及20份磺胺二甲嘧啶0标准品。求(Β/Β0)%值的平均值 (X)和标准差(SD)，从标准曲线上求出X-2SD值对应的标准品浓度，作为各样本的最低检测限。
本试剂盒的50%抑制浓度在1. 3-2. 0 μ g/L范围内，组织的检测限约为1 μ g/L,尿液 1. 5 μ g/L,饲料 3. 0 μ g/L,牛奶 2. 0 μ g/L。
三、试剂盒的精确度试验从检测合格的试剂盒中，选取同一批次和不同批次的酶标板，测定0. 5μ g/L、4. 5μ g/ L、13. 5 μ g/L三个添加浓度下的变异系数，每个样品做20个复孔。在所测的猪肉组织、猪肝、猪尿、饲料、牛奶等样品中，批内变异系数均<7. 8%，批间变异系数均<9. 1%。
四、试剂盒的回收率试验测定0. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、13. 5 μ g/L三个添加浓度下的样品添加回收率试验，每个浓度做5个复孔，重复3次试验。结果肉、肝等组织的添加回收率为65%-110%，猪尿、牛奶的添6加回收率为80%-120%，饲料中的添加回收率为55%-95%。
五、试剂盒的保存期试验(1)将试剂盒放置在2°C _8°C保存6个月，期间每隔1个月检测一次，测定试剂盒的 IC50%、ODmax、回收率等各项参数。
(2)将试剂盒放置在37°C放置6天，每天检测一次，测定试剂盒的IC50%、ODmax, 回收率等各项参数。
(3)将试剂盒放置在_20°C冷冻6天，每天检测一次，测定试剂盒的IC50%、0Dmax、 回收率等各项参数。
结果看出，三种条件保存试验，本试剂盒的各项指标均符合质量要求，因此，此试剂盒可以在2°C _8°C保存至少6个月。
权利要求
1.一种磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，有一盒体，其特征在于所述盒体中包括(1)包被有磺胺二甲嘧啶抗原的酶标板；(2)磺胺二甲嘧啶特异性抗体；(3)酶标记物；(4)磺胺二甲嘧啶标准品溶液；(5)A底物显色液和B底物显色液；(6)终止液;(7)浓缩洗涤液；(8)浓缩复溶液；(9)浓缩提取液。
2.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述磺胺二甲嘧啶抗原由磺胺二甲嘧啶半抗原和载体蛋白通过重氮化法偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清蛋白或鼠血清蛋白。
3.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述磺胺二甲嘧啶特异性抗体为由所述磺胺二甲嘧啶抗原按常规的免疫方法制备得到单克隆抗体或多克隆抗体，其工作液为PH7. 4的含有0. 1-5% (w/w)脱脂奶粉的磷酸缓冲液，磺胺二甲嘧啶特异性抗体与上述工作液的比为1:2000 (w/w)0
4.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述酶标记物为酶标记的抗鼠或抗兔的抗抗体，其工作液为PH7. 4的含有0. 1-5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液，酶标记物与上述工作液的比为1:4000 (w/w)，标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
5.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述磺胺二甲嘧啶标准品溶液浓度分别为 Oyg/L、。. 5 yg/LU.5 μ g/L、4. 5 μ g/LU3. 5 μ g/L、40. 5 μ g/L0
6.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述A底物为0. 06% (w/w)的过氧化氢，B底物为0. 4% (w/w)四甲基联苯胺。
7.根据权利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述浓缩提取液为NaOH浓度为0. ΙΜ,ρΗΙΟ的磷酸缓冲液，所述浓缩复溶液为含0. 1%_0. 6% (w/w)DMS0 的磷酸盐缓冲液，所述浓缩洗涤液为0. 9% (w/w)的NaCl溶液，所述终止液为2N的硫酸溶液。
全文摘要
本发明涉及一种磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒，其盒体中包括(1)包被有磺胺二甲嘧啶抗原的酶标板；(2)磺胺二甲嘧啶特异性抗体；(3)酶标记物；(4)磺胺二甲嘧啶标准品溶液； (5)A底物显色液和B底物显色液； (6)终止液； (7)浓缩洗涤液； (8)浓缩复溶液； (9)浓缩提取液。本发明试剂盒克服了其他试剂盒操作时间长、前处理复杂的问题，整个操作过程只需30min，前处理无需配备特殊的仪器，操作简单、快速，适合现场大批量筛查，且试剂盒各试剂均是工作液形式，操作简单易行。
文档编号G01N33/577GK102507945SQ20111035225
公开日2012年6月20日 申请日期2011年12月5日 优先权日2011年12月5日
发明者吴萌, 李君华, 李春生, 程华, 闫静辉, 齐颖颖 申请人:河北省科学院生物研究所
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