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检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三合一胶体金层析试纸条及其制备方法
【专利摘要】一种检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，属于免疫学检测【技术领域】。本发明包括单克隆抗体的制备和胶体金免疫层析试纸条的制备两部分。该单克隆抗体可同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考，并具有高的灵敏度；胶体金免疫层析试纸条包括聚氯乙烯背衬，聚氯乙烯背衬前端设置样品垫，样品垫与硝酸纤维素膜前端连接，硝酸纤维素膜后端与吸水垫连接；结合垫为胶体金标记的单克隆抗体；硝酸纤维素膜上依次包被有氯霉素琥珀酸钠-BSA抗原检测线T线和羊抗鼠IgG控制线C线。本发明检测快速，仅需要3-5min；便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。
【专利说明】检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三合一胶体金层析试纸条及其制备方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，属于免疫学检测【技术领域】。

【背景技术】
[0002]氯霉素类抗生素是广泛使用的兽药之一。目前主要有氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF)三种药物，其中甲砜霉素是氟苯尼考的衍生物，它们的抗菌作用与氯霉素相似。氯霉素会导致人体再生障碍性贫血，这种毒性作用与剂量和疗程无关，国际上相继禁止或严格限制使用氯霉素。氟苯尼考和甲砜霉素是氯霉素的替代物，但大量使用导致其在畜产品以及奶制品中大量残留，危害人体健康。因此，我国规定氯霉素禁止使用，甲砜霉素在各动物组织的最大残留限量为50μ g/kg，氟苯尼考胺为氟苯尼考的标志残留物，在肌肉中的最大残留限量为1000 μ g/kg。
[0003]动物饲料和组织中氯霉素类药物残留是兽药残留研究领域的重点监控对象，因此，亟待建立一种快速、灵敏、准确的氯霉素类药物残留检测方法，确保动物性食品的安全。
[0004]目前的检测方法主要是仪器分析法和免疫分析法。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法、液质联用(HPLC-MS)、气质联用(GC-MS)等，这些方法精密度高但需要昂贵的仪器设备，操作需要专业技术人员，且不能适应高通量、现场的快速检测。免疫分析法主要为酶联免疫检测法，其检测成本高，并不适合企业低成本检测的需要。因此实现具有快速、便于携带、低成本的多残留检测具有现实意义。


【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种能够检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，该方法是基于能同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三种药物，并具有高灵敏度的单克隆抗体。
[0006]本发明的技术方案，一种检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条，包括聚氯乙烯PVC背衬，聚氯乙烯PVC背衬前端设置样品垫，样品垫通过结合垫与硝酸纤维素膜前端连接，硝酸纤维素膜后端与吸水垫连接；所述结合垫上含有胶体金标记的单克隆抗体；硝酸纤维素膜上包被有氯霉素琥珀酸钠-BSA检测线T线和羊抗鼠IgG控制线C线。
[0007]氯霉素琥珀酸钠-BSA是用于检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的抗原，检测线与质控线平行。
[0008]胶体金标记能同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的制备与纯化:
以甲砜霉素的类似物即1- (4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇TAP-NH2作为半抗原，采用重氮化法将其与牛血清蛋白BSA偶联得到免疫原，混合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞sp/20融合，经过三次亚克隆和间接竞争ELISA的筛选得到能稳定分泌可同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的细胞株，将其进行扩大培养后，注射到小鼠体内诱发产生腹水；采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水即得到单克隆抗体。
[0009]所述检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条的制备方法，步骤为:
(1)可同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的制备与纯化:
(2)检测抗原氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物的制备:将氯霉素琥珀酸钠与水溶性碳二亚胺EDC以摩尔比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-吗啡啉)MES缓冲溶液中，室温活化6h，之后将活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.01mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸钠的摩尔比为1: 40，室温反应12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物；
(3)胶体金溶液的制备:用朽1檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20-40nm胶体金颗粒；
(4)该单抗标记的胶体金溶液的制备:取步骤(3)制备的4mL胶体金调至pH9.0，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.lmg/mL的单克隆抗体0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1%，放置至少30min后，10000r/min离心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸盐缓冲液4mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液0.4mL重悬，得到稳定的单克隆抗体-胶体金标记物；
(5)小鼠血清-胶体金标记物的制备:将步骤(4)中的受体替换为阴性小鼠的纯化血清，重复步骤(4)，得到小鼠血清-胶体金标记物；
(6)硝酸纤维素膜的处理:将氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物和羊抗鼠IgG分别包被在作为反应垫的硝酸纤维素膜的检测线T线和控制线C线，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纤维素膜；
(7)三合一试纸条的组装:将样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)由一端依次黏附在PVC背衬(I)上，即得到用于检测的免疫层析试纸条。
[0010]所述的检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条，其对甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素的最低检测限分别是lng/mL,2.5ng/mL, Ing/mL。
[0011]本发明的有益效果:本发明提供一种便携、快速、适合进行现场检测的免疫层析色谱检测法(gold immunochromatography assay ;GICA),能实现甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的同时检测。本发明检测快速，仅需要3-5分钟；便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。

