专利名称：同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)及同型半胱氨酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定同型
半胱氨酸浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
测定血浆中同型半胱氨酸的方法有很多种，包括高效液相色谱法(HPLC)、氨基酸 分析仪测定法、离子色谱法、酶联免疫分析法(EIA)、毛细管气相色谱_质谱，荧光偏振免疫 分析(FPIA)、电化学法及酶法等等。 1.高效液相色谱法(HPLC):是经典的参考方法，但其有操作比较复杂，试验耗时 比较长，试验数据变异比较大的缺点，在临床应用方面逐渐被酶联免疫分析法、荧光偏振分 析法和酶法所取代。高效液相色谱法是先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸 转变成还原形式，然后与荧光剂进行衍生生成同型半胱氨酸_荧光物质复合物，将衍生后 的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同，因此流动相将其洗脱下来 的次序也不同，根据这一原理将样品中的不同物质分开，以荧光检测器检测洗脱下同型半 胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可以 测定血总同型半胱氨酸的水平。 2.酶联免疫分析法(EIA):是临床上测定同型半胱氨酸水平的常用方法，其特点 是操作比较方便、快捷，重复性好，方法稳定可靠。缺点是大部分操作还是手工操作，比较耗 时等。酶联免疫分析法其基本分析原理先使用酶将血样中所有形式的同型半胱氨酸转变 成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶标的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的单克隆或多 克隆抗体，采用竞争结合的原理，将不同水平的标准品与酶标抗体竞争结合，然后以显色试 剂和终止试剂分别进行显色和终止，制作出同型半胱氨酸浓度与发色强度的标准曲线。样 品也按相同步骤处理，在标准曲线上就可以查出其同型半胱氨酸的浓度。 3.离子色谱法主要用于实验研究，临床上较少使用。其基本分析原理是色谱分 析的一种，主要是其固定相采用离子交换物质，根据其对不同离子的吸附力不同可将同型 半胱氨酸与其它物质分开进行测定。 4.毛细电泳法主要用于实验研究，有在临床使用的报道。其特点与高效液相色 谱方法相似，如其有操作比较复杂、试验耗时较长和试验数据变异比较大的缺点。基本分析 原理先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光试剂 进行衍生生成同型半胱氨酸_荧光物质复合物，将衍生后的样品进行毛细电泳分析。将样 品放置于10千伏左右的高压电场中，因为各种物质所带电荷不同，其等电点也不相同，因 此其在电场中的迁移速度也就不同，根据这一原理可将同型半胱氨酸与样品中的其它物质 分开，再以荧光检测器检测同型半胱氨酸_荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内 标的比值进行比较和计算，就可以测定总同型半胱氨酸的水平。
5.荧光偏振法是临床上测定同型半胱氨酸水平的比较好的方法，该方法完全自动化仪器分析，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理样品中游离同型半胱氨酸和 抗单克隆抗体相结合的同型半胱氨酸的荧光偏振强度不同，将样品、标准品与标抗体竞争 结合，采用竞争结合的原理制作出同型半胱氨酸浓度与荧光偏振强度的标准曲线，在标准 曲线上就可以查出其同型半胱氨酸的浓度。 6.酶法是因应市场需求而新开发出来的测试方法，目前国内有多项专利申请 CN98807531. 8利用同型半胱氨酸酶来测量样品中同型半胱氨酸含量；CN200410016789. 6 利用同型半胱氨酸转甲基酶(E. C. 2. 1. 1. 10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E. C. 3. 3. 1. 1)的循
环扩增作用，再加上腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶等，或腺苷 脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型半胱氨酸含量；CN200510053210. 8利用L-蛋氨 酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之产生巯化氢后再与莹光化合物DMPD2HC1作用产生
荧光，该方法使用全自动荧光分析仪测试，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理 用基因重组酶将同型半胱氨酸分解，所形成之巯化氢产物再与荧光显色剂发生化学反应形
成可测量之荧光化合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出 一 种利用间接酶循环扩增法 (IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method) 及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm 波长处吸光度的变化，得以测定同型半胱氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现 该方法的同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪 或半、全自动生化分析仪上进行同型半胱氨酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而 可以得到切实的推广应用。 本发明同型半胱氨酸浓度测定方法如下 同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸脱巯基酶巯化氢+氨+ a-氧代丁酸 氨+2水+6氧化型铁氧还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 亚硝酸+6还原型铁氧还蛋白 亚硝酸+3还原型辅酶亚硝酸还原酶氢氧化铵+3辅酶+水 这种方法应用同型半胱氨酸脱巯基酶(homocysteine desulfhydrase ;EC 4.4.1.2)酶(偶)联铁氧还蛋白亚硝酸还原酶(ferredoxin-nitrite reductase ;EC 1. 7. 7. 1)、亚硝酸还原酶(nitrite reductase ;EC 1. 7. 1. 4)酶促反应连续监测法。同型半 胱氨酸脱巯基酶及铁氧还蛋白亚硝酸还原酶作为作用酶，功能为将同型半胱氨酸酶解产生 氨(在水溶液中为氨离子)，再产生亚硝酸。亚硝酸还原酶作为循环酶亚硝酸还原酶的酶 促作用使亚硝酸产生氢氧化铵(氨离子+氢氧离子)；使氨不断地被重复循环利用。亚硝 酸还原酶又作为显色酶，一次将三个还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为三个氧 化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速 度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算同型半胱氨酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单 剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)较为理想
5
缓冲液100,1/L稳定剂500,1/L还原型辅酶0. 25,1/L同型半胱氨酸脱巯基酶6000U/L铁氧还蛋白亚硝酸还原酶8000U/L亚硝酸还原酶10000U/L氧化型铁氧还蛋白5mmol/L本发明的同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氧化型铁氧还蛋白。
试剂2 缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原 酶。 还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、 氧化型铁氧还蛋白在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氧化型铁氧还蛋白。
