专利名称：微阵列表征系统和方法
技术领域：
生物传感器通常被设计成检测某些靶分子到表面的特异性结合(binding)。通 过像荧光分子那样的标签或者产生物理效应的任何其他标签的附接，使得靶的存在是有形 的。通常使用光学标签。在荧光检测的情况下，标签分子由具有与标签分子(例如染料分子) 的吸收最大值相应的波长的光束激发。不同波长下发射的光需要以最大灵敏度检测以便允 许非常灵敏地测量潜在的生物结合事件。对于医疗诊断领域的生物传感器和微流体器件的 许多应用而言，有必要检测相当数量的不同靶分子的结合。这是通过不同捕获分子的阵列 在衬底上的固定化来实现的。因此，任务是以高的灵敏度和再现性快速地检测非常稀释的 浓度下的样本中存在的大量不同靶分子。灵敏度由靶分子固定到表面的效率和传感器原理 的灵敏度确定。尽管靶分子固定化的效率取决于靶分子的浓度、它们的扩散和反应动力学 以及表面面积，但是传感器原理的灵敏度取决于产生的背景信号。该背景具有不同的起源， 比如来自其他源的信号、来自非特异性结合到表面的标签的信号、传感器噪声等等。降低噪 声水平的措施导致测量的质量和灵敏度提高并且改进检测极限。对于医疗诊断而言，设计 必须是低成本解决方案，因为使用的部件的至少一部分是消费品。
背景技术：
一种已知的表征系统描述了共焦显微镜用于荧光测量方法中并且记载于欧洲专 利申请EP1548481A1中。该系统包括用于在要观察的对象上产生多个焦点以及用于产生光 的适当偏振方向的微透镜阵列和液晶控制系统。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测来自至少一个样本中的不同分析物的发光的良好 的方法和系统。本发明实施例的一个优点是获得了一种紧凑的系统。此外，本发明实施例 的一个优点是获得了一种将扫描(例如共焦扫描)与成像组合的系统，其导致良好的灵敏度 和良好的测量速度。上面的目的是通过如权利要求1和10限定的依照本发明的方法和器件来实现的。本发明涉及一种与检测器一起使用的系统，其用于检测来自衬底的多个子区中的 每一个的发光响应并且用于表征与衬底接触的样本中的多个分析物，该系统包括包含多 个孔径的孔径阵列，所述孔径适于限制多个激发辐射子束和/或发光辐射子束，以及包含 与所述多个孔径相应的多个透镜的透镜阵列，该透镜阵列的每个透镜适于接收来自孔径阵 列的相应孔径的激发辐射子束并且适于将激发辐射子束直接聚焦到衬底的子区上，和/或 适于直接收集来自衬底子区的发光辐射子束并且将发光辐射子束引导到孔径阵列的相应 孔径。本发明实施例的一个优点是，所述表征系统允许甚至对于复用测量，即对于相同样本中不同分析物的检测，也以高的激发效率进行激发。直接聚焦意味着在透镜阵列与衬底之 间没有另外的透镜化元件或聚焦元件。此外，所述表征系统可以包括样本保持器，其用于邻近透镜阵列提供衬底以便获 得衬底和透镜阵列的配置，该配置允许将浸没流体用于将来自透镜阵列中的透镜的激发子 束引导到衬底子区或者用于收集从衬底子区到透镜阵列中的透镜的发光辐射子束。本发明 实施例的一个优点在于，可以实现来自衬底表面的子区的发光辐射的高效收集。后者可以 通过将浸没液体用于收集而有利地获得。孔径阵列的孔径可以与透镜阵列的透镜对准。这种对准可以是可设置的对准或者 可以是永久的对准。本发明实施例的一个优点在于，可以实现发光标签的集中的激发，导致 适当的发光光通量。本发明实施例的一个优点在于，可以获得发光响应的适当收集。后者 例如通过聚焦来获得，因为其导致标签的激发接近或者处于这些标签的饱和水平并且同时 不漂白这些标签。此外，所述表征系统可以包括扫描装置，其用于提供激发辐射子束与衬底之间的 相对运动。本发明实施例的一个优点在于，可以将例如相对于衬底的宽入射角范围内发射 的发光辐射的高效收集与衬底表面的扫描组合，因为这种扫描允许利用获得适当的激发所 需的聚焦的波束在获得适当的灵敏度所需的大表面区域上操作。后者例如被获得，因为它 允许使用浸没液体。此外，扫描装置适于提供每个激发辐射子束在衬底上的相应子区内的 相对扫描运动。本发明实施例的一个优点在于，只需小的扫描幅度，导致稳定且可靠的系 统。所述表征系统可以适于经由透镜阵列和孔径阵列引导激发辐射子束并且适于经 由透镜阵列和孔径阵列收集发光辐射子束。依照本发明的实施例的一个优点在于，使用了 共焦表征技术，导致基于样本盒中发射产生的发光辐射的位置对该发光辐射滤波。 所述表征可以包括检测器，该检测器可以是多像素检测器并且所述表征系统可以 适于基本上单独地检测来自衬底上不同子区的发光响应。依照本发明的实施例的一个优点 在于，这些实施例允许复用测量，即检测相同样本中的不同分析物。所述透镜阵列可以适于在与透镜阵列相比的衬底的相对侧将激发辐射子束聚焦 到衬底表面上，衬底的相对侧适于与样本接触。依照本发明的实施例的一个优点在于，获得 了简单的测定(assay )过程和表征系统，由此对于执行样本中的分析物的表征，无需清洗衬 底。所述表征系统可以适于检测DNA或蛋白质。此外，该系统可以包括聚焦装置，其用 于调整衬底上的透镜阵列的焦点。依照本发明的实施例的一个优点在于，可以使用该系统， 其中衬底具有不同的厚度。此外，所述系统可以包括对准装置，其用于对准包括衬底的样本盒。这种对准可以 是与系统的对准，例如与透镜阵列的对准。依照本发明的实施例的一个优点在于，可以获得 透镜阵列的透镜与衬底上的子区的对准。此外，所述系统可以包括处理和分析装置，其适于分析检测的来自衬底上的不同 子区的发光响应。依照本发明的实施例的一个优点在于，该表征系统可以以自动化和/或 自动的方式操作。所述孔径阵列可以适于接收激发辐射束并且产生激发辐射子束。
