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一种检测cip清洗系统冲洗水中残留细菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测CIP清洗系统冲洗水中残留细菌的方法。包括如下步驟：（1）取至少3份CIP清洗系统冲洗水置于无菌试剂瓶中，分别量取不等量的CIP清洗系统冲洗水，分别经无菌滤膜进行过滤，过滤完毕后将无菌滤膜放入样品杯中，然后在无菌滤膜上滴加复合荧光试剂，再将样品杯置于ATP荧光检测仪中测定各荧光值；（2）分别量取与步骤（1）中等量的CIP清洗系统冲洗水，经无菌滤膜进行过滤，过滤完毕后洗脱无菌滤膜上的细菌，测定CIP清洗系统冲洗水中的菌落总数得到菌落总数与荧光值之间的标准曲线；（3）取待测的CIP清洗系统冲洗水，根据（1）得到荧光值，根据标准曲线即得到待测CIP清洗系统冲洗水中菌落总数。本发明方法对于测定方式的发明创新，简化了操作程序，减少了误差来源。
【专利说明】一种检测CIP清洗系统冲洗水中残留细菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测CIP清洗系统冲洗水中残留细菌的方法，属于食品安全检测方面微生物检测领域。
【背景技术】
[0002]食品加工企业，诸如乳品、饮料、酒类等行业在产品生产加工过程中需要涉及到设备、管道等的卫生清洗工作，任何一个环节的疏忽都可能带来难以挽回的经济损失和恶劣的社会影响。CIP (Cleaning In Place)就地清洗,是指不用拆开或移动装置，即采用高温、高浓度的洗净液，对设备装置加以强力作用，把与食品的接触面洗净，对卫生级别要求较严格的生产设备的清洗、净化，是近几年食品加工行业为适应大规模生产，符合高品质卫生要求，降低清洗成本而发展起来的清洗技术。随着食品企业现代化程度的逐步提高，CIP清洗系统未来将会应用到各类食品加工企业当中。CIP工作后要求要对气味、设备的视觉外观、微生物污染几个方面进行评定，其中微生物污染的检查是难点，也是食品加工的卫生关键控制点，如果清洗完毕之后CIP系统冲洗水中残留细菌过高，会对后期食品加工带来微生物污染的隐患，而且CIP过程后残留菌多为耐热菌，食品加工后期的高温灭菌措施也难以将其完全杀灭，因此，CIP系统冲洗水中残留菌的检测对于食品生产加工卫生管控具有重大的指导意义，必须严格控制。
[0003]CIP清洗效果要求达到微生物清洁度或无菌清洁度，根据调研，CIP过程完毕后，食品企业的内控指标要求CIP系统残留水中细菌总数低于菌落总数国标方法(GB4789.2)的检测范围，所以国标方法无法直接检测与评价CIP清洗后的微生物污染状况，所以要寻找其他的检测方法。目前行业内对CIP系统残留菌的检测方法有两种:一是大体积抽滤后再进行平板培养计数。此方法的优点是能够利用滤膜富集细菌，但是滤膜截留细菌依然要转入培养基上进行48小的培养，结果虽然较为准确，但是效率太低，CIP清洗之后不可能让加工设备闲置48小时等待测定结果。二是镜检法，此法也是与大体积抽滤结合，方法的优点是缩短了检测时间，然而镜检法把滤膜放在适量的无菌水中，摇动、振荡，然后再用显微镜检测洗脱水中微生物的数量，程序复杂易被外源微生物污染，在洗脱滤膜截留细菌及转移过程中带来的误差较大且难以避免。从上述方法可见，目前业内缺少测定CIP清洗水残留菌的标准方法，而替代方法也存在效率低或程序复杂操作误差较大的缺点，因此，仍有必要开发一种能够快速、准确、简单的检测CIP系统冲洗水中残留细菌的方法。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一种检测CIP清洗系统冲洗水中残留细菌的方法，本发明的方法能够快速测定CIP系统冲洗水等含菌量极低液体样品中残留细菌总数，能及时对CIP系统清洗效果进行评估、对卫生清洗工作进行指导。
