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一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法
【专利摘要】本发明属医学检验领域，本发明的目的在于提供一种可以准确测定血浆或血清样品中内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，本发明的方法可用于准确、简便、快速地评价白血病患者治疗药物门冬酰胺酶的体内药效。本发明采用液质联用质谱仪来测定血浆或血清样品中内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度，该方法包括：A、空白基质处理；B、待测血浆或血清样品的前处理；C、待测血浆或血清样品的分离与分析。
【专利说明】一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法
【技术领域】
[0001]本发明属医学检验领域，具体涉及一种液质联用测定体内内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法。
【背景技术】
[0002]门冬酰胺酶(L-asp)治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)已经有30多年的历史，各国研究报道ALL诱导方案中添加L-asp能够提高完全缓解率(CR)和治愈率，特别是急性B淋巴细胞白血病治疗中5年无事件生存率可达到76-86%(参考文献:l.Pui，C.H.，Carroll, W.L.，Meshinchij S.，Mrcecij R.J.Biology, risk stratification, andtherapy of pediatric acute leukemias: An update.Journal of ClinicalOncology, 2011; 29 (5):551-565.2.中国临床肿瘤学会(CSCO)，中华医学会血液学分会(CHS)，中华儿科血液学分会(CCHS).培门冬酶治疗急性淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤的专家共识[J].临床肿瘤学杂志，2013; 18(3):256-263.3.Rowe JM, Buck G，Burnett AK，et al.1nduction therapy for adults with acute lymphoblastic leukemia:resultsof more thanl500patients from the international ALL trial:MRC UKALLXIVECOGE2993 [J].Blood, 2005;106(12):3760-3767.)。
[0003]L-asp独特作用机制在于水解血液中游离的门冬酰胺为L-门冬氨酸和氨，正常细胞含有门冬酰胺合成酶能合成足量门冬酰胺供自身生长，急性淋巴细胞等肿瘤细胞因缺乏门冬酰胺合成酶导致蛋白质合成障碍而细胞凋亡，从而达到靶向治疗(参考文献 4.Sara E.Shinnick, MSN, RN, et al.Managing Hypersensitivity to Asparaginasein Pediatrics, Adolescents, and Young Adults[J].Journal of Pediatric OncologyNursing, 2013; 30 (2):63 - 77.)。在治疗ALL疗效确切，现已成为不可以替代的联合治疗急性淋巴细胞白血病的一线药物。
[0004]国内外测定内源性氨基酸的主要检测方法，对氨基酸进行衍生处理后高效液相色谱荧光检测器测定，操作步骤繁琐，或者液质联用测定，均有一定的弊端。标准曲线的配制时有采用纯水溶解系列浓度氨基酸的或将血浆(血清)样品稀释几倍后再溶解系列浓度氨基酸的，后者仍存在一定浓度内源性氨基酸。这些方法均无法得到不含内源性氨基酸的空白血浆，来准确测定体内门冬酰胺和谷氨酰胺浓度，特别是不能准确反映患者体内低浓度门冬酰胺和谷氨酰胺的动态变化，用于评价门冬酰胺酶在体内药效。
[0005]目前国内外尚无文献报道有关如何处理其他内源性氨基酸，得到空白基质用于标准曲线的配制，以达到准确测定血浆(血清)样品中内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度。

【发明内容】

[0006]本发明的目的在于提供一种可以准确测定血浆或血清样品中内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，本发明的方法可用于准确、简便、快速地评价白血病患者治疗药物门冬酰胺酶的体内药效。