本发明还涉及一种用于表征与衬底接触的样本的方法，该方法包括使用孔径阵列 同时限制多个激发辐射子束和/或发光辐射子束，以及在透镜阵列的相应透镜内接收来自 孔径阵列的相应孔径的激发辐射子束，并且直接地将所述多个激发子束中的每一个聚焦到 衬底子区上，或者直接地收集来自衬底子区的发光辐射子束并且将这些发光辐射子束引导 到孔径阵列的相应孔径。此外，该方法可以包括检测收集的发光辐射子束。该方法可以包 括在样本盒与透镜阵列之间提供浸没液体。后者允许更高效地收集发光。所述方法可以适于表征DNA和/或蛋白质以用于诊断目的。此外，本发明涉及用于表征样本中的多个分析物的样本盒，该样本盒包括衬底和 流体通道，该流体通道被适应性调节以便使流体通道中的流体与衬底的表面接触，衬底表 面包括包含不同结合位点的多个子区，所述结合位点用于结合样本中的不同分析物，并且 所述子区具有间距，其适于利用通过引导激发束经过孔径阵列和透镜阵列而产生的多个激 发子束表征，或者适于通过收集来自衬底子区的经过透镜阵列的透镜的发光辐射子束并且 将这些发光辐射子束引导到孔径阵列的孔径而表征。此外，所述盒可以包括例如衬底上的对准特征，其用于相对于表征系统对准衬底。所述子区可以适于结合DNA或者蛋白质。本发明还涉及一种用于与表征系统一起使用的控制器，该表征系统用于表征与衬 底接触的样本中的多个分析物，该表征系统包括包含多个孔径的孔径阵列，所述孔径适于 限制由激发辐射源产生的多个激发辐射子束和/或发光辐射子束，包含与所述多个孔径相 应的多个透镜的透镜阵列，该透镜阵列的每个透镜适于接收来自孔径阵列的相应孔径的激 发辐射子束并且适于将激发子束直接聚焦到衬底子区上，和/或适于直接收集来自衬底子 区的发光辐射子束并且将发光辐射子束引导到孔径阵列的相应孔径，该表征系统还包括用 于检测来自衬底的每个子区的发光响应的检测器，所述控制器适于控制激发辐射源和/或 检测器。该控制器可以适于使激发辐射源和检测器同步。本发明实施例的一个优点在于，这些实施例例如可以用作生物传感器，用于分子 诊断，用于检测药物或滥用，用于分析环境参数，如食品质量传感器等等。依照本发明实施 例的系统特别适合于复用，即用于同时执行大量分析。依照本发明实施例的系统因此也特 别适合于基因分析，例如基因表达分析。所附独立权利要求和从属权利要求中阐述了本发明的特定和优选的方面。从属权 利要求的特征可以适当地与独立权利要求的特征以及其他从属权利要求的特征组合，并且 不仅仅如权利要求中明确阐述的。本发明的教导允许设计改进的用于检测样本中的分析物的方法和设备。本发明的 上面的和其他的特性、特征和优点根据以下参照附图进行的详细描述将变得清楚明白，这 些附图通过实例说明了本发明的原理。该描述仅仅出于举例的原因而给出，并没有限制本 发明的范围。下面引用的附图标记参见附图。
图1示出了依照本发明第一方面的实施例的表征系统的示意性配置。图2为依照本发明第一方面的实施例的示例性表征系统。图3为依照本发明第一方面的特定实施例的适于使用浸没液体的示例性表征系统。图4为依照本发明第二方面的实施例的用于表征样本的方法的流程图。图5为依照本发明第三方面的实施例的样本盒的示意性表示。
在不同的附图中，相同的附图标记表示相同或相似的元件。
具体实施例方式本发明将参照特定实施例并且参照特定附图加以描述，但是本发明并不限于此， 而是仅由权利要求书限制。权利要求书中的任何附图标记都不应当被视为限制了范围。所 描述的附图仅仅是示意性的并且是非限制性的。在附图中，出于说明的目的，一些元件的尺 寸可能被夸大并且未按比例绘制。在措词“包括”用于本说明书和权利要求书中的情况下，其并没有排除其他的元件 或步骤。在引用单数名词时使用不定冠词或定冠词(例如“一”、“该”)的情况下，这包含该 名词的复数，除非另有特定声明。此外，说明书和权利要求书中的措词第一、第二、第三等等用于区分相似的元件并 且不一定用于描述时间上、空间上排序或者按照任何其他方式的顺序。应当理解的是，这样 使用的措词在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明实施例能够以不同于本文 所述或所示的其他顺序操作。而且，说明书和权利要求书中的措词顶部、底部、上方、下方等等用于描述的目的 并且不一定用于描述相对位置。应当理解的是，这样使用的措词在适当的情况下是可互换 的，并且本文描述的本发明实施例能够以不同于本文所述或所示的其他取向操作。在整个本说明书中，对于“一个实施例”或者“某个实施例”的引用意味着关于该 实施例描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施例中。此外，本领域技术 人员根据本公开内容应当清楚的是，特定的特征、结构或特性可以在一个或多个实施例中 以任何适当的方式进行组合。类似地，应当理解的是，在本发明示例性实施例的描述中，为了精简本公开内容并 且帮助理解本发明各方面中的一个或多个方面，有时在单个实施例、附图或者其描述中将 本发明的各个方面分组在一起。然而，本公开内容的方法不应当被解释为反映了这样的意 图要求保护的本发明需要比每个权利要求中明确列举的特征更多的特征。相反地，如下 面的权利要求书所反映的，本发明的方面存在于单个前面公开的实施例的不是所有的特征 中。因此，详细描述之后的权利要求书由此明确合并到该详细描述中，每个权利要求本身作 为本发明的单独实施例而存在。此外，尽管本文描述的一些实施例包括其他实施例中包含的一些而非其他特征， 但是本领域技术人员应当理解的是，不同实施例的特征的组合预期处于本发明的范围内， 并且形成不同的实施例。例如，在下面的权利要求书中，可以以任意组合使用要求保护的任 何实施例。此外，一些实施例在这里描述为可以由计算机系统的处理器或者由执行功能的其 他装置实现的方法或者方法元素的组合。因此，具有用于执行这种方法或者方法元素的必 要指令的处理器形成用于执行该方法或者方法元素的装置。此外，本文描述的设备实施例 的元件是用于实现出于实施本发明的目的而由元件执行的功能的装置的实例。