[0005]本发明所提供的一种检测CIP清洗系统冲洗水中残留细菌的方法，包括如下步驟:[0006](I)取至少3份CIP清洗系统冲洗水置于无菌试剂瓶中，分别记为I号瓶、2号瓶和3号瓶；分别从所述I号瓶、2号瓶和3号瓶中量取不等量的CIP清洗系统冲洗水，分别经无菌滤膜进行过滤，过滤完毕后将所述无菌滤膜放入样品杯中，然后在所述无菌滤膜上滴加复合荧光试剂，再将所述样品杯置于ATP荧光检测仪中测定各荧光值；
[0007](2)分别从所述I号瓶、2号瓶和3号瓶中量取与步骤(I)中等量的CIP清洗系统冲洗水，经所述无菌滤膜进行过滤，过滤完毕后洗脱所述无菌滤膜上的细菌得到洗脱液，测定所述洗脱液中的菌落总数；进而得到菌落总数与荧光值之间的标准曲线；
[0008](3)取待测的CIP清洗系统冲洗水，经所述无菌滤膜进行过滤，过滤完毕后将所述无菌滤膜放入所述样品杯中，然后在所述无菌滤膜上滴加所述复合荧光试剂，再将所述样品杯置于所述ATP荧光检测仪中测定荧光值；然后根据所述荧光值与所述菌落总数之间的标准曲线即得到待测CIP清洗系统冲洗水中菌落总数。
[0009]上述的方法中，步骤(I)中，可分别从所述I号瓶、所述2号瓶和所述3号瓶中量取10mL、50mL和IOOmL所述CIP清洗系统冲洗水。
[0010]上述的方法中，步骤(I)中，所述无菌滤膜的孔径可为0.45 μ m。
[0011]上述的方法中，所述复合荧光试剂的主要成分为细菌裂解剂和荧光素酶，如中质赛福(北京)科技仪器有限公司生产的产品编号为ZF0011的复合突光试剂。
[0012]上述的方法中，步骤(2)中，洗脱所述无菌滤膜上的细菌的溶剂可为灭菌生理盐水。
[0013]本发明具有如下优点:
[0014]本发明首次提出并应用了膜上裂解、带膜测定的新方法。本发明方法对于测定方式的发明创新，简化了操作程序，在微生物检测的过程中，减少一步操作程序，就减少了一个误差来源。而对于企业来说该方法具有显著的经济效益方法(本发明能够让企业及时对CIP清洗的程序进行把控，快速检测还能缩短评估时间提高企业的生产效率，在保证清洗效果的同时最大限度的节约水、清洗液、电等资源，还能节省人力及培养基、培养设备等的投入，明显降低清洗成本。CIP清洗效果的及时把控，能够减少企业因清洗残留菌引起的产品微生物污染带来的浪费，减少浪费等同于创收。)，同时本发明还具有良好的社会效益(本发明能够帮助企业识别CIP清洗过程中的细菌残留，降低生产过程受微生物污染的可能性，对提高食品安全水平意义明显，食品安全状况的提高对于社会稳定意义重大。)与环境效益(本方法中不涉及有毒有害试剂，膜上裂解能够将细菌全部裂解，没有残留活菌，不会给操作人员带来危害，检测过程也没有副产物产生，监测器具及一次性耗材皆不用特殊处理也不会污染环境。)。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例1中测定的膜上荧光值(RLU)与待测液细菌总数线性关系图。【具体实施方式】
[0016]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0018]实施例1、CIP系统残留水中细菌总数的测定[0019]仪器及耗材:
[0020]ATP荧光检测仪(SR)012型)；
[0021]无菌注射器(IOmL?50mL)；
[0022]过滤器(可重复使用，先用75%酒精浸泡，用无菌水反复冲洗，无菌条件下晾干或烘干后备用)
[0023]镊子(塑料，塑料材质用酒精浸泡再用无菌水冲洗，晾干后备用)；
[0024]无菌滤膜(孔径:0.45 μ m,尺寸:直径13mm)；
[0025]复合荧光试剂(中质赛福(北京)科技仪器有限公司，产品编号为ZF0011 )，该复合荧光试剂的主要成分为细菌裂解剂和荧光素酶。
[0026]玻璃试管(灭菌后装5mL无菌生理盐水备用)；
[0027](I)标准曲线的制定