【专利附图】

【附图说明】
[0012]图1组装完成的免疫层析试纸条俯视图。
[0013]图2该试纸条对甲砜霉素的检测结果。
[0014]图3该试纸条对氟苯尼考的检测结果。
[0015]图4该试纸条对氯霉素的检测结果。

【具体实施方式】
[0016]实施例1
如图1所示，一种检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条，包括聚氯乙烯PVC背衬1，聚氯乙烯PVC背衬I前端设置样品垫2，样品垫2通过结合垫3与硝酸纤维素膜4前端连接，硝酸纤维素膜4后端与吸水垫5连接；所述结合垫3上含有胶体金标记的单克隆抗体；硝酸纤维素膜4上包被有氯霉素琥珀酸钠-BSA检测线T线6和羊抗鼠IgG控制线C线7。
[0017]实施例2
所述检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条的制备方法，步骤为:
(1)可同时识别甲砜霉素、氯霉素和氟苯尼考的单克隆抗体的制备与纯化:以甲砜霉素的类似物，即1-(4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇(TAP-NH2)作为半抗原,米用重氮化法将其与牛血清蛋白(BSA)偶联得到免疫原，混合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，经过三次亚克隆和间接竞争ELISA的筛选得到能稳定分泌可同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的细胞株，将其进行扩大培养后，注射到小鼠体内诱发产生腹水；采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水即得到单克隆抗体；
(2)检测抗原氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物的制备:将氯霉素琥珀酸钠与水溶性碳二亚胺EDC以摩尔比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-吗啡啉)MES缓冲溶液中，室温活化6h，之后将活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.01mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸钠的摩尔比为1: 40，室温反应12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物；
(3)胶体金溶液的制备:用朽1檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20-40nm胶体金颗粒；
(4)该单抗标记的胶体金溶液的制备:取步骤(3)制备的4mL胶体金调至pH9.0，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.lmg/mL的单克隆抗体0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1%，放置至少30min后，10000r/min离心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸盐缓冲液4mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液0.4mL重悬，得到稳定的单克隆抗体-胶体金标记物；
(5)小鼠血清-胶体金标记物的制备:将步骤(4)中的受体替换为阴性小鼠的纯化血清，重复步骤(4)，得到小鼠血清-胶体金标记物；
(6)硝酸纤维素膜的处理:将氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物和羊抗鼠IgG分别包被在作为反应垫的硝酸纤维素膜的检测线T线和控制线C线，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纤维素膜；
(7)三合一试纸条的组装:将样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5由一端依次黏附在PVC背衬I上，即得到用于检测的免疫层析试纸条。
[0018]应用实施例1
验证本发明的可靠性试验:(如图2-图4所示)
(I)用甲醇分别溶解甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考，分别得到浓度为lmg/mL的标准品母液，然后用0.01M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液分别进行梯度稀释，作为样品稀释液。图2中 l、0ppbTAP，2、0.5ppbTAP，3、lppbTAP，4、2.5ppbTAP ;图 3 中为 l、0ppbFF，2、IppbFF，3、2.5ppbFF，4、5ppbFF ;图 4 中为 l、OppbCAP，2、0.125ppbCAP，3、0.25ppbCAP，4、0.5ppbCAP，5、IppbCAP。
[0019](2)吸取待测样品溶液中100 μ L滴加到试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时；
(3)在滴加样品后3-5min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直于观察者正面；
(4)结果判断:如果在硝酸纤维素膜上仅有C线一条红线显现，表示检测结果为阳性；如果在硝酸纤维素膜上C线和T线两条红线都显现，表示检测结果为阴性；如果在硝酸纤维素膜上C线红线不显现，则表明试纸条已失效。
[0020]应用实施例2
(I)将纯牛奶与0.0lM PBS按1:9混合得到牛奶混合液。
