专利名称：宫颈癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体宫颈癌遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与宫颈癌密切相关的肿瘤蛋白基因(P53)、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)、谷胱甘肽硫 转移酶T1基因(GSTT1)、 5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、细胞周期依,赖性蛋白激酶抑制因子 1A基因(P21)、白细胞介素18基因(IL-18)上的单核苷酸多态性位点基因型来i—估个体宫颈癌遗传易感 性。
背景技术：
宫颈癌是指宫颈上皮的细胞不断异常分裂，造成上皮组织的异常增生，并逐渐发生癌变，形成位于子 宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。宫颈癌是�：ε越】档牡诙蟀┲ⅲ⒉〗鲈谌橄侔┲�。宫颈癌的高 发年龄段为35至39岁和60至64岁，20岁以前发病比较少见。但是现在随着女性生活习惯的改变，宫颈 癌有逐年上升和年轻化的趋势，特别是在城市女性人群中。
子宫颈是女性生殖系统中重要组织器官之一，它关系到女性的健康、家庭幸福、经济和社会问题，也 与性和生殖等关系十分密切。然而，子宫颈易受外来细菌、病毒侵袭，加上分娩、流产等造成的创伤，可 能发生多种疾病。另外由于宫颈上皮组织的特殊形态性改变，导致其易有炎症向恶性肿瘤转化的倾向。
宫颈癌以鳞状上皮细胞癌为主，约占90% 95%，腺癌仅占5% 10%。但两者在外观上并无特殊差 别，且均发生在宫颈阴道部或颈管内。宫颈癌最常见的症状为白带增多和阴道出血，白带可为米汤样或粉 红色，且有恶臭，但无外阴瘙痒不适症状；阴道出血常见于性交后、排便后或妇科检査后，绝经后出现阴 道流血更应注意；也有患者出现泌尿道症状(如尿急、尿频、排尿不畅)、下腹隐痛等。
P53失活被认为在许多恶性肿瘤产生中起重要作用。野生型P53基因在维持细胞正常生长，抑制肿瘤 细胞恶性增生过程中起着重要作用，当细胞受放射线或者某些药物作用致DNA损伤时，P53可以使细胞分 裂终止在不同分裂时期，如G1/S期，以便有足够的时间修复损伤，恢复正常状态。Arg72Pro是P53基因 第4号外显子处的一个G/C多态，引起该基因编码的第72位密码子由Arg变为Pro。该多态位点有三种基 因型GG(Arg/Arg)、 GC(Arg/Pro)、 CC (Pro/Pro)，其中GG(Arg/Arg)和GC(Arg/Pro)为宫颈癌的风险基 因型。P53基因第72位密码子遗传多态对P53蛋白生物学功能的影响目前尚不清楚。体外研究表明，在由 HPV的E6蛋白所介导的P53蛋白的降解方面，Arg/Arg基因型对应P53蛋白的降解速度比Pro/Pro基因型 对应P53蛋白快。.体内P53蛋白的减少，将会导致由P53调控的基因损伤修复、细胞分裂、细胞凋亡过程 出i见异常，让正常的细胞转化为肿瘤细胞。
GSTM1基因位于第1号染色体的lpl3. 3段，编码的谷胱甘肽硫转移酶M1是体内生物转化II相代谢酶 的重要组成成员之一，它通过直接结合于化学致癌物或通过与谷胱甘肽结合而发挥解毒功能。 Null/Present是GSTM1最常见的多态现象，纯合型缺失(Null)在人群中占到40%左右，该多态导致GSTM1 酶活性显著下降。该位点有三种基因型+/+、 +/-和--，分别代表无等位基因缺失、缺失一个等位基因、 缺失两个等位基因(完全缺失型)，其中完全缺失型(Null)与宫颈癌的发生有关'。'当GSTM1基因发生完 全缺失时，宫颈上皮细胞内无GSTM1表达，因此也无GSTM1的解毒活性，对环境毒素和致癌物质的敏感性 提高，在接触大量致癌物时，机体的解毒功能降低，这主要是由于该酶的缺失，使得致癌物不能转化为毒 性低、水溶性强的代谢产物而及时有效地排出体外。这些未排除体外的致癌物可能与机体内重要的抑癌基 因形成DNA加合物，导致DNA突变和染色体畸变，从而增加了包括宫颈癌在内的多种肿瘤的发生风险。
GSTT1是体内II相代谢中的重要转移酶，它通过直接结合于化学致癌物或通过与谷胱甘肽结合而发挥 解毒功能。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽物质，通过谷胱甘肽硫转移酶的作用，使 谷胱甘肽的半胱氨酸残基上具有很强亲和力的巯基基团与亲电子的靶物质(苯并芘、黄曲霉毒素Bl、亚硝 胺)结合，降低这些物质的毒性，使细胞免受损害。Null/Present是GSTT1常见的多态位点之一，该多态 导致GSTT1酶活性丧失，机体的解毒能力降低。该位点有三种基因型，+/+、 +/-、 -/-分别代表无等位基 因缺失/缺失一个等位基因/缺失两个等位基因(完全缺失型)，其中完全缺失型(_/-,即Null)与宫颈癌 的发病相关。当GSTT1基因发生完全缺失时，宫颈上皮细胞内无GSTT1表达，因此也无GSTT1的解毒活性，对环境毒素和致癌物质的敏感性提高，使得致癌物不能转化为毒性低、水溶性强的代谢产物而及时有效地 排除体外，因此致癌物质在体内积累，浓度增加。致癌物可能与机体内抑癌基因形成DNA加合物，导致DNA 突变和染色体畸变，从而增加包括宫颈癌在内的发生风险。
