番茄溃疡病菌有活力菌体的流式细胞术计数方法
【专利摘要】本发明公开了一种番茄溃疡病菌有活力菌体的流式细胞术计数方法。本发明公开一种检测待测样品中有活力菌体的方法，包括如下步骤：将待测样品进行SYTO9染色，使用绝对计数管计数，得到待测样品的总细胞数或总细胞浓度。本发明公开的流式细胞仪结合绝对计数管的方法，实现了番茄溃疡病菌的快速、准确定量，解决了有活力的番茄溃疡病菌的定量检测问题，该方法既可用于番茄溃疡病菌的基础微生物学研究，又可应用于农业生产中病原物的检测、病害诊断和植物检疫工作中，在微生物学及植物保护领域应用前景广阔。
【专利说明】番茄溃疡病菌有活力菌体的流式细胞术计数方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种活力菌体的计数方法，特别是涉及一种番茄溃疡病菌有活力菌体的流式细胞术计数方法，属于微生物学与植物保护学交叉领域。
【背景技术】
[0002]番爺溃瘍病是番爺生产中最为严重、具有毁灭性的病害之一。该病于1909年在美国密执安州的温室番茄上首次发现。20世纪30年代、60年代、80年代，该病先后在美国中西部地区、北卡罗来那州及加拿大安大略地区大流行，造成的产量损失最高达80%以上。1943-1946年期间，该病在英国大流行，使番茄罐头产业受到严重影响。目前，世界上60多个国家报道了该病的发生�：Γ榧懊乐�、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲。
[0003]我国于1954年首次有番茄溃疡病的记载。目前，该病害在北京、天津、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、新疆、甘肃、宁夏、青海、四川、云南、广西、海南、河北、山西、山东、河南、安徽、上海等省、市、自治区都有发生，番茄产业受到了不同程度的影响。2007年该病原菌被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。
[0004]目前，生产上常用铜制剂或抗生素来防治番茄溃疡�。Ч⒉焕硐�。开展种子健康检测，从源头上控制带菌种子进入生产环节，或是在生产中及早发现并清除病株，是防治番茄溃疡病的有效手段。因此，快速、特异性定量检测有活力的番茄溃疡病菌是种子带菌检测的关键，也是生产中亟待解决的问题。
[0005]在当前种子或植物材料携带有活力番茄溃疡病菌的检测中，基于选择性培养基分离培养的B1-PCR方法是被广泛采用的标准方法，但该方法不能用于检测处于损伤(injure)状态或不可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态的番爺溃瘍病菌，因此可能造成假阴性的结果，给生产带来潜在风险。
[0006]流式细胞术结合Live/Dead BacLight试剂盒的方法能够区分细菌的活细胞和死细胞。该方法将两种核酸染料SYT09和碘化丙啶(PI)混合使用，对细菌菌体进行染色，判断细胞的活性，其原理是SYT09可以穿过完整的细胞膜，进入菌体内与核酸结合而呈现绿色荧光。PI只能通过破损的细胞膜进入菌体结合核酸而呈现红色荧光。若使用SYT09和PI对细胞进行双染，呈现绿色荧光的细胞则为有活性的细胞。随后，将染色后的细菌经过流式细胞仪计数，从而实现定量检测有活力的细菌菌体。但由于番茄溃疡病菌菌体较小、细胞壁偏厚，使用现有的试剂盒并按照说明书提供的方法，并不能很好地区分有活力和失活的菌体。因此，在现有方法的基础上通过研究和改进，筛选和调整染料和染色方法，获得有活力番茄溃疡病菌的计数方法，实现对该病原菌有活力菌体的快速计数，对在生产中控制番茄溃疡病的传播蔓延和发生�：哂兄匾庖�。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种番茄溃疡病菌有活力菌体的流式细胞术计数方法。
[0008]本发明提供一种检测待测样品中有活力菌体的方法，包括如下步骤:将待测样品进行SYT09染色，使用绝对计数管计数，得到待测样品的总细胞数或总细胞浓度；将待测样品进行PI染色，使用绝对计数管计数，得到待测样品的死细胞数或死细胞浓度；用待测样品的总细胞数减去待测样品的死细胞数得到待测样品中有活力菌体的细胞数，或，用待测样品的总细胞浓度减去待测样品的死细胞浓度得到待测样品中有活力菌体的浓度。
[0009]上述方法中，所述使用绝对计数管计数是采用流式细胞仪结合绝对计数管进行计数的。
[0010]上述任一所述的方法中，所述流式细胞仪的FSC电压模式为E00，SSC电压为440V，放大模式为Log型，进样速度为中速。
