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专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速诊断试纸条，属于一种新的动物诊断试剂，主要用于诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的动物；应用于畜牧兽医学领域。
背景技术：
ItMMi^Bf ^^-π Π: (Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS) 由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起，主要特征为怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪的呼吸道疾病。PRRS是上世纪80年代后期暴发的一种新的传染性疾病，于1987年首发于北美地区，在随后的几年内，便迅速地在欧、美大陆的许多国家流行，随后又蔓延至亚洲的一些国家，成世界范围内的大流行，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。我国自1995年底暴发此病，并迅速传播至全国各地，成为我国规模化养猪场引发繁殖障碍的主要疫病之一。近年来PRRS呈持续性感染，并导致继发性感染增加，严重威胁了养猪业的发展。
目前猪繁殖与呼吸综合征病毒病检测主要采用的技术方法有ELISA、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、免疫荧光技术、荧光RT-PCR、环介导逆转录等温检测(RT-LAMP)、基因芯片以及病毒的分离鉴定等。比较快速准确的技术是ELISA和荧光 RT-PCR，但这2种技术都需要特殊的仪器设备，并且检测时间都在2小时以上，检测成本昂贵，不便于适时和快速诊断。这些限制了猪繁殖与呼吸综合征病毒病的预防控制，因此研制出一种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。发明内容
发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法，该方法是利用基因工程表达猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白，利用免疫学抗原抗体能特异性结合原理，胶体金标记抗原与抗体结合，快速检测猪血液或血清中与病毒复制相关抗体；该测试纸条可广泛用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测；与其他病毒无交叉反应，与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为95. 3%和93. 12%。与ELISA 相比，重组抗原免疫胶体金具有明显的优势安全性好，无需培养病毒本身，避免了因操作病毒造成的病毒扩散；可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉；抗原成分稳定均一， 操作简便省力，不用仪器，检测结果特异性高，重复性好。整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。
本发明的技术方案是这样实现的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫(1)、结合垫O)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4) 依次粘附在不吸水的支撑薄片( 上；其中结合垫( 上包被有胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9重组蛋白；硝酸纤维素膜(3)上分别包被SPA构成的检测线T线(6)和抗Nsp9蛋白单克隆抗体IgG构成的质控线C线(7)。
所述的结合垫(2)上包被的胶体金标记的猪繁殖与呼吸病毒Nsp9蛋白的制备方法如下(1)首先利用基因工程菌原核表达Nsp9蛋白，所制备抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白，且为病毒特有蛋白，这就决定了试纸条的特异性；
(2)将纯化的PRRSV Nsp9蛋白制备金标抗原，用0. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2， 按IOOug /毫升胶体金加入Nsp9蛋白，磁力搅拌器混勻30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置1小时。40C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4°C备用。(3)将结合垫浸泡于封闭液即2% BSA、0. 5%吐温-20、2. 5%蔗糖、0. 05%叠氮钠、 0. OlM PBS中30分钟，37°C烘干；然后将制备好的金标抗原均勻喷涂于结合垫上，每毫升铺 20平方厘米，冻干、保存。所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的检测线T线(6) 是选用一种能够与IgG分子Fc片段特异性结合的蛋白(SPA)喷涂于检测线上，用包被缓冲液将SPA稀释到50ug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫一端约 5mm ο所述的PRRSV Nsp9单抗2D6 (IgG1)构成的质控线C线(7)是以I3RRSV Nsp9蛋白作为抗原，免疫小鼠，利用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9单克隆抗体，得到细胞株2D6，并获得纯化的抗体，用包被缓冲液将单抗稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm;两线距离5-8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上， 可与金标抗原结合，以此检验试纸条的有效性。