在本文提供的描述中，阐述了许多特定细节。然而，应当理解的是，可以在没有这 些特定细节的情况下实施本发明的实施例。在其他情况下，没有详细地示出公知的方法、结 构和技术以便不使对本说明书的理解�：磺�。下面的术语或定义仅仅被提供来帮助理解本发明。对于术语“辐照”和“发光”，典 型地可能表示UV、可见或者红外辐照，尽管本发明并不限于此并且也可以使用其他类型的 电磁辐照。所提及的辐照束的波长可以是辐照束的平均波长，或者获得最大发射所在的波 长。本文中使用的术语“衬底”描述了辐照束必须聚焦于其上且其发光辐照束被收集的区 域。依照本发明设想其检测的发光位点是衬底上发射具有至少一个发光束波长或者至少一 个中心发光束波长的至少一个发光束的不同位点或斑点(spot)。可以设想任何发光信号， 例如反射、散射、荧光、化学发光、电致发光、生物发光或者其他发光。发光位点可能涉及衬 底上的占用位点，其例如被发光加标签靶颗粒占用。当靠近或者结合到分析物分子时发射 辐射或改变其辐射输出(例如消灭或者至少部分地消灭)或者改变发射的辐射的颜色的分 子将被描述为“光学可变分子”。从衬底发出的发光包括远离和/或通过衬底传输的或者 由放置在衬底上的元素创建的辐射，所述元素例如在以适当的辐射波长激发之后例如在微 阵列中产生荧光辐射的荧光标签。衬底可以是任何适当的衬底，例如玻璃载片、微阵列、硅 芯片、膜(例如尼龙膜)、滤波器(例如尼龙滤波器)、微流体器件、粗糙化金属衬底、凝胶(例 如包含染色DNA或蛋白质的琼脂糖凝胶)或者具有用于提供发光位点的适当表面的任何其 他器件。本文使用的术语“样本”涉及包含感兴趣分析物的合成物。本文使用的术语“分析 物”指的是要由本发明方法检测的物质。分析物可以是固有的发光供应物，或者可以加标签 以发出发光。本文使用的术语“标签”指的是能够产生可检测信号的分子或材料。标签可 以直接地或者通过连接基(linker moiety)(例如加标签探针)附接到分析物。预期特异性 结合到分析物的这些探针通过将能够特异性结合到分析物或者与分析物的至少(特定)部 分相应的化合物链接到标签来获得。分析物特异性探针的性质将由要检测的分析物的性质 确定。最常见的是，探针基于与分析物的特异性相互作用而开发，所述相互作用例如但不限 于抗原-抗体结合、互补核苷酸序列、碳水化合物-凝集素结合、互补肽序列结合、配体-受 体结合、辅酶-酶结合、酶抑制剂-酶结合等等。在第一方面中，本发明涉及一种用于表征与衬底表面接触的样本中的多个分析物 的表征系统。这种衬底优选地设有衬底表面的多个不同子区，这些子区中的至少一些适于 结合到不同的分析物。当样本与这种衬底接触时，特定分析物结合到衬底表面的特定子区。 依照本发明实施例的表征系统特别适合于检测这样的不同分析物。所述表征系统优选地适于接收来自辐射源的激发辐射束和/或适于收集发光辐 射响应。该表征系统包括包含多个孔径的孔径阵列，所述孔径适于限制多个激发辐射子束 和/或发光辐射子束。限制多个激发辐射子束因而可以通过在孔径阵列上接收激发束并且 使用所述多个孔径产生多个激发子束来获得。此外，该表征系统包括衍射装置，例如包含多 个透镜的透镜阵列。这些透镜中的每一个可以与孔径阵列的相应孔径对准。因此，这些透 镜适于接收由相应孔径产生的激发子束并且适于直接地将激发子束聚焦到衬底表面的子 区上或者适于直接地收集来自衬底子区的辐射子束并且将发光辐射子束引导到孔径阵列 的相应孔径。所述聚焦使得焦斑是衍射受限的，从而具有1微米或更小的焦点尺寸。已知使用
8非球面透镜表面以避免透镜像差，以便允许提高斑点质量并且从而实现衍射受限聚焦。因此，可以通过使用检测器检测起源于来自所述不同子区的发光标签或者不同受 激发分析物的发光辐射。在一个优选的实施例中，例如使用与用于激发的透镜阵列相同的 透镜阵列分别针对每个子区收集和检测衬底的不同子区处产生的发光。不同的标准和可选 的部件示于图1，该图示出了依照第一方面的实施例的示例性系统100。这些不同的部件将 在下面进一步更详细地加以讨论。表征系统100可以包括辐照源102，尽管辐照源102也可以与表征系统100分开， 由此表征系统100因而适于接收激发束。表征系统可以被认为与激发单元104—起使用或 者包括激发单元104并且与检测单元118 —起使用或者包括检测单元118，由此辐照源102 可以是激发单元104的一部分或者可以不是它的一部分。可替换地，如下面将要讨论的，表 征系统可以用于表征不由辐射激发引起的发光响应。辐照源102优选地产生适于激发发光 标签的激发束。辐照源102可以适于产生多个不同波长的辐射。辐照源102可以是白色光 辐照源。辐照源102也可以包括一个或多个单色或准单色辐照源。辐照源102可以是例如 发光二极管或者多个发光二极管、激光器或者多个激光器、可调谐激光器等等。例如，在其 中产生的辐射是荧光辐射的情况下，激发辐射的光波长典型地可以例如处于200nm-2000nm 的范围内，或者例如处于400nm-l IOOnm的范围内，本发明并不限于此。表征系统100，例如激发单元104，可以包括用于将激发束引导到针孔的一个或多 个光学元件106。