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一种利用离子液胶束提取和检测山楂中活性成分的方法
【专利摘要】本发明公开了利用离子液胶束提取和检测山楂中活性成分的方法，利用长链离子液的胶束体系同时提取山楂中水溶性成分和脂溶性成分，并且用快速液相-四级杆/飞行时间质谱作为检测器检测，跟对照品的标准曲线对比得到山楂中各成分的含量。本发明所用方法提取效率高，可以更为全面地提取山楂中的活性成分，能够更为快速灵敏地检测山楂中的活性成分。
【专利说明】一种利用离子液胶束提取和检测山楂中活性成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中药提取和质量检测方法，具体地涉及由离子液胶束提取山楂中水溶性成分和脂溶性成分，并应用快速液相-四级杆/飞行时间质谱作为一种检测手段的质量检测方法，属于天然药物提取制备领域。
【背景技术】
[0002]传统的中药提取方法包括溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法、压榨法，每种方法都有其一定的优越性，但仍有需要改进的地方。在上述提取方法中，溶剂提取法是最为常见、最简便易行的方法。
[0003]所谓溶剂提取法，就是依靠中药中的各类有效成分在不同溶剂中的溶解度不同而进行分离。若选择的溶剂对药物的活性成分溶解度较大且对杂质成分溶解度较小，则可将药物中的有效成分提取出来。常见的溶剂可以分成三种:水、水溶性有机溶剂、脂溶性有机溶剂。中药中所包含的活性成分亦可分为水溶性成分和脂溶性成分。
[0004]山楂为蔷薇科山楂属植物，落叶稀半常绿灌木或小乔木。根据中药记载，山楂性温，味酸、甘，归脾、胃、肝经，具有活血化瘀、消食化积之功效。临床主要将其干燥果实用于小儿乳积、食积、妇女产 后瘀阻腹痛、胸痹、疝气、小儿痘疹、心痛、便血、吐血等。近年来，山楂还在抗菌消炎以及治疗心血管疾病领域有广泛的应用。
[0005]对山楂化学成分的研究始于1921年，20世纪50年代以前的研究内容，主要集中在鞣质、纤维素、三萜类等成分，50年代以后，黄酮类化合物迅速发展，人们发现山楂中含有的黄酮类成分对心血管系统的药理作用非常明显，于是研究重点转向黄酮类成分。截至目前，从山楂(果肉、核及叶)中发现且分离得到的物质有150多种，其中主要有黄酮类、有机酸类、低聚黄烷类，另外还含有三萜类、有机胺类和留体类等。
[0006]基于上述背景，能有效提取山楂中各类活性成分将有助于对山楂分析研究工作的开展。目前，较多文献已有报导对山楂中活性成分的分析测定，但对于山楂样品前处理及其后续质量检测这一方面，文献报道较少且形式较为单一，基本是以水或者甲醇等有机溶剂作为提取溶剂，加入山楂样品中超声提取。鉴于山楂提取物中同时含有水溶性成分和脂溶性成分，甲醇等亲水性有机溶剂虽然同时对脂溶性成分和水溶性成分有较好的提取效果，但考虑到有机溶剂对人体以及环境的危害和影响，在提倡可持续发展和环境友好的今天，寻找一种对人体低毒、对环境污染小、提取效率高、同时兼顾脂溶性成分和水溶性成分的提取方法显得尤为重要，而现有技术中，考虑到这种低毒对环境污染问题，人们通常想到的是用水作为提取溶剂，然而用水作为溶剂时，对脂溶性成分的提取效果就相对欠佳。在应用离子液对山楂进行前处理提取时，虽有文献报道但是属于短链离子液，提取的成分有限，效果欠佳。目前文献报道的山楂检测方法常见有液相-紫外、液相-电化学等，所用液相色谱均为常规液相，分析时间较长，灵敏度低，且检测方法中并未涉及利用快速液相-四级杆/飞行时间质谱作为检测方法。
【发明内容】

[0007]本发明提供了一种以长链离子液形成胶束，作为提取溶剂，用于提取山楂中活性成分，并且应用快速液相-四级杆/飞行时间质谱作为检测手段的一种中药质量检测方法。
[0008]本发明采用的技术方案是:
[0009]一种利用离子液胶束提取和检测山楂中活性成分的方法，所述方法为:取山楂干品、粉碎、过一号筛、除杂，得到山楂粉末；取蒸馏水加入长链离子液体，使长链离子液体的浓度为100~250mmol/L，称定溶液重量为M，充分混匀(可利用超声混匀)使离子溶液透明澄清，称重量，加水补足至重量M，加入山楂粉末，使山楂粉末的质量浓度为20~30mg/mL，所得混合液用超声处理40~80分钟，所得提取液再称重量，加水补足至重量M，然后离心，取上清液作为样液进样，用液质联用仪(HPLC-Q-T0F/MS )检测，得到样液的总离子流色谱图和各成分的提取离子色谱图；以原儿茶酸的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照样液同样条件用液质联用仪检测，获得原儿茶酸对照品的提取离子色谱图，以原儿茶酸对照品溶液的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积为横坐标，以原儿茶酸对照品的进样量为纵坐标制作原儿茶酸标准曲线，按同样方法制作绿原酸标准曲线、表儿茶酸标准曲线、金丝桃苷标准曲线、异槲皮苷标准曲线 、槲皮素标准曲线；根据样液的各成分的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算样液中原儿茶酸、绿原酸、表儿茶酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量，换算得到山楂中各成分的含量。
