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专利名称：一种检测载脂蛋白c3的试剂盒及利用其实现的检测方法
技术领域：
本发明涉及属于医学免疫体外诊断领域，尤其涉及一种检测载脂蛋白C3的试剂盒以及利用该试剂盒实现的检测方法。
背景技术：
载脂蛋白C3主要存在于极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及乳糜微粒中。载脂蛋白C3基因全长约3. lkb，位于11号染色体长臂载脂蛋白A I/C III/A IV基因簇内，在肝脏和小肠中均有表达。载脂蛋白C3有抑制脂蛋白脂肪酶及肝细胞膜载脂蛋白E受体的功能，在调节极低密度脂蛋白及乳糜微粒的分解代谢中起重要作用。在严重的高甘油三酯血症常伴有载脂蛋白C3含量的明显升高。故测定血清载脂蛋白C3含量对探讨高甘油三酯血症的动脉粥样硬化发病机制有重要意义。目前常用的载脂蛋白C3的检测方法是酶联免疫法。酶联免疫法的基本原理是基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，通常以48孔或96孔的聚苯乙烯酶标板为载体；未结合的抗体通过洗涤除去。加入待检样本反应一段时间后，样本中的抗原会和固相载体上的抗体结合形成固相抗原复合物。洗涤除去未结合的杂质。加入酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样品中待测物质的量正相关。加底物，夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。酶联免疫法测定过程较为繁琐，自动化程度不高，需要配备多种专门设备，不能直接在全自动生化分析仪上进行批量检测分析。随着检测自动化进程的加快以及样本检验数量的不断增加，临床上迫切需要一种更为简便、快捷的方法来进行规模化批量操作。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测载脂蛋白C3的试剂盒及利用其实现的检测方法，其更为简便、快捷，从而消除上述背景技术中缺陷。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，其含有试剂R1、试剂R2和载脂蛋白C3校准品，其中，试剂Rl含有缓冲液10 500mM，表面活性剂O. 5 50g/L，稳定剂O. 5 10g/L，电解质5 50g/L,高分子促进剂I 100g/L,防腐剂I 10g/L, pH为6 9 ;试剂R2含有缓冲液10 500mM，抗人载脂蛋白C3抗体5 50% (w/v)，稳定剂O. 5 10g/L,电解质5 50g/L,防腐剂I 10g/L, pH为6 9 ;校准品包括缓冲液10 500mM、载脂蛋白C3抗原、稳定剂5 50g/L、防腐剂I 10g/L、抗氧化剂 O. 01 10g/L。上述缓冲液10 500mM，也就是浓度为10 500mmol/L。抗人载脂蛋白C3抗体5 50% (w/v)，也就是浓度为50 500g/L。
优选的，本发明提供的试剂盒中，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO, MOPS、Hepes缓冲液中的一种或几种；所述的表面活性剂选自Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烧基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种；所述的稳定剂选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1，2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清蛋白中的一种或几种；所述的电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或几种；所述的高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠中的一种或几种；所述的防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种；所述的抗人载脂蛋白C3抗体选自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人或牛抗人载脂蛋白C3抗体中的一种；所述抗氧化剂选自丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、磷月旨、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、特丁基对苯二酚、维生素系列中的一种或几种。为了保持统一的缓冲体系，作为一种优选的技术方案，所述试剂Rl和试剂R2中的缓冲液相同。作为一种优选的技术方案，所述校准品的缓冲液采用甘氨酸缓冲液。进一步优选的，本发明提供的试剂盒中，试剂Rl含有磷酸盐缓冲液10 500mM ;Triton X1000. 5 50g/L，牛血清蛋白
0.5 10g/L,氯化钠5 50g/L,乙二醇聚氧乙烯醚I 100g/L,叠氮钠I 10g/L,且pH为6 9 ;试剂R2含有磷酸盐缓冲液10 500mM，羊抗人载脂蛋白C3抗体5 50% (w/V),牛血清蛋白0. 5 10g/L,氯化钠5 50g/L,叠氮钠I 10g/L,且pH为6 9 ;校准品包括甘氨酸缓冲液10 500mM、载脂蛋白C3抗原、牛血清蛋白5 50g/L、叠氮钠I 10g/L、二丁基轻基甲苯0. 01 10g/L。上述羊抗人载脂蛋白C3抗体5 50%(w/v),也就是羊抗人载脂蛋白C3抗体的浓度为 150 300g/L。一种利用上述试剂盒进行检测载脂蛋白C3的方法，该方法包括如下步骤(I)向待测样品中加入试剂R1，解除样本中抗原周围电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，待测样品与试剂Rl按体积比为(I 10) :250，读取吸光度ODl ；(2)向步骤(I)的混合液中加入试剂R2，试剂R2与试剂Rl按体积比为1: (I 7)加入，读取吸光度0D2 ；(3)使用载脂蛋白C3校准品在全自动生化分析仪上通过内置曲线拟合模式拟合标准曲线，根据吸光度自动计算出待测样品中载脂蛋白C3的浓度。