这些用于引导激发束的一个或多个光学元件106可以选自透镜、棱镜、涂 敷棱镜、滤波器等等，或者这些元件的任意组合。表征系统100包括包含多个孔径并且适于 接收激发束且适于将激发束分裂成一定数量的激发子束的孔径阵列108。孔径阵列108适 于将多个子束提供给第一透镜阵列110。孔径阵列可以是允许在其与辐照路径垂直的截面 内减小、限制辐照束或者对辐照束定形的器件阵列。孔径阵列可以是常规的针孔阵列108、 光阑阵列等等。孔径阵列也可以是快门阵列。孔径阵列108可以邻近适于将辐射集中到孔 径中的一个或多个附加透镜阵列。这样的一个或多个透镜阵列可以与孔径阵列108—起形 成单片集成块。当安装了样本盒115时，第一透镜阵列110适于将激发子束直接聚焦到衬 底112上的不同子区。这种聚焦可以仅由第一透镜阵列110执行，即由一个有限共轭透镜 实现，或者与更靠近针孔阵列108的透镜阵列元件一起执行。第一透镜阵列110也可以以 单片集成的方式与孔径阵列108—起形成。透镜阵列110可以通过蚀刻和复制在晶片级上 制成。整个读出系统可以包含数百至数千平行辐射路径并且可以以非常高效的方式以晶片 级工艺制造和装配。第一透镜阵列110将激发子束直接聚焦到衬底112上，这意味着在激 发子束与衬底112之间不存在附加的透镜化元件或聚焦元件。面向衬底112的第一透镜阵 列110优选地被设计成具有最大数值孔径(NA)，具有可接受的焦距以便允许适合实际用途 的衬底厚度。这种衬底厚度可以例如介于10微米与100微米之间。大于1的数值孔径NA 可以通过在表征系统100与样本盒中的生物衬底112之间使用浸没液体来实现，如下面将 要更详细地描述的。所述表征系统优选地包括用于保持样本盒115的样本保持器116。尽管原则上样 本盒115可以是先前在插入到表征系统100中之前或者在表征之前与样本接触的衬底112， 但是在一个优选的实施例中，样本盒115包括衬底112和用于包含与衬底112的生物表面 接触的样本流体的流体通道114。当将样本插入到流体通道中时，发生分析物与衬底112的生物表面上的结合位点的结合。优选地，衬底112可以包括多个子区，这些子区上可以发生 靶特异性结合以便能够将不同的分析物结合到衬底上的不同子区，从而允许复用测量。第一透镜阵列110和样本保持器116的配置使得当样本盒115处于用于表征的适 当位置时，激发子束聚焦到样本盒115中的衬底112的子区上。在一个优选的实施例中，作 为衬底的生物表面的部分的这样的子区被放置在与透镜阵列相比的衬底的相对侧。因此， 生物表面在衬底的该侧与样本流体接触。第一透镜阵列110因此优选地适于将激发子束聚 焦到与激发子束入射到衬底112上的初始侧相对的衬底表面处，即激发子束通过衬底112 聚焦到所述表面上。后者具有以下优点激发辐照束不必穿过样本流体并且因而减少了流 体中的非结合发光标签的发光的产生。此外，后者通过使用提供的孔径阵列108和第一透 镜阵列110的配置而减少，导致激发辐照子束适当地聚焦到子区上。在该实施例中，由于激 发辐照需要穿过衬底以便能够激发发光标签，因而衬底应当被选择以便对于激发辐照是基 本上透明的。不必为表征系统的一部分，而是可以与其协作的样本盒115可以是一次性的，尽 管本发明并不限于此并且也可以使用用于清洗衬底的清洗装置。然而，考虑到精度和交叉 污染，优选的是其中衬底只使用一次的一次性盒。如果发光标签与要检测的相应分析物一起在子区中的结合位点上被捕获，那么聚 焦到衬底112的子区上的不同激发子束将激发发光标签。固定化标签的发射的辐射将在所 有方向上辐射，最高的强度指向衬底112。此外，表征系统100适于在检测器122中检测发 光响应。适于收集发光响应的部分可以称为检测单元118。为了进行检测，表征系统100可 以包括附加的光学引导装置120，例如透镜、反射镜、光栅、滤波器、棱镜等等。这些光学元件 中的一个或多个可以包括滤波器，例如二向色滤波器，其用于选择发光响应并且用于滤除 反射的激发辐射以便提高收集的发光响应的信噪比。通过这种方式，针对其波长对发光响 应进行滤波。仅仅起源于衬底表面的发光辐射将通过滤波器并且将撞击检测器122。反射 的或散射的激发辐射被滤除并且不会到达检测器122。检测器122可以是任何适当的检测器，其用于检测来自衬底表面处的发光标签的 发光响应。使用哪个检测器元件106取决于样本或者其部件中产生的辐射类型。可以例如 在样本或者其部件中产生光学荧光辐射的情况下使用的检测器122的典型实例是例如显 微镜、诸如CCD或CMOS相机之类的相机、光学检测器、光电检测器，例如光电二极管、光电晶 体管或者其阵列。为了同时检测来自衬底上不同子区以及因而结合的不同分析物的发光， 检测器122优选地包括多个检测器元件，或者换言之，检测器122优选地为检测器阵列。这 种检测器阵列可以附接到所述表征系统。其优选地经过对准，使得来自每个子区的发光辐 射可以根据需要聚焦到传感器上的单个像素上或者众多像素上。单个像素将是优选的，因 为较高的强度增大信噪比。如果使用了单像素检测器，那么需要扫描发光响应，并且复用的 大多数优点丧失。检测器122优选地连接到读出电路124，允许读出从给定子区获得的发光 响应。这种读出电路1 可以适于存储获得的发光响应结果。此外，这可以链接到处理和 分析单元126以便处理和/或分析发光响应结果。后者可以以自动化和/或自动的方式执 行。不同的总体检测配置可以用于收集来自样本的或者衬底上捕获的发光标签的发 光响应。表征系统100可以适于收集来自与激发相比的相对侧的发光响应，即激发单元104可以放置在检测单元118的相对侧。