[0007]本发明的主要技术方案是:采用液质联用质谱仪来测定血浆或血清样品中内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度，为使测定出的数值准确，首先要解决的技术问题是如何得到不含内源性氨基酸的空白血浆或血清一即本发明的发明点之一“空白基质处理方法”；其次要解决的技术问题是如果待测的血浆或血清样品中还含有门冬酰胺酶，则会影响待测的血浆或血清样品中内源性氨基酸浓度的准确性，因此要尽快使待测的血浆或血清样品中的门冬酰胺酶灭活一即本发明的发明点之一 “待测血浆或血清样品的前处理方法”。
[0008]本发明提供了一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，该方法包括:
[0009]A、空白基质处理
[0010]将健康人体血浆或血清样品加入门冬酰胺酶混匀，放置至少lOmin，待血浆或血清样品里中的谷氨酰胺与门冬酰胺全部被消除干净，加入微量浓H3PO4或HCL调节pH至3-5，加入胰酶混匀，放置IOmin以上，得空白基质。
[0011]本发明的空白基质处理方法，使健康人体血浆或血清样品经过门冬酰胺酶处理后再用盐酸或磷酸调节PH后加入胰酶使门冬酰胺酶失活，作为空白基质配制标准曲线，测定门冬酰胺和谷氨酰胺的浓度。
[0012]此空白基质可保存半个月至一个月，重复使用。
[0013]较佳地，所述的步骤A中，血浆或血清样品我们以15ml为单位作为研究基础，门冬酰胺酶量以100IU为宜，可大于该单位，浓H3PO4或HCL以100-200 μ I为佳，胰酶量取决于加入门冬酰胺酶的效价，建议10-100IU。
[0014]进一步地，本发明提供了一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，该方法包括步骤Α、空白基质处理，以及:
[0015]B、待测血浆或血清样品的前处理
[0016]将待测(患者)血浆或血清样品，加入微量浓H3PO4或HCL调节pH至3_5，加入胰酶混匀，放置IOmin以上，-80°C冰箱冷冻保存，或加入有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀进行检测。
[0017]本发明的待测血浆或血清样品的前处理方法，使待测样品中的门冬酰胺酶活性灭失，能准确测定待测样品中内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺的浓度。
[0018]较佳地，所述的步骤B中，有机溶媒蛋白沉淀剂为80-90%甲醇或80-90%乙腈。
[0019]本发明的一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，该方法在步骤A、空白基质处理，以及步骤B、待测血浆或血清样品的前处理基础上，可以采用本【技术领域】公知的高效液相色谱仪或液质联用色谱仪来检测待测血浆或血清样品中的内源性氨基酸的浓度。
[0020]本发明所述的高效液相色谱仪或液质联用色谱仪，可参考文献:
[0021]5.Sai P.Bathenaaj Jiangeng Huangaj Adrian A.Epsteinbj et al.Rapid andreliable quantitation of amino acids and myo-1nositol in mouse brain by highperformance liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J].Journal ofChromatography B，2012;893-894:15-20.[0022]6.J.J.Pesek, M.T.Matyska, J.A.Loo, et al.Analysis of hydrophilicmetabolites in physiological fluids by HPLC - MS using a silica hydride-basedstationary phase[J].J.Sep.Sc1.2009;(32):2200 - 2208.[0023]7.Katharina Diepoldl, Katrin Bomans, Michael ffiedmann, et al.SimultaneousAssessment of Asp Isomerization and Asn Deamidation in RecombinantAntibodies by LC-MS following Incubation at Elevated Temperatures[J].Plosone, 2012; 7 (I):e30295.等。
[0024]本发明的一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，该方法还包括:
[0025]C、待测血浆或血清样品的分离与分析
[0026]待测血浆或血清样品经酸性流动相在水性液相色谱柱分离后，用质谱检测器检测内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度。