[0011]上述任一所述的方法中，所述将待测样品进行SYT09染色，使用绝对计数管计数时，流式细胞仪检测时以FLl (530/30nm)作为检测通道，电压为640V。
[0012]上述任一所述的方法中，所述将待测样品进行PI染色，使用绝对计数管计数时，流式细胞仪检测时以FL2 (585/42nm)作为检测通道，电压为625V。
[0013]上述任一所述的方法中，所述待测样品中菌的浓度为105_107CFU/ml。
[0014]上述任一所述的方法中，所述SYT09染色时SYT09在所述待测样品中的浓度为50 μ mol/L ；
[0015]所述SYT09染色时染色时间为20-40min，具体为30min。
[0016]上述任一所述的方法中，所述PI染色时PI在所述待测样品中的浓度为150μπιο1/L ；
[0017]所述PI染色时染色时间为30-60min，具体为50_60min，再具体为60min。
[0018]上述任一所述的方法中，所述菌为番茄溃疡病菌。
[0019]上述任一所述的方法中，所述待测样品为番茄溃疡病菌菌悬液。
[0020]本发明采用流式细胞仪结合绝对计数管的方法，实现了番茄溃疡病菌的快速、准确定量，解决了有活力番茄溃疡病菌的定量检测问题，该方法既可用于番茄溃疡病菌的基础微生物学研究，又可应用于农业生产中病原物检测、病害诊断和植物检疫工作中，在微生物学及植物保护领域应用前景广阔。本发明的方法可以间接应用在病害的源头控制上，减少化学农药的喷施，具有降低农药公害和保护生态的作用；可减少农业生产成本，具有一定的经济效益；服务于社会，具有显著的生态效益和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为流式细胞仪检测法与平板计数法对番茄溃疡病菌检测的相关性。
[0022]图2为流式细胞仪计数结果与番茄溃疡病菌样品稀释倍数的相关性。
[0023]图3为SYT09染色的番茄溃疡病菌的流式细胞检测图(FSC通道)。
[0024]图4为SYT09染色的番茄溃疡病菌的流式细胞检测图(FLl通道)。
[0025]图5为SYT09染色的番茄溃疡病菌的流式细胞检测图(FL2通道)。
[0026]图6为SYTO BC和SYTO 9对番茄溃疡病菌的染色效果。
[0027]图7为PI染色的番茄溃疡病菌死细胞的流式细胞检测图(FSC通道)。
[0028]图8为PI染色的番茄溃疡病菌死细胞的流式细胞检测图(FLl通道)。
[0029]图9为PI染色的番茄溃疡病菌死细胞的流式细胞检测图(FL2通道)。
[0030]图10为PI对番茄溃疡病菌死细胞的染色效果。
[0031]图11为空白对照的流式细胞检测图(FSC通道)。
[0032]图12为空白对照的流式细胞检测图(FLl通道)。
[0033]图13为空白对照的流式细胞检测图(FL2通道)。
[0034]图14为激光共聚焦显微镜对SYTO 9 (A)和PI (B)染色的番茄溃疡病菌的荧光信号观察。
[0035]图15为SYT09和PI混合后对番茄溃疡病菌进行双染的流式细胞仪检测图。
[0036]上述流式细胞仪检测图中的Rl区域是绝对计数管中微球的位置，R2区域是番茄溃疡病菌的位置，R3区域是SYTO染色呈阳性的位置，R4区域是PI染色呈阳性的位置。
【具体实施方式】
[0037]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]番爺溃瘍病菌(Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis)在文献“罗来鑫，李健强，Hasan Bolkan.番茄细菌性溃疡病苗期接种新方法的研究[J].植物病理学报，2005，35(2):123-128.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0040]SYTO 9 购自 Life technologies 公司。
[0041]SYTO BC 购自 Life technologies 公司。
[0042]PI 购自 Life technologies 公司。
[0043]绝对计数管购自BD B1sciences公司。
[0044]流式细胞仪BD FACSCalibur 购自 BD B1sciences 公司。
[0045]实施例1、番茄溃疡病菌的绝对计数
[0046]—、挑取活化的番茄溃疡病菌单菌落，添加到1mL LB液体培养基中，置于28°C、140rpm振荡培养22h至对数生长后期；
[0047]二、取Iml步骤一培养得到的菌液于12000rpm离心3min,收集菌体，用