可替换地，激发单元104可以放置在检测单元118的 相同侧。后者导致更紧凑的系统，并且导致以下优点激发束或者发光束都不必穿过样本以 便产生激发/被收集。在一个优选的实施例中，通过使用与用于聚焦激发束的第一透镜阵 列相同的第一透镜阵列110以及可选地也使用孔径阵列108来执行发光响应的收集。通过 使用也用于收集发光响应的孔径阵列108，对于发光辐射的起源点发生滤波，导致衬底112 上不同子区之间的较少的串扰。后者是有利的，因为来自不同子区的发光代表检测的不同 分析物，并且在仍然能够执行复用的同时获得更精确的检测结果。此外，如后面将在特定实 施例中所陈述的，浸没液体的使用可以允许在衬底中降低或避免全内反射，从而通过相同 的光学装置导致更多的辐射被收集并且因而导致更高的信噪比。起源于来自衬底112的不 同子区的不同发光响应进一步可以通过用于聚焦激发束的光学元件106的部分和/或如上 所述通过附加的光学元件120来收集。其中第一透镜阵列110和孔径阵列用于收集发光辐 射的实施例的特定实例示于图2。在那里，来自辐照源104的激发辐射横向耦合并且通过使 用覆盖有二向色滤波器204的棱镜202朝孔径阵列108和第一透镜阵列110反射。在图2 中，通过实例(本发明并不限于此)，示出了透镜阵列叠层，其中除了第一透镜阵列110外，进 一步也在孔径阵列108附近提供了附加的透镜阵列206、208，以用于最佳地将辐射引导到 针孔阵列108，即将辐射聚焦到孔径阵列108，并且用于引导来自孔径阵列108的辐射，即帮 助第一透镜阵列110将辐射聚焦到衬底112上。此外，表征系统100可以包括聚焦装置128，其用于将辐射的焦点调节到适当的位 置，即处于具有结合位点的子区所在的衬底112表面处。这种聚焦装置1 可以利用用于 提供表征系统或者其部分的轴向致动的致动器130，使得第一透镜阵列110被适应性调整 到适当的位置以便具有与衬底112表面相应的焦距。聚焦装置1 可以适于使用例如来自 样本盒，例如来自衬底表面(例如衬底的生物表面)的反射的激发辐射的强度。为此目的，特 殊的部分反射区域可以包含在衬底上。可替换地，可以使用衬底与样本流体的界面处的反 射。未被固定化发光标签吸收并且在样本流体中传输的激发辐射可以到达在衬底112的相 对侧限定流体通道的盖。该盖可以吸收激发辐射。这可以以选择性方式来完成。因此，可以实现自动聚焦功能(或者主动聚焦功能)，使得衬底处于透镜阵列的最 佳聚焦位置。通常，这要求
-致动的透镜阵列或衬底或者二者，使得可以调节这二者的相对位置。理想情况下，该 致动可以实现与平面内运动组合的竖直运动；
-聚焦误差信号用作自动聚焦和平面内校正的输入。聚焦信号可以通过各种不同的已 知聚焦技术(傅科(Foucault)边缘、傅科棱镜、像散等等)在从衬底反射的总的综合信号上 获得。自动聚焦特征可以与透镜阵列和衬底之间的倾斜检测组合。倾斜检测可以限于仅 仅一个方向上的倾斜检测。为了具有完全倾斜控制，需要两个正交聚焦/倾斜传感器(例如 分裂从衬底反射的光学信号)。一个或多个四象限检测器可以用于该目的。实现自动聚焦功能的一种可替换的方式是采用像素化检测器，其中反射的光以共 焦的方式直接成像到检测器上。可以对图像进行分析并且可以从图像分析导出完全深度和 倾斜控制。此外，表征系统100可以包括对准装置134，其用于将激发子束与样本盒115对准。这种对准装置134可以基于例如衬底112上的子区之外的，即衬底112的生物结合区域之 外的衬底上的对准标记的检测。这种检测可以例如以光学方式执行，尽管本发明并不限于 此。此外，这样的对准标记可以包括位置或其他信息，该信息可以与相对扫描运动同时地读 出，以便导出位置信息和/或改进不同方向上的对准，例如衬底平面内或者甚至衬底平面 内和与其垂直的方向上的对准。如将要参照另外的优选实施例更详细地描述的，表征系统100进一步也可以包括 扫描装置132，该扫描装置用于提供激发辐照束与衬底112上的子区之间的相对运动。在一个优选的实施例中，所述系统适于通过合并扫描装置132提供样本盒与激发 子束之间的相对运动。后者可以以任何适当的方式提供，例如通过使表征系统100相对于 样本盒115运动，通过使表征系统100的光学布置的部分相对于样本盒115运动，使得在衬 底112的表面上扫描激发子束，通过使样本盒115相对于表征系统100运动，或者通过这些 的组合。使用当前优选的实施例，可以通过在衬底112上的相应子区上提供激发子束的扫 描而显著地增大检测灵敏度。通过使用本发明的有利实施例，其中使用透镜阵列110同时 表征衬底的不同子区，可以限制不同激发子束的扫描幅度。更特别地，如果例如透镜阵列 110的间距以及衬底表面112上的子区的间距被适应性调整成相似或相同，那么仅需要在 子区区域内扫描，即仅需要子斑扫描，并且扫描幅度和扫描速率可以为小。这可以以任何适 当的方式(例如通过压电驱动)非�？焖偾铱煽康赝瓿伞Ｍ妇嫡罅�110可以永久地与图像 检测器阵列122对准。通过这种方式，没有额外的噪声和变化在扫描期间通过从一个像素 跨越到另一个像素的辐射引入。由于扫描幅度非常小并且速度低，因而运动光学叠层的重 量不关键。小的扫描幅度和扫描速率是有利的，因为它在表征系统100中提供了更大的稳 定性。此外，小的扫描幅度和扫描速率可以进一步有助于使用浸没液体以便高效地收集发 射的发光，如在不同的特定实施例中所陈述的。通过这种方式，发射的辐射的收集角度较少 受限于内反射。扫描可以以步进的方式执行，或者它可以以连续的方式执行。扫描运动可 以是系统的运动，例如依照蜿蜒的(serpentine)模式，或者可以依照不同的模式。