专利名称：莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全领域中涉及β2-受体激动剂残留检测领域。具体而言，本发明涉及莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条及其制备方法与用途。
背景技术：
莱克多巴胺(Ractopamine)、西马特罗(Cimaterol)都属于β2-受体激动剂,近年来，很多不法商家将它们作为盐酸克伦特罗的替代品添加于动物饲料中，当长期用来饲喂动物时，莱克多巴胺、西马特罗对动物有营养再分配的作用，促进动物体内蛋白质沉积而抑制脂肪形成，从而显著提高动物胴体的瘦肉率。但莱克多巴胺、西马特罗在体内代谢缓慢、易聚积、药物残留率高，当人类食用残留该类药物的动物性食品后会产生中毒从而对人体健康产生相当的危害，通常表现为肌肉震颤、心悸、发烧、恶心呕吐等，严重的会昏迷甚至死亡。因此，许多国家已经禁止在动物饲料中添加β2_兴奋剂，但是关于β2_兴奋剂的食品安全事件时有发生。目前，国内外检测莱克多巴胺和西马特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用技术(GC-MS)、液相色谱质谱联用技术(LC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)。在食品安全检测中，往往先用ELISA进行初筛后，再对阳性样本用HPLC或GC-MS、LC-MS进行确证。但是上述方法所用的仪器设备昂贵复杂、成本高，同时需要对操作人员进行特殊培训，且实验结果不能立即显示，因此不适用于商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象的快速在线检测和监控。胶体金试纸条是 以胶体金作为免疫层析的指示物，其原理是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过直接运用可目测的胶体金标记物而得到直观的实验结果。虽然该方法快速方便，但是胶体金试纸条仍有以下缺点:(I)只有当金颗粒集聚到一定量(IO7个/mm2)时，才出现肉眼可见的紫红条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。(2)样品基质效应明显，背景干扰大。(3)无法实现定量检测。(4)只能检测单个污染物此外，虽然现在也有单独检测莱克多巴胺的胶体金试纸条和西马特罗的检测卡，但是至今仍没有一种能同时定性且定量检测莱克多巴胺和西马特罗的产品。因此，目前对于同时定量检测莱克多巴胺与西马特罗的检测手段仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能有效检测莱克多巴胺和西马特罗的二联胶体金试纸条及其制备方法和用途。在本发明的第一方面，参考图1，本发明提出了一种莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条，包括:底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述金标垫上是含有胶体金标记的抗莱克多巴胺单克隆抗体和胶体金标记的西马特罗单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有两条检测线和一条质控线，所述检测线依次由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合的莱克多巴胺检测抗原线状点样和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合和抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。由此，可以有效地获得莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条，从而对样品中莱克多巴胺、西马特罗进行定量检测。在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条的方法，其包括下列步骤:制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有两条检测线和一条质控线；制备金标垫；以及组装试纸条，其中，用能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合的莱克多巴胺检测抗原和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样分别作为所述两条检测线；用能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。由此，通过本发明的方法，能有效制备前面所述的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条，从而对样品中莱克多巴胺、西马特罗进行定量检测。根据本发明的实施例，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的:将硝酸纤维素膜按20mm 30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2mg/mL 1.0mg/mL的莱克多巴胺、西马特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15mm 18mm,两条检测线之间相隔5mm ;将经纯化浓度调整为0.5mg/mL 1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边IImm 13mm ;将所述硝酸纤维素膜于37摄氏度烘干处理过夜后，在室温干燥的环境下保存。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备大小均一、位置固定并且分别具有特定浓度抗原、抗体的检测线和质控线，从而获得具有检测线和质控线的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条，进而有效地对莱克多巴胺、西马特罗进行定量检测。根据本发 明的实施例，金标垫是通过下列步骤获得的:分别选用能与莱克多巴胺、西马特罗检测抗原结合的莱克多巴胺和西马特罗单克隆抗体用胶体金标记；把所述的用胶体金标记过的莱克多巴胺和西马特罗单克隆抗体混合后，喷在玻璃纤维膜上。由此，通过本发明实施例的方法，可以有效地制备具有能与莱克多巴胺、西马特罗检测抗原结合的莱克多巴胺和西马特罗单克隆抗体用胶体金标记的金标垫，从而获得具有金标垫的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条，进而有效地对莱克多巴胺、西马特罗进行定量检测。在本发明的另一方面，本发明提供了一种前面所述的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条检测莱克多巴胺、西马特罗的方法，包括以下步骤:配制已知系列浓度的莱克多巴胺、西马特罗混合标准品并加入所述胶体金读取仪的样本孔中，10分钟后检测对应的光密度数值并建立标准曲线，将含有检测样品的试纸条放入所述胶体金读取仪中，读取检测数值，以及通过所述标准曲线计算所述检测样品中莱克多巴胺、西马特罗含量。