0.85g/100ml的NaCl水溶液洗涤2次后，再用0.85g/100ml的NaCl水溶液制备不同稀释倍数的番茄溃疡病菌菌悬液；
[0048]三、取各稀释度的菌悬液300μ 1，采用平板计数法进行涂板计数，将涂板后的LB平板置于28°C培养3d，选取合适浓度的平板进行计数，浓度换算公式如下:
[0049]
菌落数(CFU) /皿X稀释倍数细菌浓度(CFU/ml)=-
涂板液体积(ml)
[0050]四、将稀释液的剩余700 μ I加入到绝对计数管中，采用流式细胞仪对细胞进行检测，通过调整流速、各检测通道的电压、细胞位置等参数，实现对番茄溃疡病菌的绝对计数，
浓度换算公式如下:
[0051]
Η检测到的细胞数(cell) X管中微球数细菌浓度(cell/ml)=-
检测到的微球数X细胞液体积(ml)
[0052]流式细胞仪的检测参数设置为:FSC电压模式为E00，SSC电压为440，放大模式为Log型,进样速度为中速。
[0053]以图4为示例图，纵坐标SSC通道检测值反应了细胞的密度，横坐标FSC通道检测细胞的大�。琑l区域为绝对计数管中的微球所在的位置，R2区域为番茄溃疡病菌所在的位置。
[0054]以平板计数法浓度为横坐标，FCM计数浓度为纵坐标作图，结果如图1所示。
[0055]图1表明，与Line One相比较，Line Two表明流式细胞仪对番茄溃疡病菌的最佳计数范围为105-107CFU/ml，在此范围内，流式细胞仪的计数结果与平板法的计数结果的相关性好，相关系数R2为0.9955。
[0056]流式细胞仪的计数结果与稀释倍数的相关性如图2所示，相关系数R2为0.9996。
[0057]实施例2、番茄溃疡病菌的活菌检测
[0058]在不同的染色条件下，用实施例1的方法对番茄溃疡病菌进行绝对计数，并与平板计数法的结果进行比较，根据相关性确定适合的染料种类、染料比例、染色时间、流式细胞仪参数等。
[0059]利用实施例1的流式细胞检测条件(流式细胞仪的型号为BD FACSCalibur，流式细胞仪的检测参数设置为=FSC电压模式为E00，SSC电压为440V，放大模式为Log型，进样速度为中速)进行下述步骤一和二的实验。
[0060]一、筛选文献中已报道的用于细菌活力检测的核酸染料，选用SYTO 9和SYTO BC分别对番茄溃疡病菌染色，设置染料在菌液中的终浓度为50 μ mol/1，细菌在菌液中的终浓度为107CFU/ml (105-107CFU/ml均可)，染色时间设置为20min、30min、40min，用流式细胞仪收集5000个细胞(R2区域有5000个细胞)，流式细胞仪检测时以FLl (530/30nm)作为检测通道，电压为640V。
[0061]SYT09染色的番茄溃疡病菌的流式细胞检测图(FSC通道)如图3所示。
[0062]SYT09染色的番茄溃疡病菌的流式细胞检测图(FLl通道)如图4所示。
[0063]SYT09染色的番茄溃疡病菌的流式细胞检测图(FL2通道)如图5所示。
[0064]其中，FL2通道为 585/42nm。
[0065]其中图3和图4为SYTO 9染色的示例图，R3区域显示的是SYTO 9染色呈阳性的细菌。
[0066]SYTO 9和SYTO BC的染色结果如图6所示。图6中，横坐标为染色时间，纵坐标为SYTO染色呈阳性的细胞比例，即R3区域检测到的细胞数占R2区域检测到的细胞数的比值。
[0067]图6表明，在不同的染色时间下，SYTO 9对番茄溃疡病菌的染色效果均显著优于SYTO BC，最佳染色时间为30min。
[0068]其中SYTO 9阳性的细菌浓度(cell/ml)可按照如下公式进行计算:
[0069]
_R3区域检测到的细胞数(cell) X管中微球数细菌浓度(celL/mj)=-
Rl区域检测到的微球数X细胞液体积(ml)
[0070]二、选用PI对死细菌(番茄溃疡病菌经80°C加热20min)染色，设置染料在菌液中的终浓度为150 μ mol/1，死细菌在菌液中的终浓度为107CFU/ml (15-107CFU/ml均可)，染色时间设置为30min、40min、50min、60min，收集5000个细胞(R2区域有5000个细胞)，流式细胞仪检测时以FL2 (585/42nm)作为检测通道，电压为625V。
[0071]PI染色的番茄溃疡病菌死细胞的流式细胞检测图(FSC通道)如图7所示。
[0072]PI染色的番茄溃疡病菌死细胞的流式细胞检测图(FLl通道)如图8所示。
[0073]PI染色的番茄溃疡病菌死细胞的流式细胞检测图(FL2通道)如图9所示。
[0074]其中，FLl通道为 530/30nm。