[0027]较佳地，所述的步骤C中，液相色谱条件:分析柱为Zorbax SB-AqC18Column (250 X 4.6mml.D., 5 μ m)色谱柱;流动相为甲醇-水(含 0.1% 甲酸):20-80 (V/V)；流速为0.5ml/min ;柱温为20°C ;进样量为I μ I。
[0028]所述的质谱检测器，采用AB Sciex3200Qtrap，串联质谱仪，美国应用生物系统公司；质谱条件:离子源为电喷雾离子源(ESI源)，喷雾电压为5.5kV，离子传输毛细管温度为5500C ；Gasl (N2)压力为55Arb, Gas2 (N2)压力为50Arb，帘气(N2)压力为120Arb ;碰撞气(Ar)压力为Medium ；DP电压为30eV(谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸);CE电压分别为24eV(谷氨酰胺)、22eV (门冬酰胺)和12eV (环丝氨酸);CXP电压分别为3eV (谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸)；EP电压分别为4eV (谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸)；正离子方式检测；扫描方式为选择反应监测(MRM);用于定量分析的离子对分别为m/zl47.1 — m/z83.9 (谷氨酰胺)、m/zl33.1 — m/z73.9 (门冬酰胺)和m/zl02.9 — m/z75.1 (环丝氨酸);扫描时间为 0.2s。
[0029]与其他液相色谱或液质联用检测内源性氨基酸相比，本发明的方法的有益效果如下:
[0030]血浆或血清样品经过门冬酰胺酶处理后得到不含内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺的空白血浆或血清样品，从而能准确反应内源性氨基酸体内消除，也更接近真实的提取回收率和准确度。
[0031]盐酸或磷酸调节pH至3-5后再加入胰酶使门冬酰胺酶失活，不影响门冬酰胺和谷氨酰胺加入后的稳定性，同时能减少血样在保存或检测过程中产生时间断门冬酰胺酶继续消除门冬氨酸和谷氨酰胺浓度产生的误差，更适合临床白血病病人服用门冬酰胺酶后疗效的监测。
[0032]80-90%甲醇或乙腈蛋白沉淀保证了门冬酰胺和谷氨酰胺特别高浓度充分提取。
[0033]本发明的方法操作简单、快速、灵敏、重复性好、分析周期短，不影响外源性门冬酰胺和谷氨酰胺加入后的稳定性，适合临床白血病病人服用门冬酰胺酶后疗效的监测。
[0034]本发明的方法无需昂贵的设备和试剂，血浆用量少，成本低等，适合常规治疗药物监测。【专利附图】

【附图说明】
[0035]图1是门冬酰胺酶效价与底物消除时间关系；
[0036]图2是空白血浆的典型色谱图；
[0037]图3是经过预处理后得到的不含谷氨酰胺、门冬酰胺的空白血浆基质的典型色谱图；
[0038]图4是空白血浆+标准品谷氨酰胺、门冬酰胺和内标环丝氨酸的典型色谱图；
[0039]图5是服用门冬酰胺酶白血病患者的血浆的典型色谱图；
[0040]其中峰1:环丝氨酸(内标)；峰2:门冬酰胺；峰3:谷氨酰胺。
【具体实施方式】
[0041]下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0042]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0043]液质条件:AB Sciex3200Qtrap,串联质谱仪，美国应用生物系统公司；岛津液相色谱仪，包括LC-20ADXR泵两台、D⑶-20A3在线脱气仪、SIL-20ACCXR自动进样器、CT0-20AC
柱温箱。
[0044]液相色谱条件:分析柱为Zorbax SB-Aq C18Column (250 X 4.6mml.D.，5 μ m)色谱柱；流动相为甲醇-水(含0.1%甲酸):20-80 (V/V);流速为0.5ml/min ;柱温为20°C ;进样量为I μ I。`
[0045]质谱条件:离子源为电喷雾离子源(ESI源)，喷雾电压为5.5kV，离子传输毛细管温度为550°C；Gasl(N2)压力为55Arb，Gas2 (N2)压力为50Arb，帘气(N2)压力为120Arb ;碰撞气(Ar)压力为Medium ；DP电压为30eV (谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸)；CE电压分别为24eV (谷氨酰胺)、22eV (门冬酰胺)和12eV (环丝氨酸)；CXP电压分别为3eV (谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸)；EP电压分别为4eV (谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸)；正离子方式检测；扫描方式为选择反应监测(MRM);用于定量分析的离子对分别为m/zl47.1 — m/z83.9 (谷氨酰胺)、m/zl33.1 — m/z73.9 (门冬酰胺)和 m/zl02.9 — m/z75.1 (环丝氨酸);扫描时间为0.2s。