[0010]所述长链离子液为1-十二烷基-3-甲基咪唑盐，所述的盐可以是有机酸盐，也可以是无机酸盐，优选地，所述1-十二烷基-3-甲基咪唑盐为溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-十二烷基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑硝酸盐或1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐。更为优选地，所述的长链离子液为体氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。
[0011]所述长链离子液体的浓度优选为150mmol/L。
[0012]所述山楂粉末的质量浓度优选为25mg/mL。
[0013]所述超声处理的时间优选为40分钟。
[0014]所述超声的条件优选为40k Hz、功率100~200W。
[0015]所述离心优选I3OOOrpm,离心5min。
[0016]较为具体的，所述方法优选按以下步骤进行:取山楂干品、粉碎、过一号筛、除杂，得到山楂粉末；取蒸馏水加入长链离子液体，使长链离子液体的浓度为150mmol/L，称定溶液重量为M，超声混匀至透明澄清，称重量，加水补足至重量M，加入山楂粉末，使山楂粉末的质量浓度为25mg/mL，所得混合液用超声处理40分钟，所得提取液再称重量，加水补足至重量M，然后离心，取上清液作为样液进样，用液质联用仪检测，得到样液的总离子流色谱图和各成分的提取离子色谱图；以原儿茶酸的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照样液同样条件用液质联用仪检测，获得原儿茶酸对照品的提取离子色谱图，以原儿茶酸对照品溶液的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积为横坐标，以原儿茶酸对照品的进样量为纵坐标制作原儿茶酸标准曲线，按同样方法制作绿原酸标准曲线、表儿茶酸标准曲线、金丝桃苷标准曲线、异槲皮苷标准曲线、槲皮素标准曲线；根据样液的各成分的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算样液中原儿茶酸、绿原酸、表儿茶酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量，换算得到山楂中各成分的含量。[0017] 所述液质联用仪上的检测条件通常为:
[0018]色谱柱:AgilentSB-C18 柱(1.8 μ m，4.6 X 50mm)，左右柱温:40 °C，流速:0.4mL/min ;流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；进样量0.2uL ;梯度洗脱:0-2.5min:10-15v%B ；2.5-3.0min:15-15v% 流动相 B ；3.0-6.0min:15_40v%流动相 B ；6.0-8.0min:40-100v% 流动相 B ；8.0-12.0min: 100-100v% 流动相 B ;12.0-13.0min: 100-10v% 流动相 B。
[0019]质谱条件:电喷雾电离；负离子模式；全扫描模式监测(TIC);干燥气温度:350°C ；干燥气流量:12L/min ;喷雾器压力:45Psig;碰撞电压:175V;电离电压:3.5KV ;碰撞能:15V;质量数扫描范围:100-1100m/z。
[0020]本发明中，在用长链离子液作为提取溶剂提取山楂活性成分时，同时对比了以水及甲醇作为提取溶剂的提取效果对比，结果表明，长链离子液提取剂在提取山楂或活性成分时，与水作为提取剂相比，起主要作用的活性成分金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素等黄酮类成分，提取效果要明显强于水，与甲醇提取效果相当，长链离子液中，尤其是氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑，对山楂中水溶性和脂溶性成分都有较好的提取作用，优于甲醇或水作为提取溶剂。该提取体系具备一系列优异突出的特性:对人体无毒、不污染环境；热稳定性和化学稳定性良好，不易燃，操作环境安全可靠。
[0021]本发明的优点在于:
[0022]提供了一套新颖的山楂质量检测方法，借助离子液胶束体系用于样品前处理的提取环节，借助高分辨的快速液相-四级杆/飞行时间质谱作为检测器用于质量检测的分析环节，灵敏度高，效果显著。
[0023]本发明采用了新型绿色提取体系一离子液胶束表面活性剂体系，长链离子液提取剂在提取山楂或活性成分时，与水作为提取剂相比，起主要作用的活性成分金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素等黄酮类成分，提取效果要明显强于水，与甲醇提取效果相当，长链离子液中，尤其是氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑，对山楂中水溶性和脂溶性成分都有较好的提取作用，优于甲醇或水作为提取溶剂。该提取体系具备一系列优异突出的特性:对人体无毒、不污染环境；热稳定性和化学稳定性良好，不易燃，操作环境安全可靠。
[0024]本发明提供的长链离子液表面活性剂体系同时提取山楂中水溶性成分和脂溶性成分的方法，既克服了传统提取方法利用水作为提取剂的不能同时提取水溶性成分和脂溶性成分的缺点，也避免了传统提取方法利用甲醇作为提取剂对人体的毒害以及环境的污染。本发明具有提取效率高、操作环境安全，操作步骤简单等优点。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1本发明利用离子液胶束提取检测山楂中活性成分的工艺流程示意图。
[0026]图2为水、甲醇、长链离子液提取效果柱状图，其中图中的字母A-E代表不同的离子液，F代表水、G代表甲醇；数字1-6代表山楂中不同的活性成分，分别为:
[0027]A:溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑
[0028]B:1-十二烷基-3-甲基咪唑甲磺酸盐
[0029]C:1-十二烷基-3-甲基咪唑硝酸盐
[0030]D: 1-十二烷基-3-甲基咪唑硫氢酸盐[0031]E:氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑
[0032]1:原儿茶酸
[0033]2:绿原酸
[0034]3:表儿茶酸
[0035]4:金丝桃苷
[0036]5:异槲皮苷
[0037]6:槲皮素
[0038]图3为甲醇提取的总离子流色谱图(以下简称TIC)图。
[0039]图4为甲醇提取的原儿茶酸的提取离子色谱图(以下简称EIC)图。
[0040]图5为甲醇提取的绿原酸EIC图。
[0041]图6为甲醇提取的表儿茶酸EIC图。
[0042]图7为甲醇提取的金丝桃苷和异槲皮苷EIC图。
[0043]图8为甲醇提取的槲皮素EIC图。
[0044]图9为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液提取的TIC图。
[0045]图10为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液提取的原儿茶酸EIC图。
[0046]图11为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液提取的绿原酸EIC图。
[0047]图12为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液提取的表儿茶酸EIC图。
[0048]图13为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液提取的金丝桃苷和异槲皮苷EIC图，
[0049]图14为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液提取的槲皮素EIC图。
[0050]图3~14中不同的色谱峰所标注的1-6数字代表山楂中不同的活性成分，分别为:
[0051]1:原儿茶酸
[0052]2:绿原酸
[0053]3:表儿茶酸
[0054]4:金丝桃苷
[0055]5:异槲皮苷
[0056]6:槲皮素
【具体实施方式】
[0057]通过以下实例来对本发明进行更为详细的描述。所述的提取分离工艺流程和萃取剂制备方法仅仅是为了更好地说明本发明，但不意味着对本发明的限制，本领域的技术人员根据本发明所公开的信息，可以做出多种变更替换，如在提取时间、提取剂的浓度、提取剂与药材的比例、温度等方面。
[0058]以下实施例中的制备离子液溶液时采用静置、搅拌或超声法将各组分混合均匀即可。实施中未注明具体条件和步骤的粉碎、分离、过滤、超声振荡等方法均为本领域普通技术人员熟知的技术。
[0059]实施实例:
[0060]实施例1不同提取溶剂对山楂活性成分的提取效果
[0061]1.将山楂药材粉末粉碎,并用一号筛过筛；[0062]2.平行称取7份相同质量山楂粉末，每份0.5000g。
[0063]3.平行称取5份不同种类的离子液加入到5个规格均为50mL的锥形瓶并编号3、4、5、6、7，其中3号瓶中加入溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑0.9940g、4号瓶中加入1-十二烷基-3-甲基咪唑甲磺酸盐1.0396g、5号瓶中加入1-十二烷基_3_甲基咪唑硝酸盐0.9403g、6号瓶中加入1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐1.0455g、7号瓶中加入氯化
1-十二烷基-3-甲基咪唑0.8606g，并统一加入体积均为20mL的水，称定重量，置于超声仪中混合，再称定重量，用水补足减失的重量，配制成浓度均为150mmol/L的离子液溶液。另取2个规格均为50mL的锥形瓶编号1、2，分别加入20mL的纯水和20mL的纯甲醇。
[0064]4.往1-7号锥形瓶中加入先前称取的山楂粉末,称定重量后,置于超声仪中超声萃取。超声的条件为40k Hz，功率100W。
[0065]5.1-7号瓶均在超声40min后，再称定重量，1-6号瓶用水补足与超声前相比减失的重量，7号瓶用甲醇补足减失的重量，取出。
[0066]6.分别从1-7号锥形瓶中吸取1000 μ L的提取液加入规格为1.5mL的离心管中，编号对应为1-7。
[0067]7.将1-7号离心管置于离心仪中离心。 [0068]8.分别取1-7号离心管中的上层清液于自动进样器的进样瓶中，进样瓶对应编号为 1-7。
[0069]9.1-7号进样瓶放入液质联用仪中进样分析，进样量均为0.2μ L。
[0070]液质联用仪型号为安捷伦1290超高效液相色谱-G6530四级杆-飞行时间质谱联用仪。，检测条件为
[0071]色谱柱:AgilentSB-C18 柱(1.8 μ m, 4.6 X 50mm),左右柱温:40 °C,流速:0.4mL/min ;流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；进样量0.2uL。梯度洗脱:0-2.5min:10-15ν%Β ;2.5-3.0min:15-15v% 流动相 B ;3.0-6.0min:15_40v%流动相 B ；6.0-8.0min:40-100v% 流动相 B ；8.0-12.0min: 100-100v% 流动相 B ;12.0-13.0min: 100-10v% 流动相 B