作为一种改进，试剂R2与试剂Rl体积比为1:1、1 :2、1 :3、1 :4、1 :5、1 :6或1:7。作为一种改进，所述曲线拟合模式包括Spline、二次方程、logit-log (3p)、logit-log (4p)、logit-log (5p)或 Polygonal 中的一种。由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:本发明提供的检测载脂蛋白C3的试剂盒及其检测方法可简洁快速地检测样本中脂蛋白C3的含量，使用简便快速；与进口对比试剂实验表明，本发明试剂具有较高的准确度和很好的特异性，能够满足临床快速高通量检测样本的要求，检测效率明显提高；同时抗体原料实现自制，降低了试剂成本，易于产业化；试剂盒由于使用了筛选的最优化试剂组合，使得试剂的稳定性大大提高，2-8° C可以稳定存放一年以上。因此在临床应用上具有广阔的前景。


图1为本发明检测载脂蛋白C3含量的检测方法流程示意图；图2为本发明载脂蛋白C3校准品的标准曲线。
具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例1试剂Rl:
磷酸盐(缓冲液)120 _
Triton X 100 (表面活性剂)5 g/L
氯化钠(电解质)8.5 g/L
乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促进剂) 50 g/L 牛血清蛋白(稳定剂)5 g/L
叠氮钠(防腐剂)4 g/L
pH 值7.0
试剂R2:羊抗人载脂蛋白C3抗体15% ( w/v )
磷酸盐(缓冲液)100 mM
牛血清蛋白(穗定剂)5 g/L
氯化钠(电解质)8.5 g/L
叠氮钠(防腐剂)5 g/L
pH 值7.5 才JC准品:
甘氨酸(缓冲液)30 HiM
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)5 g/L
叠氮钠(防腐剂)6 g/L
牛血清蛋白(稳定剂)5 g/L
二丁基羟基曱苯(抗氧化剂)1.5 g/L
载脂蛋白C3抗原相应量按照需要的校准品浓度将相应量的载脂蛋白C3抗原添加到上述校准品溶液中，制备得到载脂蛋白C3校准品。本实施例配制5个不同浓度的参考校准品，分别为:0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。然后用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放置2 8°C保存。使用日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。测定方法如图1所示。使用载脂蛋白C3校准品在全自动生化分析仪上通过内置logit-log (4p)曲线拟合模式拟合标准曲线，标准曲线如图2所示；向待测样品中加入试剂R1，样本与试剂Rl体积分别为6 μ L、210 μ L，37°C保温5分钟，读取吸光度ODl ;再向得到混合液中进一步加入试剂R2，试剂R2体积为70 μ L，37°C保温5分钟，读取吸光度0D2 ;根据吸光度自动计算出载脂蛋白C3的浓度。实施例2试剂Rl:磷酸盐(缓冲液)100 mM
Triton X 100 (表面活性剂)10 g/L
氯化钠(电解质)8.5 g/L
乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促进剂)50 g/L
牛血清蛋白(稳定剂)6 g/L
叠氮钠(防腐剂)5 g/L
pH 值7.5试剂R2:
羊抗人载脂蛋白C3抗体30% ( w/v )
磷酸盐(缓冲液)IOOmM
牛血清蛋白(稳定剂)6 g/L` 氯化钠(电解质)8.5 g/L
叠氮钠(防腐剂)5 g/L
pH 值8 0校准品:
甘氨酸(缓冲液)50 rnM
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)7 g/L
叠氮钠(防腐剂)5 g/L
牛血清蛋白(稳定剂)5 g/L
二丁基羟基曱苯(抗氧化剂)2 g/L
载脂蛋白C3抗原180 mg/L本实施例选用高浓度单点校准品，载脂蛋白C3抗原浓度为180mg/L，然后用
0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放置2 8°C保存。在使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的参考校准品，分别为:0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。使用日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。测定方法同实施例1。实施例3试剂Rl:甘氨酸(缓冲液)10 mM
聚氧乙晞壬基苯基醚(表面活性剂)0.5 g/L
疏酸镁(电解质)5 g/L
羟甲基纤维素钠(高分子促进剂)I g/L
牛血清蛋白(稳定剂)0.5 g/L
对羟基苯曱酸(防腐剂)I g/L
pH 值6.0试剂R2:
羊抗人载脂蛋白C3抗体5% (w/v )
甘氨酸(缓冲液)10 mM
牛血清蛋白(稳定剂)0.5 g/L
氯化钠(电解质)5 g/L
叠氮钠(防腐剂)I g/L
pH 值6 0校准品:
嶙酸盐(缓冲液)10 _
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)2g/L
叠氮钠(防腐剂)I g/L
牛血清蛋白(稳定剂)3g/L
二丁基羟基曱苯(抗氧化剂)0.01 g/L
载脂蛋白C3抗原相应量按照需要的校准品浓度将相应量的载脂蛋白C3抗原添加到上述校准品溶液中，制备得到载脂蛋白C3校准品。本实施例配制5个不同浓度的参考校准品，分别为:0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。然后用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放置2 8°C保存。