[0075]其中图7和图9为PI染色的示例图，R4区域显示的是PI染色呈阳性的细菌。
[0076]PI的染色结果如图10所示。图10中，横坐标为染色时间，纵坐标为PI染色呈阳性的细胞比值，即R4区域检测到的细胞数占R2区域检测到的细胞数的比值。
[0077]图10表明，在不同的染色时间下，PI对番茄溃疡病菌死菌的最佳染色时间为50_60mino
[0078]其中PI阳性的细菌浓度(cell/ml)可按照如下公式进行计算:
[0079]
R4区域检测到的细胞数(cell) X管中微球数细菌浓度(ccll/ml)=-
Rl区域检测到的微球数X细胞液体积(nil)
[0080]三、利用实施例1的流式细胞检测条件(流式细胞仪的型号为BD FACSCalibur,流式细胞仪的检测参数设置为=FSC电压模式为E00，SSC电压为440V，放大模式为Log型，进样速度为中速)和本实施例的步骤一和步骤二筛选出的染色条件(SYT0 9终浓度为50μπιΟ1/1，细菌终浓度为107CFU/ml，染色时间为30min，流式细胞仪检测时以FLl (530/30nm)作为检测通道，电压为640V ;PI终浓度为150 μ mol/1，细菌终浓度为107CFU/ml，染色时间为60min，流式细胞仪检测时以FL2 (585/42nm)作为检测通道，电压为625V)，分别用SYTO 9或PI对同一个人工制备的活、死细胞混合的番茄溃疡病菌样品(其中未处理的菌和加热致死的菌的数量比为1:1，制备时为同一番茄溃疡病菌样品，一半不做处理，一半经80°C加热20min成死细胞，再混合)进行染色，流式细胞仪收集5000个细胞，并以不进行任何染色的番茄溃疡病菌作为空白对照。
[0081]活细菌浓度计算公式如下:
[0082]有活力的细菌浓度(cell/ml) = SYTO 9阳性的细菌浓度(cell/ml)-PI阳性的细菌浓度(cell/ml)
[0083]结果如表I所示，表I中，未处理的细胞和死细胞样品的总细胞、死细胞的浓度均是分别通过步骤二的SYT09染色、PI染色检测得到的，可培养的细胞浓度是通过平板计数法得到的。混合样品中总细胞、死细胞的浓度的理论值是根据未处理的细胞和死细胞样品的总细胞、死细胞、可培养细胞的浓度计算得到的；检测值是分别通过步骤二的SYT09染色、PI染色检测得到的，可培养细胞浓度是通过平板计数法得到的。
[0084]表I流式细胞仪检测活、死细胞混合的番茄溃疡病菌样品
[0085]
【权利要求】
1.一种检测待测样品中有活力菌体的方法，包括如下步骤:将待测样品进行SYT09染色，使用绝对计数管计数，得到待测样品的总细胞数或总细胞浓度；将待测样品进行PI染色，使用绝对计数管计数，得到待测样品的死细胞数或死细胞浓度；用待测样品的总细胞数减去待测样品的死细胞数得到待测样品中有活力菌体的细胞数，或，用待测样品的总细胞浓度减去待测样品的死细胞浓度得到待测样品中有活力菌体的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述绝对计数管计数是采用流式细胞仪结合绝对计数管进行计数的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述待测样品中菌的浓度为105-107CFU/ml。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述SYT09染色时SYT09在所述待测样品中的浓度为50 μ mol/L ； 所述SYT09染色时染色时间为20-40min，具体为30min。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述PI染色时PI在所述待测样品中的浓度为150 μ mol/L ； 所述PI染色时染色时间为30-60min，具体为50_60min，再具体为60min。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述菌为番茄溃疡病菌。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述待测样品为番茄溃疡病菌菌悬液。
【文档编号】G01N15/14GK104181093SQ201410400015
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】罗来鑫, 蒋娜, 李健强, 许新, 刘西莉, 曹永松, 阮小珀 申请人:中国农业大学
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