[0072]质谱条件:电喷雾电离；负离子模式；全扫描模式监测(TIC);干燥气温度:350°C ；干燥气流量:12L/min ;喷雾器压力:45Psig;碰撞电压:175V;电离电压:3.5KV ;碰撞能:15V;质量数扫描范围:100-1100m/z。
[0073]甲醇提取的总离子流色谱(TIC)图见图3，甲醇提取的不同成分的提取离子色谱图(EIC)图分别见图4~8。氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液提取的TIC图见图9，氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液提取的不同成分的EIC图分别见图10~14。
[0074]实验结果如表1、表2所示:
[0075]表1水和甲醇的提取效率(表中数据为峰面积)
【权利要求】
1.一种利用离子液胶束提取和检测山楂中活性成分的方法，其特征在于所述方法为:取山楂干品、粉碎、过一号筛、除杂，得到山楂粉末；取蒸馏水加入长链离子液体，使长链离子液体的浓度为100~250mmol/L，称定溶液重量为M,充分混匀使离子溶液透明澄清，称重量，加水补足至重量M，加入山楂粉末，使山楂粉末的质量浓度为20~30mg/mL，所得混合液用超声处理40~80分钟，所得提取液再称重量，加水补足至重量M，然后离心，取上清液作为样液进样，用液质联用仪检测，得到样液的总离子流色谱图和各成分的提取离子色谱图；以原儿茶酸的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照样液同样条件用液质联用仪检测，获得原儿茶酸对照品的提取离子色谱图，以原儿茶酸对照品溶液的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积为横坐标，以原儿茶酸对照品的进样量为纵坐标制作原儿茶酸标准曲线，按同样方法制作绿原酸标准曲线、表儿茶酸标准曲线、金丝桃苷标准曲线、异槲皮苷标准曲线、槲皮素标准曲线；根据样液的各成分的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算样液中原儿茶酸、绿原酸、表儿茶酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量，换算得到山楂中各成分的含量；所述长链离子液为1-十二烷基-3-甲基咪唑盐。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述1-十二烷基-3-甲基咪唑盐为溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-十二烷基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、1-十二烷基 -3-甲基咪唑硝酸盐或1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氢盐。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的长链离子液为体氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述长链离子液体的浓度为150mmol/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述山楂粉末的质量浓度为25mg/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述超声处理的时间为40分钟。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述超声的条件为40kHz、功率100~200W。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离心是在13000rpm转速下离心5min。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行:取山楂干品、粉碎、过一号筛、除杂，得到山楂粉末；取蒸馏水加入长链离子液体，使长链离子液体的浓度为150mmol/L,称定溶液重量为M，超声混匀至透明澄清，称重量，加水补足至重量M，加入山楂粉末，使山楂粉末的质量浓度为25mg/mL，所得混合液用超声处理40分钟，所得提取液再称重量，加水补足至重量M，然后离心，取上清液作为样液进样，用液质联用仪检测，得到样液的总离子流色谱图和各成分的提取离子色谱图；以原儿茶酸的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照样液同样条件用液质联用仪检测，获得原儿茶酸对照品的提取离子色谱图，以原儿茶酸对照品溶液的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积为横坐标，以原儿茶酸对照品的进样量为纵坐标制作原儿茶酸标准曲线，按同样方法制作绿原酸标准曲线、表儿茶酸标准曲线、金丝桃苷标准曲线、异槲皮苷标准曲线、槲皮素标准曲线；根据样液的各成分的提取离子色谱图中色谱峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算样液中原儿茶酸、绿原酸、表儿茶酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量，换算得到山楂中各成分的含量。
【文档编号】G01N30/88GK103977102SQ201410127003
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】曹君, 胡帅帅, 代菡镔, 曹婉, 庞潇卿 申请人:杭州师范大学