.MTHFR的主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢 叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接地为DNA甲基化和蛋白质甲 基化提供甲基，并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。MTHFR基因第5号外显子上的 一个C/T多态位点(C677T)突变，导致蛋白第222个氨基酸由Ala(A)变为Val(V)。该多态位点的基因型有 CC、 CT、 TT，其中CT， TT被确定为风险基因型，与宫颈癌的患病风险有关。研辨,表明，当携带风险基因 型，与CC基因型相比，MTHFR耐热性及酶活性降低，使5, 10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸的效 率下降，从而改变了DNA的甲基化水平，使基因表达及DNA结构发生改变，导致宫颈癌发生风险上升。
P21基因的多态性与宫颈癌的发病密切相关。P21基因编码的蛋白在P53介导的宫颈细胞周期Gl期阻 断中起着关键的作用。当DNA损伤时，P53表达增加，进而诱导P21表达。P21是宫颈细胞周期的负调节 因子，上升的P21水平可使宫颈细胞停留在G1期，等待DNA修复或进入细胞凋亡途径。这一机制有助于 防止DNA损伤的积累和细胞的恶性转化。因此，P21在宫颈癌的发生过程中起着重要的作用。Ser31Arg位 点是P21基因第31位密码子的多态位点，引起该位点编码的氨基酸由Ser转变为Arg，该多态位点有三种 基因型，Ser/Ser、 Ser/Arg、 Arg/Arg，其中Arg/Arg和Ser/Arg被确定为宫颈癌的风险基因型。Ser/Arg 是P21基因在编码区发现的唯一多态位点，它位于该基因高度保守区内，细胞周期依赖激酶(CDK)结合. 区的下游；如果此位点发生多态性改变，其原有的Gl期监控作用和结合增殖细胞核抗原(PCNA)、抑制细 胞增殖的功能可能丧失，使DNA受损的细胞得以通过G1期检测点，增殖为肿瘤细胞。
宫颈细胞IL-18表达量降低或功能被拮抗，细胞免疫功能受损，而免疫功能失调与HPV的感染及宫颈 上皮细胞的转化有关。作为一多功能的细胞因子，IL-18在抗肿瘤免疫和抗细胞内病原体如病毒感染方面 起重要作用。rsl9站S19位点是IL-18基因上的一个A/C多态，该位点有3种基因型，AA、 AC、 CC，其中 AC和CC基因型被确定为宫颈癌的风险基因型。当携带风险基因型时，IL-18蛋白功能异常，可能抗肿瘤 免疫和抗细胞内病原体能力下降，导致患宫颈癌风险上升。
发明内容
基于肿瘤蛋白基因(P53)、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)、谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)、 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A基因(P21)、白细胞介 素18基因(IL-18)上的6个SNP位点多态性可用来评估个体宫颈癌遗传易感性的基础上，本发明提供二 种检测个体宫颈癌遗传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括检测P53基因上Arg72Pro SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测GSTM1基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对； 检测GSTT1基因上SNP多态性基因型的电泳检测引物对；
检测MTHFR基因上C677T SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测P21基因上Ser31Arg SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测IL-18基因上rsl946519 SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去#子水等)； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用常规的探针合成 技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括 1.荧光定量PCR反应套装
10 X荧光定量PCR反应缓冲液4^1，
25mM dNTP混合液0.4^1,25rnM MgC12溶液2. 4^1，
5units/nl Taq DNA聚合酶0.