由此，通过本发明所提供的方法，可以有效地制备采用该胶体金读取仪检测莱克多巴胺、西马特罗的校准曲线，从而配合本发明提供的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条有效地对莱克多巴胺、西马特罗进行定量检测。有益效果1、多残留监测:本发明采用莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条能根据T线和C线的显色情况同时监测样品中莱克多巴胺、西马特罗的污染情况。2、灵敏度高:本发明采用莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条配胶体金读取仪的方法，能通过仪器替代肉眼观察实验结果，克服了肉眼判断带来的误差，从而提高了检测灵敏度，本方法检测莱克多巴胺和西马特罗的灵敏度分别为0.5ppb和lppb。3、定量:本发明采用莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条配胶体金读取仪的方法，可以根据胶体金读取仪显示器上的显示数值，参照标准曲线即可分别得出被检样品中莱克多巴胺和西马特罗的含量。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1是根据本发明实施例的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条的结构图；图2是根据本发明实施例的一种胶体金读取仪的示意图；图3是根据本发明实施例的定量检测莱克多巴胺、西马特罗流程图。
具体实施例方式本实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1免疫抗原的合成1.1合成莱克多巴胺免疫抗原采用混合酸酐法制备莱克多巴胺-BSA免疫抗原:称取莱克多巴胺34mg和IOmg丁二酸酐在2mL吡啶中反应，室温下搅拌过夜，置于通风橱中将吡啶完全蒸发，此反应产物为莱克多巴胺-半丁二酸酐；将其溶于2mL N, N- 二甲基甲酰胺和2mLl，4- 二氧六环混合物中，再加26.2μ L的三正丁胺，在冰浴中搅拌10分钟，再加氯甲酸异丁酯15L，室温反应，搅拌I小时；将此混合物逐滴加入预冷的蛋白溶液(IOOmg BSA溶解于0.1M硼酸钠pH8.5)，室温反应过夜，在PBS中透析72小时以上，透析后即得到纯化的莱克多巴胺-BSA免疫抗原。
权利要求
1.一种莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条，其特征在于，包括: 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫， 其中，所述金标垫上是含有胶体金标记的抗莱克多巴胺单克隆抗体和胶体金标记的西马特罗单克隆抗体， 所述硝酸纤维素膜上进一步形成有两条检测线和一条质控线， 所述检测线依次由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合的莱克多巴胺检测抗原线状点样和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成， 所述质控线由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合和抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。
2.一种制备权利要求1所述的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条的方法，其特征在于，包括下列步骤: 制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上形成有两条检测线和一条质控线； 制备金标垫；以及 组装试纸条， 其中， 用能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合的莱克多巴胺检测抗原和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样分别作为所述两条检测线； 用能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体在所述硝酸纤维素膜上进行线状点样作为质控线。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测线和质控线是通过下列步骤获得的: 将硝酸纤维素膜按20mm 30mm宽的尺寸剪裁；将经纯化浓度调整为0.2mg/mL 1.0mg/mL的莱克多巴胺、西马特罗检测抗原，在膜上线状点样作为检测线，其中，检测线点样位置离膜底边15mm 18mm,两条检测线之间相隔5mm ； 将经纯化浓度调整为0.5mg/mL 1.5mg/mL的驴抗小白鼠免疫球蛋白抗体，在膜上线状点样作为质控线，质控线点样位置离膜底边Ilmm 13mm ； 将所述硝酸纤维素膜于37摄氏度烘干处理过夜后，在室温干燥的环境下保存。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，金标垫是通过下列步骤获得的: 分别选用能与莱克多巴胺、西马特罗检测抗原结合的莱克多巴胺和西马特罗单克隆抗体用胶体金标记； 把所述的用胶体金标记过的莱克多巴胺和西马特罗单克隆抗体混合后，喷在玻璃纤维膜上。
5.一种采用如权利要求1所述的莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸配胶体金读取仪定量检测的方法，其特征在于，包括下列步骤: 配制已知系列浓度的莱克多巴胺、西马特罗混合标准品并加入所述胶体金读取仪的样本孔中， 10分钟后检测对应的光密度数值并建 立标准曲线，将含有检测样品的试纸条放入所述胶体金读取仪中，读取检测数值，以及通过所述标准曲线计 算所述检测样品中莱克多巴胺、西马特罗含量。
全文摘要
本发明提出了一种莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条及其制备方法，其中莱克多巴胺、西马特罗二联胶体金试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述金标垫上是含有胶体金标记的抗莱克多巴胺单克隆抗体和胶体金标记的西马特罗单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上进一步形成有两条检测线和一条质控线，所述检测线依次由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合的莱克多巴胺检测抗原线状点样和能与抗西马特罗单克隆抗体结合的西马特罗检测抗原线状点样组成，所述质控线由能与抗莱克多巴胺单克隆抗体结合和抗西马特罗单克隆抗体结合的驴抗小白鼠抗体线状点样组成。利用该试纸配合胶体金读取仪能有效的定量检测莱克多巴胺、西马特罗。
文档编号G01N33/577GK103235125SQ201310121479
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者赖卫华, 彭涛, 杨万春, 陈媛, 刘文娟 申请人:江西中德生物工程有限公司
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