[0046]实施例1:不同比例甲醇-水或不同比例乙腈-水溶液对氨基酸提取率考察
[0047]血清样品于室温(20°C )下自然融化后取200 μ L加入800 μ L不同比例甲醇-水或不同比例乙腈-水溶液，涡旋15秒后于IlOOOrpm离心7分钟。转移上清液后转移至自动进样器小瓶中，自动进样器内20°C下等待进样(每个血样前处理过程均在3h内完成)。
[0048]表1不同比例甲醇-水或不同比例乙腈-水溶液对氨基酸提取率考察
[0049]
不 |sj 比 ^Sample!I Sample 2 I Sample 3Sample 4
frl[介和1 (峰面积) I (峰面积)(洚面积)(峰面积)
Asn Gin I Ass I Gln I Am Gto Asn I Gln溶_II[II
[0050]
【权利要求】
1.一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，其特征在于，该方法包括: A、空白基质处理 将健康人体血浆或血清样品加入门冬酰胺酶混匀，放置至少lOmin，待血浆或血清样品里中的谷氨酰胺与门冬酰胺全部被消除干净，加入微量浓H3PO4或HCL调节pH至3-5，加入胰酶混匀，放置IOmin以上，得空白基质。
2.根据权利要求1所述的一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，其特征在于，该方法还包括: B、待测血浆或血清样品的前处理 将待测血浆或血清样品，加入微量浓H3P04或HCL调节pH至3_5，加入胰酶混匀，放置IOmin以上，再加入有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀。
3.根据权利要求1或2所述的一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，其特征在于，该方法还包括: C、待测血浆或血清样品的分离与分析 采用液相色谱和质谱联用法来检测待测血浆或血清样品中的内源性氨基酸的浓度。
4.根据权利要求1或2所述的一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，其特征在于，所述的步骤A中，血浆或血清样品为15ml，门冬酰胺酶> 100IU，浓H3PO4 或 HCL 为 100-200 μ 1，胰酶为 10-100IU。
5.根据权利要求1或2所述的一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，其特征在于，所述的步骤B中，有机溶媒蛋白沉淀剂为80-90%甲醇或80-90%乙月青。
6.根据权利要求1或2所述的一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法，其特征在于，该方法还包括: C、待测血浆或血清样品的分离与分析 待测血浆或血清样品经酸性流动相在水性液相色谱柱分离后，用质谱检测器检测内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度； 液相色谱条件:分析柱为Zorbax SB-Aq C18column250 X 4.6mml.D., 5 μ m色谱柱；流动相为甲醇-水含0.1%甲酸:20-80V/V ;流速为0.5ml/min ;柱温为20°C ;进样量为I μ I。 所述的质谱检测器，采用AB Sciex3200Qtrap，串联质谱仪，美国应用生物系统公司；质谱条件:离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为5.5kV，离子传输毛细管温度为550°C ；Gasl压力为55Arb，Gas2压力为50Arb，帘气压力为120Arb ;碰撞气Ar压力为Medium ；DP电压为30eV谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸；CE电压分别为24eV谷氨酰胺、22eV门冬酰胺和12eV环丝氨酸；CXP电压分别为3eV谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸；EP电压分别为4eV谷氨酰胺、门冬酰胺和环丝氨酸；正离子方式检测；扫描方式为选择反应监测；用于定量分析的离子对分别为m/zl47.1 — m/z83.9谷氨酰胺、m/zl33.1 — m/z73.9门冬酰胺和m/zl02.9 — m/z75.1环丝氨酸；扫描时间为0.2s。
【文档编号】G01N30/02GK103822981SQ201410061791
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】王卓, 张文静, 高申, 万思慧, 许孟雪, 丁雪鹰, 何金凤, 丁楠 申请人:中国人民解放军第二军医大学