所述的试纸条的检测方法是样品血清中抗PRRSV Nsp9抗体先和胶体金标记的 Nsp9抗原结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有PRRSV抗体， 到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素膜上的SPA，就会形成金标抗原-抗体-SPA复合物，从而凝集在检测线上，形成特异性的红色沉淀线，没有和抗体结合的金标抗原则会直接通过检测线，富集在质控线上形成红色沉淀线，即判为阳性结果，若样品中无PRRSV Nsp9抗体， 反应复合物到达检测线时遇到SPA就不会形成复合物，反应复合物通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀，即判为阴性结果。本发明的优点是
1、具有生物安全性，其所使用的金标抗原为基因工程菌表达的重组病毒蛋白，不含猪繁殖与呼吸综合征病毒，因此不存在散毒的危险。2、特异性强，胶体金试纸条金标抗原能够特异性的与PRRSV Nsp9抗体结合，检测线上的SPA能够与IgG分子Fc片段特异性结合，为捕获抗原，二者提高了检测的敏感性和特异性。3、其可快速检测即10-15分钟；不需特殊仪器设备，可用于现场操作；操作简单， 一步完成，无需专业人员操作；检测成本低；储存方便。


图1为本发明所涉及的PRRSV重组蛋白。图2为本发明试纸条的结构模式图。图3为本发明试纸条结果判定示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1表达猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白制备l、Nsp9基因7817 - 8657nt的扩增参照PRRSV BJ-4序列，设计并合成1对引物，扩增Nsp9基因的部分片段(7817 - 8657nt)。
上游引物下划线为HindIII序列，下游引物下划线为BioI序列；PCR反应条件为，94°C 热启动5分钟，94°C变性60秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，最后72°C延伸10分钟， 扩增产物为840bp，经琼脂糖电泳；1. 2Nsp9基因片段在pMD-18T中的克隆将扩增产物利用胶回收试剂盒回收，利用T-A原理，与PMD-18T载体连接，转化DH5ci感受态大肠杆菌，涂布于氨苄青霉素的LB片板，12小时后挑取典型白色单菌落培养，提质粒DNA。通过HindIII和XhoI双酶切鉴定，命名为pMD-Nsp9 ;1. 3Nsp9基因在pET_28a中的克隆原核表达载体pET-28a是上游带有His标签的高效表达载体，用HindIII和BioI双酶切重组质粒pMD-Nsp9,插入片段840bp,回收其中840bp,用HindIII和XhoI双酶切ρΕΤ48ει， 与带有相同粘端的Nsp9基因判断连接，转化大肠杆菌BL21感受态菌，卡娜青霉素抗性筛选，挑取单菌落少量培养基过夜培养，小提质粒DNA，通过限制性内切酶鉴定重组质粒， 得到重组克隆命名为pET-28a-Nsp9。
2、pET-28a-Nsp9的诱导表达将含有重组质粒的新鲜大肠杆菌(BL-21)单菌落在 LB培养基中37°C振荡培养过夜，次日按体积比转接5ml新鲜培养基，37°C继续培养， 当菌液0D600值达0. 6-0. 8时，加入无菌IPTG溶液，使其终浓度为lmmol/L。诱导3_4小时后停止培养，取Iml离心收集菌体，PBS (pH7. 4)洗涤，用50 μ 1 PBS悬浮菌体，与10 μ 1 5XSDS上样缓冲液混合，煮沸变性5分钟。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)， 分离胶的丙烯酰胺浓度为12%，将只含载体的大肠杆菌同样诱导做为阴性对照，0. 25%考马斯亮兰染色；经鉴定后，大量摇菌，离心沉淀菌体，超声破碎后经电洗脱得到高纯度的重组蛋白，于-80°C保存备用。
实施例2抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体的制备1、动物免疫选择6-8周龄健康Balb/C小鼠以弗氏完全佐剂乳化纯化的PRRSV Nsp9 蛋白，每只小鼠腹腔注射IOOyg左右，14d后以弗氏不完全佐剂乳化蛋白腹腔注射 100 μ g,最后一次加强免疫时，直接腹腔注射100 μ g纯化的蛋白，融合前3 4d尾静脉注射50 μ g纯化的蛋白。
2、细胞融合取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0混合于融合管内，以300g离心10 min,弃去上清，振荡细胞，使两种细胞尽量混合均勻，然后60s内缓慢滴加预热的 PEG-4000溶液，再缓慢加入无血清的1640培养基终止融合，静置后再以1 000 r/min离心10 min，弃去上清后加入HAT培养基，使细胞悬浮并混勻，于96孔培养板中培养，第14d开始换液并开始检测筛选
3、杂交瘤细胞的筛选和克隆化克隆的筛选采用间接ELISA，用纯化的PRRSV Nsp9蛋白作为包被抗原。对所获阳性杂交瘤细胞的培养上清进行筛选；将ELISA筛选的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，将检出的阳性孔再次克隆和亚克隆，直到所有的孔都为阳性。通过三次细胞克隆最终获得杂交瘤细胞株2D6，抗体亚型为IgGl。4、抗体的纯化将得到的细胞株注射到Balb/C小鼠腹腔内，一周后收取腹水，用 IgG纯化柱子纯化得到的单克隆抗体。实施例3金标抗原的制备