[0028]取CIP系统最后一道程序完结后的水作为检测对象，用5个500mL无菌试剂瓶，编号1、2、3、4和5，接待测水储存备用。取10个过滤器，用镊子将无菌滤膜放入过滤器，安装好备用。用注射器吸取I号瓶中水10mL，用安装好的无菌滤膜和过滤器进行过滤，过滤完毕将无菌滤膜用镊子取出放入清洗好的样品杯中，在无菌滤膜上滴加复合荧光试剂，放入ATP荧光检测仪中测定其荧光值，再用同一注射器再取I号瓶中水IOmL过滤，过滤完毕用无菌镊子将滤膜取出放入装有5mL灭菌生理盐水的玻璃试管中震荡洗脱细菌，然后按照GB47892-2010方法检测菌落总数。
[0029]然后分别从2号瓶中取50mL，3号瓶中取100mL，4号瓶中取150mL，5号瓶中取200mL,按照上述操作步骤分别测定各荧光值和菌落总数，将五组对应数据做线性回归分析得到标准曲线方程Y=aX+b，其中Y代表测得荧光值，X代表菌落总数值(CFU/mL)。
[0030]( 2)样品的测定与计算
[0031]取50mL待测水用安装好的无菌滤膜和过滤器过滤，过滤完毕将无菌滤膜用镊子取出放入清洗好的样品杯，在无菌滤膜上滴加复合荧光试剂，放入ATP荧光检测仪中测定荧光值，得荧光值Y，将Y值带入上述标准曲线方程，即可按照稀释倍数算出该样品中细菌总数含量。
[0032]为了验证本方法的可操作性和准确性，选择了一家乳品企业实地验证。按照上述操作方法进行测定。
[0033]试验参数:
[0034]浓缩:I号空白IOmL无菌水浓缩,2号IOmL待测水浓缩,3号IOOmL待测水浓缩,4号200mL待测水浓缩。
[0035]洗脱参数:5mL无菌生理盐水洗脱。
[0036]结果如表I所示:
[0037]表I实际样品测定结果分析-1
【权利要求】
1.一种检测CIP清洗系统冲洗水中残留细菌的方法，包括如下步驟: (O取至少3份CIP清洗系统冲洗水置于无菌试剂瓶中，分别记为I号瓶、2号瓶和3号瓶；分别从所述I号瓶、2号瓶和3号瓶中量取不等量的CIP清洗系统冲洗水，分别经无菌滤膜进行过滤，过滤完毕后将所述无菌滤膜放入样品杯中，然后在所述无菌滤膜上滴加复合荧光试剂，再将所述样品杯置于ATP荧光检测仪中测定各荧光值； (2)分别从所述I号瓶、2号瓶和3号瓶中量取与步骤(I)中等量的CIP清洗系统冲洗水，经所述无菌滤膜进行过滤，过滤完毕后洗脱所述无菌滤膜上的细菌，测定CIP清洗系统冲洗水中的菌落总数；进而得到菌落总数与荧光值之间的标准曲线； (3)取待测的CIP清洗系统冲洗水，经所述无菌滤膜进行过滤，过滤完毕后将所述无菌滤膜放入所述样品杯中，然后在所述无菌滤膜上滴加所述复合荧光试剂，再将所述样品杯置于所述ATP荧光检测仪中测定荧光值；然后根据所述荧光值与所述菌落总数之间的标准曲线即得到待测CIP清洗系统冲洗水中菌落总数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，分别从所述I号瓶、所述2号瓶和所述3号瓶中量取10mL、50mL和IOOmL所述CIP清洗系统冲洗水。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述无菌滤膜的孔径为0.45 μ m0
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于:所述复合荧光试剂的主要成分为细菌裂解剂和荧光素酶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，洗脱所述无菌滤膜上的细菌的溶剂为生理盐水。
【文档编号】G01N21/64GK103776807SQ201410030608
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】侯玉柱, 宋全厚, 尹建军, 柯润辉, 张力, 田雨 申请人:中国食品发酵工业研究院