试剂2 缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶。
试剂3 缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸脱巯基酶。 还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、 氧化型铁氧还蛋白在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定同型半胱氨酸浓度的方法，其还原型辅酶 可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一 本实施例的同型半胱氨酸诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
还原型辅酶 0. 25mmol/L 同型半胱氨酸脱巯基酶 6000U/L
铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 8000U/L
亚硝酸还原酶 10000U/L
氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间4分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
实施例二 本实施例的同型半胱氨酸诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0. 25mmol/L 氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L
试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 同型半胱氨酸脱巯基酶 6000U/L 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 8000U/L 亚硝酸还原酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度I. 8±0. 7，
测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂1、试剂2的体积比例
为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间4分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
实施例三 本实施例的同型半胱氨酸诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0. 25mmol/L
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氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L
试剂2 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 8000U/L
亚硝酸还原酶 10000U/L
试剂3 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 500mmol/L 同型半胱氨酸脱巯基酶 6000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定同型半胱氨酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10
分钟，起始吸光度1. 8±0. 7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测同型半胱氨酸样品
与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时
间大约1分钟左右，检测时间4分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
申请人:经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明 的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0. 003 ;吸光度时间反应曲线应呈下 降曲线直至终点；试剂可测有效(R > 0. 99)线形范围可达0. 6mmol/L ;试剂测试的不准确 度，其相对偏差不超过±5% ;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2% ;试剂 的灵敏度可达O. 3±0. 15 AA/mmol/L ;试剂在2-8"下保存，活性可以稳定一年；——本发 明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
一种利用间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的同型半胱氨酸浓度测定方法，其方法如下同型半胱氨酸+水 同型半胱氨酸脱巯基酶 巯化氢+氨+ α-氧代丁酸氨+2水+6氧化型铁氧还蛋白 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 亚硝酸+6还原型铁氧还蛋白亚硝酸+3还原型辅酶 亚硝酸还原酶 氢氧化铵+3辅酶+水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出同型半胱氨酸的浓度大小测定结果。
2. —种同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括缓冲液20———500,1/L稳定剂1——-4000mmol/L还原型辅酶0. 1—0.35mmol/L同型半胱氨酸脱巯基酶1000-—80000U/L铁氧还蛋白亚硝酸还原酶1000-—80000U/L亚硝酸还原酶1000-—80000U/L氧化型铁氧还蛋白1——-50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氧 化型铁氧还蛋白组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝 酸还原酶、亚硝酸还原酶组成。还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还 原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氧 化型铁氧还蛋白组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶 组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸脱巯基酶组成。还原型辅酶、同型半胱氨酸 脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化型铁氧还蛋白在试剂1、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于还包括 稳定剂l-4000mmol/L或0. 1% _100%体积比。所述稳定剂为甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的同型半胱氨酸诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定同型半胱氨酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、氧化型铁氧还蛋白、同型半胱氨酸脱巯基酶、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硝酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
文档编号G01N21/17GK101750390SQ200810244290
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月10日 优先权日2008年12月10日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