1、胶体金颗粒制备将氯化金配制成0.01%水溶液，取IOOml煮沸2min后，边搅拌边加入柠檬酸三钠2ml，煮沸至溶液颜色变成酒红色后，继续煮沸至适宜浓度0D535 = 0.9312，冷却后加入双蒸馏水恢复到原体积，置4°C保存；
2、将待标记PRRSVNsp9蛋白倍比稀释，分别取100 μ 1加入Iml胶体金中，IOmin后加入10% NaCl 100 μ L, 4°C静止lh。取胶体金颜色没有发生改变的最高稀释倍数为准，按测得的最小蛋白浓度的比例将纯化的PRRSV Nsp9蛋白加至pH 8. 0的胶体金溶液中，边加边搅拌，室温静置30 min;加入10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在溶液中的终浓度为1 %，室温静置15 min;4°C、8 778Xg离心30 min，吸去上清，用重悬液I (含BSA等)悬浮至原体积，4°C、8 778 Xg离心30 min，去上清，沉淀用重悬液II (含蔗糖、BSA、吐温-20等)1/5 体积悬起，4°C保存备用。实施例4免疫血清的制备
收集单抗制备时免疫小鼠血清作为抗PRRSV Nsp9高免血清，于-80°C保存备用。实施例5 SPA的获得
葡萄球菌蛋白A(SPA)购置于sigma公司，将SPA配成50ug/ml，保存备用。实施例6试纸条的研制
1、试纸条的组成用喷膜机将胶体金标记蛋白复合物喷涂在胶体金结合垫上，将SPA蛋白和抗PRRSV Nsp9蛋白单抗2D6间隔4mm喷在硝酸纤维膜NCM上，分别作为检测带和质控带，将包被好的NCM放入含3% BSA的PBS中，过夜，封闭其余蛋白结合位点，倒掉封闭液，用PBS，洗2次，每次5min，37°C干燥Ih备用，将硝酸纤维膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫等一次粘在PVC板上，S卩，将玻璃纤维连接在NCM上，边缘并附着在NCM上；棉浆垫附着在玻璃纤维上，与NCM衔接；吸水滤纸板连接在NCM下端，边缘并附着在NCM上， 将粘好的PVC材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即制成猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金抗体快速检测试纸条，将试纸条密封于铝箔袋中，4°C保存；
2、所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有SPA构成的检测线T线(6)是选用基因工程菌表达的重组金黄色葡萄球菌蛋白A，将其喷涂于检测线上，用包被缓冲液将SPA稀释到 20-50ug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫端约5mm。3、所述的小鼠抗PRRSV Nsp9单抗IgG构成的质控线C线(7)是以杂交瘤技术获得的针对PRRSV Nsp9单个表位的细胞株分泌的抗体，用包被缓冲液将其稀释到50-100ug/ ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm ；两线距离5_8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上，可与金标抗抗原结合，以此检验试纸条的有效性。4、所述该纸条的检测方法是样品血清中抗猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9抗体先和胶体金标记的Nsp9蛋白结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有相应抗体，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素膜上的SPA，就会形成金标抗原-Nsp9 抗体-SPA复合物，从而凝集在检测线上，形成特异性的红色沉淀线；没有和抗体结合的金标抗原则会直接通过检测线，富集在质控线上形成红色沉淀线，即判为阳性结果。若样品中无猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9抗体，样品到达检测线时遇到SPA就不会形成金标抗原_Nsp9抗体-SPA复合物，不会形成红色沉淀线，而只富集在质控线上，形成红色沉淀，即判为阴性结果。
实施例7胶体金试纸条的应用 1、本发明试纸条的使用方法(1)样品制备临床采集待检动物血清用于检测。
(2)检测取出试纸条，室温平衡20分钟，将待检血清滴入试纸条检测窗口中，取出，平放，静置10-15分钟，判定结果。
(3)结果判定当时纸条只出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫红色检测线，判为阴性，记为“一”；当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，同时出现肉眼可见的紫红色检测线，判为阳性，记为“ + ” ；检测线颜色深度与待检抗体水平成正比，颜色越深说明待检血清滴度越高，质控线无条带则判为试纸条失效。
实施例8试纸条敏感性特异性测定 1、试纸条的敏感性试验将PRRSV Nsp9蛋白免疫的小鼠血清作为检测阳性血清，用于试纸条敏感性检测试验， 将阳性血清滴度稀释到2560倍，用试纸条进行检测，结果当稀释度为160倍以上时试纸条检测为阴性，稀释度为80倍以下时试纸条检测为阳性，结果见表权利要求