扫描速 度可以调节到检测器与读出电路之间的可能的数据传递速度。举例而言(本发明并不限于 此)，可以如下确定子区的示例性停留时间和扫描速度。衬底上子区的区域可以具有100微 米范围内的尺寸，例如具有IOOOOMm的上限，优选地lOOOMm，以及IMm的下限，优选地5Mm。 假设蜿蜒模式的话，用于使用焦点直径为IMffl的激发子束扫描IOOMffl χ IOOMffl的整个子区 的总扫描长度因而变为10mm。如果扫描时间选择为100s，那么扫描速度将是lOOMm/s。相 应的停留时间将是10ms。传感器像素的积分时间可以任意地选择在IOms与100s的总扫描 时间之间，因为与给定子区的扫描相应的检测的每个发光斑点可以分配给固定的单个像素 (或像素选择)。在一个特定实施例中，本发明的表征系统适于使得可以利用浸没流体250以便收 集发光辐射，如图3中所示。第一透镜阵列110和样本保持器116因而被适应性调整以便提 供透镜阵列和衬底的配置，当装载到系统中时，其适于使用浸没液体。这种配置可以获得， 因为第一透镜阵列110是用于激发辐射的最后的聚焦元件，即它直接地将激发子束聚焦到 衬底上。通常，第一透镜阵列110与衬底之间的距离越小越好。因此，应当注意的是，第一 透镜阵列110和衬底112放置得越靠近，对准就越困难。第一透镜阵列110与衬底112之 间的距离因而可以具有30mm的上限，更优选地为IOmm以及甚至更优选地为2mm，并且具有
120.01mm的下限，优选地为0. Imm0在该实施例中，激发子束优选地聚焦到关于衬底的与透镜 阵列相对的衬底表面处，并且样本盒优选地被设计成使该相对表面与要分析的流体样本接 触。通过这种方式，浸没流体不可能干扰样本。通过使用浸没流体，产生的发光辐射的收集 角度不再由衬底内辐射的全内反射限制。甚至在各向同性发射的情况下，收集的辐射的强 度也随数值孔径的平方而成比例改变。利用衬底材料的典型的折射率1. 52，依照斯涅耳定 律，与空气间隙的最大折射角为42°。利用浸没，该角度不再由衬底中辐射的全内反射限 制。考虑发光标签的高的各向异性发射，这将导致收集效率增大几个数量级。浸没液体的使用使得NA能够增大到大于1。浸没液体250可以如图所示包含在透镜上面。然而，通过仅仅扫描子斑区域，存在 小行程和低速要求。结果，浸没液体可以具有更高的粘性(具有类似于油脂的一致性)并且 因而无需实际的容纳(containment)。对于超过1帕秒的粘度范围，不需要实际的容纳。在 最简单的实现方式中，用户可以仅仅在将样本放置在扫描仪上之前施加浸没液体。更复杂的解决方案也是可能的，例如样本与扫描光学器件之间的空间密封并且填 充有水。先前，需要特殊的设计以便处理在窄间隙中由流体产生的高剪切率和应力。将多 个具有小行程的透镜用于子扫描避免了需要这样的复杂解决方案。一些柔性的密封和容纳 可能仍然是所希望的，因为如果粘性太高，那么就可能容易地俘获气泡。依照本发明实施例的一个优点在于，可以以高效的方式执行辐射的收集。应当注 意到，在当前实施例中，也可以设想其中仅存在单个孔径和单个第一透镜的系统。当前实施 例的一个优点在于，可以在无需不同的光学器件的情况下增大系统的数值孔径。在另一实施例中，本发明涉及一种表征系统100，其中如上所述存在透镜阵列和孔 径阵列，但是其中以任何其他方式(例如而不限于化学发光)激发发光标签。透镜阵列和孔 径阵列于是如上所述仅用于收集目的。表征系统100可以包括用于激发发光标签的非辐射 激发系统。这种系统具有以下优点依照不同的子束选择性地收集不同的发光响应，并且由 于发光响应的共焦收集的原因，系统中的串扰更少。依照本发明的实施例的一个优点在于，获得了灵敏的检测。依照本发明的实施例 的优点还在于，获得了大的区域的选择性的和高效的读出。本发明实施例的一个优点在于， 通过组合聚焦的激发、大的收集角度以及反射的共焦读出，可以执行精确的复用测量以便 检测样本中的多个分析物。本发明实施例的一个优点在于，可以获得高效的并行扫描。依 照本发明的实施例的一个优点在于，可以获得共焦读出。在第二方面中，本发明涉及一种用于表征与衬底接触的样本的方法。该方法包括 从激发束同时产生多个激发子束以及将所述多个激发子束引导到透镜阵列上。此外，该方 法包括直接地将所述多个激发子束中的每一个聚焦到衬底的子区上。直接地聚焦指的是， 透镜阵列的透镜是辐射撞击衬底之前辐射路径上的最后的聚焦元件或透镜化元件。可替换 地或者除此之外，所述方法包括直接地收集来自衬底子区的发光辐射子束以及将这些发光 辐射子束引导到孔径阵列的相应孔径。因此，这些发光辐射子束是受限的，即这些发光辐射 子束的选择性部分然后可以传输到检测系统。这样的选择性部分可以与衬底上出现的预定 侧向位置以及其中相对于衬底表面(即在垂直于衬底的方向上)而放置发光标签的预定距 离相应。依照本发明实施例的示例性方法300示意性地示于图4中，该图说明了方法300 的标准的和可选的步骤。这些不同的标准的和可选的步骤在下面更详细地加以讨论。