使用日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。测定方法同实施例1。实施例4试剂Rl:
权利要求
1.一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，其特征在于:含有试剂R1、试剂R2和载脂 蛋白C3校准品，其中， 试剂Rl含有:缓冲液10 500mM,表面活性剂0.5 50g/L,稳定剂0.5 10g/L,电解质5 50g/L,高分子促进剂1 100g/L,防腐剂1 10g/L, pH为6 9 ; 试剂R2含有:缓冲液10 500mM，抗人载脂蛋白C3抗体50 500g/L，稳定剂0.5 10g/L,电解质5 50g/L,防腐剂I 10g/L, pH为6 9 ; 校准品包括缓冲液10 500mM、载脂蛋白C3抗原、稳定剂5 50g/L、防腐剂1 10g/L、抗氧化剂0.01 10g/L。
2.如权利要求1所述的一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中， 所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO、MOPS、Hepes缓冲液中的一种或几种； 所述表面活性剂选自Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烧基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种； 所述稳定剂选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1，2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清蛋白中的一种或几种； 所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或几种； 所述高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠中的一种或几种； 所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种； 所述抗人载脂蛋白C3抗体选自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人或牛抗人载脂蛋白C3抗体中的一种； 所述抗氧化剂选自丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、磷脂、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、特丁基对苯二酚、维生素系列中的一种或几种。
3.如权利要求2所述的一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，其特征在于:所述试剂Rl和试剂R2中的缓冲液相同。
4.如权利要求2所述的一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，其特征在于:所述校准品的缓冲液采用甘氨酸缓冲液。
5.如权利要求1 4任一项所述的一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中， 试剂Rl含有:磷酸盐缓冲液10 500mM ;Triton X1000.5 50g/L，牛血清蛋白0.5 10g/L,氯化钠5 50g/L,乙二醇聚氧乙烯醚I 100g/L,叠氮钠I 10g/L,且pH为6 9 ； 试剂R2含有:磷酸盐缓冲液10 500mM，羊抗人载脂蛋白C3抗体50 500g/L，牛血清蛋白0.5 10g/L,氯化钠5 50g/L,叠氮钠I 10g/L,且pH为6 9 ; 校准品包括甘氨酸缓冲液10 500mM、载脂蛋白C3抗原、牛血清蛋白5 50g/L、叠氮钠I 10g/L、二丁基轻基甲苯0.01 10g/L。
6.一种利用如权利要求1所述的检测载脂蛋白C3的试剂盒进行检测载脂蛋白C3的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)向待测样品中加入试剂R1，解除样本中抗原周围电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，待测样品与试剂Rl按体积比为(1 10):250，读取吸光度ODl ； (2)向步骤(I)的混合液中加入试剂R2，试剂R2与试剂Rl按体积比为1: (1 7)加入，读取吸光度0D2 ； (3)使用载脂蛋白C3校准品在全自动生化分析仪上通过内置曲线拟合模式拟合标准曲线，根据吸光度自动计算出待测样品中载脂蛋白C3的浓度。
7.如权利要求6所述的一种检测载脂蛋白C3的方法，其特征在于:所述试剂R2与试剂 Rl 体积比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 或1:7。
8.如权利 要求6所述的一种检测载脂蛋白C3的方法，其特征在于:所述曲线拟合模式包括 Spline、二次方程、logit-log (3p)、logit-log (4p)、logit-log (5p)或 Polygonal中的一种。
全文摘要
一种检测载脂蛋白C3的试剂盒，包含试剂R1缓冲液、表面活性剂、稳定剂、电解质、高分子促进剂、防腐剂，pH为6～9；试剂R2缓冲液、抗人载脂蛋白C3抗体、稳定剂、电解质、防腐剂，pH为6～9；校准品缓冲液、载脂蛋白C3抗原、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂。以及利用该试剂盒检测载脂蛋白C3的方法。本发明操作简单、检测速度快、检测范围宽，能够满足临床快速高通量检测样本的要求，检测效率明显提高。
文档编号G01N33/68GK103076454SQ20121057492
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者宿明明, 王庆国, 王爱龙 申请人:潍坊三维生物工程集团有限公司