1.一种猪繁殖与呼吸综合征毒病抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)依次粘附在不吸水的支撑薄片(5) 上；其中结合垫(2)上包被有胶体金标记的重组PRRSV Nsp9蛋白；硝酸纤维素膜(3)上分别包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的检测线T线(6)和PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体 ZDe(IgG1)构成的质控线C线(J)。
2.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与和呼吸综合征病毒病抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所述的结合垫(2)上包被的胶体金标记的PRRSV Nsp9蛋白制备方法如下(A)首先制备PRRSVNsp9抗原，利用基因克隆技术从PRRSV基因组中克隆出Nsp9基因片段，将其连到pET-28a中，构成pET-28a-Nsp9载体，将载体转化到大肠杆菌BL-21中， 表达Nsp9蛋白，并将其纯化，-80°C保存备用，PRRSV Nsp9蛋白只与抗Nsp9抗体结合，这就决定了试纸条的特异性；(B)选用纯化发的PRRSVNsp9蛋白标记胶体金，制备金标抗抗原，用0. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2，按IOOug抗原/毫升胶体金加入Nsp9蛋白，磁力搅拌器混勻30分钟， 加BSA至终浓度为1%，静置1小时，4°C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4°C备用；(C)将结合垫浸泡于封闭液即2%BSA、0. 5%吐温-20,2. 5%蔗糖、0. 05%叠氮钠、0. OlM PBS中30分钟，37°C烘干；然后将制备好的金标抗体均勻喷涂于结合垫上，每毫升铺20平方厘米，冻干、保存。
3.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合症毒病抗体胶体金快速诊断试纸条， 其特征在于所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有葡萄球菌蛋白A (SPA)构成的检测线T线(6) 是选用一种能够与IgG分子Fc片段特异性结合的蛋白(SPA)喷涂于检测线上，用包被缓冲液将SPA稀释到50ug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫一端约 5mm ο
4.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征毒病抗体胶体金快速诊断试纸条， 其特征在于所述的PRRSV Nsp9单抗ZDe(IgG1)构成的质控线C线(7)是以PRRSV Nsp9蛋白作为抗原，免疫小鼠，利用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9单克隆抗体，得到细胞株2D6， 并获得纯化的抗体，用包被缓冲液将单抗稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm ；两线距离5-8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上，可与金标抗原结合，以此检验试纸条的有效性。
5.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体病胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所述的试纸条的检测方法是样品血清中抗PRRSV Nsp9抗体先和胶体金标记的Nsp9抗原结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有PRRSV抗体，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素膜上的SPA，就会形成金标抗原_抗体-SPA复合物，从而凝集在检测线上， 形成特异性的红色沉淀线，没有和抗体结合的金标抗原则会直接通过检测线，富集在质控线上形成红色沉淀线，即判为阳性结果，若样品中无PRRSV Nsp9抗体，反应复合物到达检测线时遇到SPA就不会形成复合物，反应复合物通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀，即判为阴性结果。
全文摘要
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征毒病抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的PRRSVNsp9蛋白；硝酸纤维素膜上分别包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的检测线T线和PRRSVNsp9单克隆抗体2D6构成的质控线C线。其利用免疫学抗原抗体能特异性结合原理，胶体金标记抗原与相应抗体结合，这种抗原抗体结合物再与葡萄球菌蛋白A(SPA)结合，形成抗原-抗体-SPA结合物在硝酸纤维素膜(NC膜)上出现颜色反应，可以肉眼观察；具有简单、快速、敏感和特异性好等特点。并且价格低廉，适用于基层或临床检测猪繁殖与呼吸综合征毒病抗体。具有特异性强、灵敏度高、操作简单和诊断快速的显著优点，可用于猪繁殖与呼吸综合征毒病的快速诊断。
文档编号G01N33/531GK102495216SQ201110423389
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者丁壮, 张晓东, 杨建新, 母连志, 郭育培, 黄志强 申请人:吉林大学