在第一可选步骤302中，方法300包括产生激发辐照束。激发辐照束优选地适于 激发感测应用中使用的辐照标签。可替换地，该方法也可以包括通过引导激发辐照束或者 分裂激发辐照束获得激发辐照束。在第二步骤304中，方法300包括从激发辐照束产生多个激发子束。后者可以例 如通过使用孔径阵列来执行。通过这种方式，因而可以同时产生多个激发子束。在激发之前执行的单独的步骤306中，使样本与衬底112接触。样本可以例如引 入紧邻衬底的流体通道中并且使得样本中的分析物可以选择性地与衬底表面的不同子区 接触。通过这种方式，要检测的不同分析物可以选择性地结合到衬底表面的不同子区，其中 可以检测这些分析物。这种选择性的结合可以通过使用衬底表面的不同子区中的预定结合 位点来执行。该步骤可以在步骤302和304之前执行。另一步骤308可以包括在透镜阵列与衬底之间提供浸没流体。后者允许在宽的入 射角下收集发射的发光辐射，即这降低了衬底中的发光辐射的全内反射。在另一步骤310中，同时产生的所述多个激发子束直接地聚焦到衬底的不同子区 上以便激发结合到其上的发光标签。后者可以例如通过使用透镜阵列来执行。聚焦可以是 聚焦到关于衬底的与透镜阵列相对的衬底表面上。在另一步骤312和314中，执行对于激发的所述多个发光响应的收集和检测。后 者可以例如通过使用用于聚焦激发的透镜阵列并且使用孔径装置来执行，导致将来自衬底 的预定子区的发光响应适当地引导到检测器上的预定位置上，例如引导到预定检测器像素 上。在附加的步骤316中，根据检测的发光响应，可以确定预定分析物的存在性。后者 可以被导出，因为这些不同的发光响应中的每一个在检测器上的预定位置上被收集并且因 而可以单独地检测。所述方法可选地也可以包括在衬底的子区内扫描激发辐照束的步骤。后者可以被 执行以便增大复用测量的灵敏度。该方法优选地可以通过使用如第一方面中所描述的表征 系统来执行。在例如其中使用化学发光标签的可替换的实施例中，发光标签的激发是不必要 的。所述方法于是不包括步骤304和310，而是通过使用透镜阵列直接分别地收集发光辐射 子束并且将发光辐射子束引导到孔径阵列来执行发光响应的收集。在这里，发光辐射子束 优选地关于其侧向位置和到衬底的垂直距离是受限的。在第三方面中，本发明涉及用于检测样本中的不同分析物的样本盒。样本盒包括 衬底以及用于提供样本流体与衬底表面之间的接触的流体通道。这种样本盒的一个实例示 于图5中。如上所述，衬底112可以是任何适当的衬底，例如玻璃或塑料。优选的是，衬底 对于激发辐照和/或发光辐照是高度透明的，因为检测优选地发生在与其中激发辐照起初 入射所在的衬底侧相对的衬底表面处。衬底112优选地包括适于将分析物或结合到其上的 标签结合到衬底表面的多个子区402。依照本发明的实施例，衬底表面上的不同子区402设 有与表征系统的透镜阵列或孔径阵列的间距相应的间距。不同的子区402由此可以适于结 合不同的分析物，从而例如当利用如第一方面中所述的表征系统读出时提供了复用测量的 可能性。换言之，衬底表面的不同子区可以设有用于将分析物或者结合到分析物上的标签 结合到衬底表面的附接位点、结合部件或受体(例如抗体)。
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样本盒115 (例如衬底112)也可以包括对准特征404，其用于相对于表征系统对 准样本盒115或者更特别地相对于衬底112上的子区对准激发子束。这样的对准特征404 优选地放置在生物结合区域之外，并且可以在扫描子区期间同时地读出。这样的对准特征 404可以包括位置信息或者其他信息。它可以改进样本盒例如在衬底平面的方向上的对准， 但是也改进样本盒在衬底平面的方向上以及与其垂直的方向上的对准。样本盒115可以是一次性的或者可重复使用的。可重复使用的盒可以适于清洗衬 底表面以便清除它的结合的分析物。对于一次性样本盒而言，依照本发明的实施例，有利的 是盒不包括微型光学特征。后者可以导致时间以及经济方面的制造成本低。样本盒特别适合用于如第一实施例中所描述的表征系统中。依照本发明的实施例的一个优点在于，获得了表征系统，例如生物传感器，其具有 高灵敏度、允许高速检测并且允许复用，即选择性检测。此外，本发明实施例的一个优点在 于，获得了鲁棒的表征系统。依照本发明的实施例的一个优点在于，可以以高效率收集来自发光标签的发光响 应。后者有助于高的信噪比。依照本发明的实施例的一个优点在于，可以执行共焦激发和收集，由此获得了仅 仅小的激发体积。后者导致降低的背景信号和增大的信噪比。因此，本发明通过组合高激发强度、高收集效率和低背景噪声而允许实现高灵敏 度。高NA透镜给出高的激发效率、高的收集效率和背景抑制。本发明的系统允许扫描众多 感兴趣区域。衍射受限光学器件给出大约1微米或更少的斑点尺寸，并且扫描处于连续模 式下以便收集感兴趣区域的图像。共同地运动的众多波束的使用允许显著地减少扫描运动 的行程，并且以此方式通过实施子斑扫描方法使得“通过扫描成像”的方法对于较大的区域 是高效的。只要荧光团未漂白，那么使用高激发功率是有利的。如果要避免漂白，那么监控相 同的斑点是不可能的。子斑扫描避免了漂白问题。通过使用子斑光学扫描系统，浸没液体的使用变得可行，因为只需子斑行程，并且 因而浸没介质不在高速率或变形下剪切。这确保了作为高NA收集透镜与衬底之间的折射 率匹配的结果，从荧光团发射的光能够到达该透镜。组合扫描和浸没在涉及高扫描速度时 是非常困难的任务，并且这通过子斑扫描方法而避免。连续扫描成像方法与衍射受限光学器件、与斑点阵列、与浸没液体的优选组合允 许
-高效地扫描大的区域；
-实现衍射受限空间分辨率；
-通过在衬底中避免光捕获而实现高的收集效率；
-通过衬底测量以便对于测定可从顶部自由访问并且没有与样本的光学干扰； -测量更长的时间而没有漂白问题。应当理解的是，尽管在本文中针对依照本发明的器件讨论了优选的实施例、特定 的构造和配置以及材料，但是可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下做出形式和细节 方面的各种改变或修改。例如，尽管参照用于表征样本的系统和方法描述了本发明，但是本发明也涉及用于例如通过扫描子区和/或检测发光辐射响应而控制激发的控制器。这种控制器可以包 括处理器和存储器并且可以适于获得诸如例如同步命令之类的命令并将其提供给激发源 和检测源。该控制器可以以任何适当的方式操作，例如基于预定的算法、神经网络等等而操 作。