20幽特异性引物对每条引物各0.225^1,
IOMM特异性荧光探针对每条探针各0.25p1,
去离子水2i.3nl。 2.电泳检测套装
10X PCR反应缓冲液2.5fil，
25mM dNTP混合液0.2jxl，
25mM MgCl2溶液1. 5|il，
5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125^1,
20nM电泳检测引物对每条引物各0.25nl，
去离子水18. 675^1， 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。 '
实施例l.检测试'剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2:电泳检测分型
使用检测试剂盒中的电泳检测套装，反应的体系为总体积25^1,包含浓度为:12. 5ng/nl的DNA模板 lnl、 IOXPCR反应缓冲液2.5nl， 25mMdNTP混合液0.2nl， 25mMMgC12溶液1.5^1， 5units/nl Taq DNA 聚合酶0.125nl， 20nM电泳检测引物对每条引物各0.25^1，去离子水18.675^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94°C、 12分钟，进行30个循环的94'C、 30秒，6(TC、 30秒， 72。C、 30秒，然后进行72'C、 IO分钟。
然后初用电泳技术，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带数量。
步骤3:荧光定量PCR反应
使TO测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行4次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积10nl，包告浓度为20ng/jU的DNA模板2^1、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. 1^1 25mM dNTP 混合液、0.6^1 25raM MgCh溶液、0.025^1 (5unitsAd) Taq DNA聚合酶、20pM的有义引物和反义引物 各0. 225jil 、 10jiM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25^1 ，去离子水5. 325^1 。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行60个循环的95'C、 30秒， 60'C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉电泳检测技术的本领域技术人员能够通过辨识电泳图上DNA条带的位置和数量来确定所检测的 SNP位点的基因型。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检P试剂盒进行个体宫颈癌遗传易感性检测的服务
5步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的GSTM1基因和GSTT1基因上的SNP位点进行PCR 扩增和电泳检测，对P53基因上Arg72Pro SNP位点、MTHFR基因上C677T SNP位点P21基因上Ser31Arg SNP. 位点、IL-18基因上rs1946519 SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定这6个SNP位点的基因型。
步骤3:个体宫颈癌遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体宫颈癌遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被 检测者宫颈癌遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体宫颈癌遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体宫颈癌遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测肿瘤蛋白基因(P53)上Arg72Pro SNP位点、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)上SNP位点、谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)上SNP位点、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上C677T SNP位点、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A基因(P21)上Ser31Arg SNP位点、白细胞介素18基因(IL-18)上rs1946519 SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括1) 荧光定量PCR反应套装10X荧光定量PCR反应缓冲液4W，25mMdNTP混合液0. , 25mM MgC12 溶液2.化1， 5unitsA4 Taq DNA聚合酶0.01W, 20幽特异性引物对每条引物各0.225W, IOMM特异性 荧光探针对每条探针各0.25W,去离子水21.3W。2) PCR反应套装10X PCR反应缓冲液2. 5W, 25mM dNTP混合液0. 2W， 25raM MgC12溶液1. 5W，. 5units/W Taq DNA聚合酶0. 125Hl， 20MM特异性引物对每条引物各0.25W，去离子水18. 675W。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC。
全文摘要
本发明公开了一种检测宫颈癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测肿瘤蛋白基因(P53)、谷胱甘肽硫转移酶M1基因(GSTM1)、谷胱甘肽硫转移酶T1基因(GSTT1)、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A基因(P21)、白细胞介素18基因(IL-18)的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与宫颈癌遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体宫颈癌遗传风险。
文档编号G01N21/64GK101608228SQ200810039270
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司
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