[0021](2)检测时取100 μ L上述稀释液，滴加到试纸条的样品垫上，加样后开始计时。
[0022](3)在滴加样品后3_5min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直于观察者正面；
(4)结果判断:如果在硝酸纤维素膜上仅有C线一条红线显现，表示检测结果为阳性；如果在硝酸纤维素膜上C线和T线两条红线都显现，表示检测结果为阴性；如果在硝酸纤维素膜上C线红线不显现，则表明试纸条已失效。
[0023]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条，其特征在于:包括聚氯乙烯PVC背衬(1)，聚氯乙烯PVC背衬(I)前端设置样品垫(2)，样品垫(2)通过结合垫(3)与硝酸纤维素膜(4)前端连接，硝酸纤维素膜(4)后端与吸水垫(5)连接； 所述结合垫(3)上含有胶体金标记的单克隆抗体；硝酸纤维素膜(4)上包被有氯霉素琥珀酸钠-BSA检测线T线(6)和羊抗鼠IgG控制线C线(7)； 氯霉素琥珀酸钠-BSA是用于检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的抗原，检测线与质控线平行。
2.权利要求1中所述的试纸条所用的胶体金标记能同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的制备，其特征在于: 以甲砜霉素的类似物即1- (4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇TAP-NH2作为半抗原，采用重氮化法将其与牛血清蛋白BSA偶联得到免疫原，混合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞sp/20融合，经过三次亚克隆和间接竞争ELISA的筛选得到能稳定分泌可同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的细胞株，将其进行扩大培养后，注射到小鼠体内诱发产生腹水；采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水即得到单克隆抗体。
3.权利要求1所述检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于步骤为: (O同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的制备与纯化:如权利要求2所述； (2)检测抗原氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物的制备:将氯霉素琥珀酸钠与水溶性碳二亚胺EDC以摩尔比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-吗啡啉)MES缓冲溶液中，室温活化6h，之后将活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.0lmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸钠的摩尔比为1: 40，室温反应12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物； (3)胶体金溶液的制备:用朽1檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20-40nm胶体金颗粒； (4)该单抗标记的胶体金溶液的制备:取步骤(3)制备的4mL胶体金调至pH9.0，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.lmg/mL的单克隆抗体0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1%，放置至少30min后，10000r/min离心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸盐缓冲液4mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液0.4mL重悬，得到稳定的单克隆抗体-胶体金标记物； (5)小鼠血清-胶体金标记物的制备:将步骤(4)中的受体替换为阴性小鼠的纯化血清，重复步骤(4)，得到小鼠血清-胶体金标记物； (6)硝酸纤维素膜的处理:将氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物和羊抗鼠IgG分别包被在作为反应垫的硝酸纤维素膜的检测线T线和控制线C线，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纤维素膜； (7)三合一试纸条的组装:将样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)由一端依次黏附在PVC背衬(I)上，即得到用于检测的免疫层析试纸条。
4.根据权利要求1所述的检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条，其特征在于其对甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素的最低检测限分别是lng/mL，2.5ng/



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【文档编号】G01N33/577GK104237521SQ201410548219
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】匡华, 郭玲玲, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学