权利要求
1.一种与检测器一起使用的系统(100)，用于检测来自衬底(112)的多个子区中的每 一个的发光响应并且用于表征与衬底(112)接触的样本中的多个分析物，该系统(100)包 括包含多个孔径的孔径阵列(108)，所述孔径适于限制多个激发辐射子束和/或发光辐 射子束，以及包含与所述多个孔径相应的多个透镜的透镜阵列(110)，该透镜阵列(112)适于在与 透镜阵列(112)相比的衬底(112)的相对侧将激发辐射子束聚焦到衬底表面上，衬底(112) 的相对侧适于与样本接触，所述透镜阵列(110)中的每一个透镜适于接收来自所述孔径阵列(108)的相应孔径的激发辐射子束并且适于将激发辐射子 束直接聚焦到衬底(112)的子区上，并且适于直接收集来自衬底(112)的子区的发光辐射子束并且将发光辐射子束引导到所述 孔径阵列的相应孔径，其中所述表征系统(100)进一步包括样本保持器(116)和浸没流体，样本保持器(116) 用于邻近透镜阵列(110)提供衬底(112)，浸没流体用于将来自透镜阵列(110)中的透镜 的激发子束引导到衬底(112)的所述子区或者用于收集从衬底(112)的子区到透镜阵列 (110)中的透镜的发光辐射子束，其中所述表征系统进一步包括扫描装置(132)，该扫描装置用于提供激发辐射子束与 衬底(112)之间的相对运动，以便提供每个衍射受限斑在衬底(112)上的相应子区内的相 对扫描运动。
2.依照权利要求1的表征系统(100)，其中孔径阵列(108)的孔径与透镜阵列(110)的透镜对准。
3.依照权利要求1或2的表征系统(100)，其中所述表征系统适于经由所述透镜阵列 (110)和所述孔径阵列(108)引导激发辐射子束并且适于经由所述透镜阵列(110)和所述 孔径阵列(108)收集发光辐射子束。
4.依照权利要求1-3中任何一项的表征系统(100)，其中所述检测器(122)是多像素 检测器并且所述表征系统(100)适于基本上单独地检测来自衬底(112)上的不同子区的发 光响应。
5.依照前面的权利要求中任何一项的表征系统(100)，其中该系统进一步包括用于调 整衬底(112)上的透镜阵列(110)的焦点的聚焦装置。
6.依照前面的权利要求中任何一项的表征系统(100)，其中该系统进一步包括用于对 准包括衬底(112)的样本盒(115)的对准装置(134)。
7.依照前面的权利要求中任何一项的表征系统(100)，其中该系统进一步包括适于分 析检测的来自衬底(112)上的不同子区的发光响应的处理和分析装置(1M)。
8.依照权利要求7的表征系统(100)，其中孔径阵列(108)适于接收激发辐射束并且 产生所述激发辐射子束。
9.依照前面任一权利要求的表征系统(100)，其中所述透镜阵列(110)中的每个透镜 聚焦到衍射受限斑上。
10.一种用于表征与衬底接触的样本的方法，该方法包括使用孔径阵列同时限制多个激发辐射子束和/或发光辐射子束，以及在透镜阵列的相应透镜内接收来自孔径阵列(108)的相应孔径的激发辐射子束并且直 接地将所述多个激发子束中的每一个聚焦到衬底的子区上，透镜阵列(112)在与透镜阵列 (112)相比的衬底(112)的相对侧将激发辐射子束聚焦到衬底表面上的斑点上，衬底(112) 的相对侧由样本接触，并且直接地收集来自衬底子区的发光辐射子束并且将这些发光辐射 子束引导到孔径阵列的相应孔径，其中通过浸没流体将激发子束从透镜阵列(110)中的透镜引导到衬底(112)的所述子 区，并且收集通过浸没流体从衬底(112)的子区到透镜阵列(110)中的透镜的发光辐射子 束，其中所述方法进一步包括使用扫描装置(132)提供激发辐射子束与衬底(112)之间的 相对运动，以便提供每个斑点在衬底(112)上的相应子区内的相对扫描运动。
11.依照权利要求10的方法，其中透镜阵列(110)聚焦到衍射受限斑上。
12.一种用于与如权利要求1所述的系统一起使用的控制器，该控制器实现权利要求 10或11的方法。
全文摘要
描述了一种用于检测样本中的多个分析物的系统和方法。表征系统(100)包括用于产生多个激发子束并且将这些激发子束聚焦到衬底的不同子区上的孔径阵列(108)和透镜阵列(110)。这些子区可以设有用于结合样本中的不同分析物的不同结合位点。通过在检测器中检测不同的发光响应，可以同时确定不同分析物的存在性或数量。可替换地或者除此之外，可以使用透镜阵列执行发光辐射的收集，该透镜阵列用于直接地收集发光响应并且用于将收集的发光响应引导到相应的孔径。在一个优选的实施例中，激发子束聚焦到与透镜阵列相对的衬底一侧，并且在透镜阵列与衬底之间提供浸没流体以便增大发光辐射的收集效率。
文档编号G01N21/64GK102077080SQ200980124080
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月23日 优先权日2008年6月24日
发明者M. H. P. 范迪克 E., I. 博亚姆法 M., 迪尔克森 P., 温伯格费里德尔 R. 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司
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