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专利名称：一种提高乳胶凝集试验狂犬病中和抗体检测灵敏度的方法
技术领域：
本发明为一种提高乳胶凝集试验狂犬病中和抗体检测灵敏度的方法，即利用抗犬和人IgG Fe片段单克隆抗体致敏聚苯乙烯微球,分别与等体积犬或人血清感作,再与等体积狂犬病病毒糖蛋白结合，用于检测人和犬血清狂犬病中和抗体滴度；属于生物工程技术领域。
背景技术：
犬是我国狂犬病流行的贮存和传播宿主，人是狂犬病的最主要受害者。因此，提高犬暴露前免疫和人暴露后治疗效果，是阻断狂犬病流行的根本措施。狂犬病中和抗体滴度是衡量机体免疫保护水平的最重要指标。人和动物血清狂犬病中和抗体水平达到0.5 IU/ml以上时，即可获得完全保护。 目前，用于狂犬病中和抗体定量检测的标准方法有小鼠脑内中和试验、蚀斑抑制试验、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)和荧光抗体病毒中和试验(FAVN)等，其中RFFIT法和FAVN法分别是WHO和OIE推荐的标准方法。但是，这些检测方法所需时间较长(一般在48h以上)，操作复杂(需要使用活病毒和动物、细胞)，而且检测成本高。为了改进这些方法，不同的实验室和研究人员分别建立了酶联免疫吸附试验和乳胶凝集试验等方法。其中，ELISA方法操作简便、灵敏度高，但需要相关仪器进行结果判定，适用于实验室检测；乳胶凝集试验则不同，不依赖特殊仪器，操作更加简捷，既适用于实验室操作，也可用于临床样品的现场检测，但是存在检测灵敏度低的缺点，一般只能检测2IU/ml 以上的抗体水平(Madhusudana SN等，2003)。

发明内容
本发明涉及一种提高乳胶凝集试验狂犬病中和抗体检测灵敏度的方法，解决了传统乳胶凝集试验测定抗原灵敏度低的问题。本发明公开的一种提高乳胶凝集试验狂犬病中和抗体检测灵敏度的方法，采用以下技术解决方案
利用等量抗犬和人IgG Fe片段单克隆抗体同时致敏聚苯乙烯微球，再与等体积的犬或人狂犬病血清感作，然后与狂犬病病毒糖蛋白结合，用于检测犬和人血清中狂犬病病毒中和抗体滴度。当抗体滴度>0.1 IU/ml时，会出现明显的凝集现象，否则不凝集。
本发明提供的提高乳胶凝集试验狂犬病中和抗体检测灵敏度的方法，包括以下步骤
I)抗犬和人IgG Fe片段单克隆抗体的制备
利用木瓜蛋白酶消化犬和人lgG，获得其Fe片段；分别取0. 2mg Fe片段腹腔免疫BALB/c小鼠；取免疫小鼠的脾细胞，通过聚乙二醇与SP2/0细胞融合，筛选单克隆抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；取IO6杂交瘤细胞，注射到小鼠腹腔，制备腹水；经亲和层析纯化后，分别获得抗Fe片段单克隆抗体；2)单克隆抗体致敏聚苯乙烯微球
分别取Img抗犬和人IgG Fe单克隆抗体,混勻，与5mg聚苯乙烯微球,均勻分散于Iml碳酸盐缓冲液(pH9. 5)，4°C静置12h后，5000rpm离心lOmin，弃上清，用0. 5ml PBS(pH7. 4)
重悬沉淀；
3)与血清抗体结合
取25M1犬和人血清分别等体积与致敏微球混勻，37°C感作15min, 5000rpm离心IOmin,弃上清，用50W PBS (pH7. 4)重悬沉淀；
4)抗体检测
取25沿(1呢)狂犬病病毒糖蛋白，分别与25W感作后的微球混匀，加到载玻片上，37°C 感作15min。当抗体滴度> 0. I IU/ml时,会出现明显的凝集现象,否则不凝集。本发明具有以下特点
1、IgGFe片段的蛋白序列高度保守，抗犬和人IgG Fe片段单克隆抗体可以特异性识别犬和人的IgG抗体，因此敏感性和特异性较高；
2、乳胶凝集反应实质上发生了两次凝集，即先发生抗体与抗-抗体结合，在此基础上再发生与抗原的凝集，从而使少量抗体也能形成明显的凝集。发明的积极效果在于通过抗犬和人IgG Fe片段的单克隆抗体放大了乳胶凝集试验的检测信号，在有效提高了乳胶凝集试验检测狂犬病中和抗体灵敏度的同时，利用狂犬病病毒中和性保护抗原(糖蛋白)保证了中和抗体检测的准确性。


图I检测0. I IU/ml犬样品凝集效果 图2检测0. I IU/ml人样品凝集效果。具体实施方案
下面结合实施例，对本发明做进一步描述。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例I
针对犬和人IgG Fe片段单抗的制备
(I)犬和人IgG的提取
取犬和人血清各100毫升，分别用等量100毫升生理盐水稀释，加入等量(200毫升)饱和硫酸铵溶液，室温沉淀30分钟，3000r/min离心30分钟，弃上清，沉淀以少量生理盐水溶解；加入等量的33%饱和的硫酸铵，同上步骤沉淀一次。沉淀以5ml生理盐水溶解后，装入透析袋，用蒸馏水透析12小时，中间换水两次，再用pH7. 2,0. OlM PBS透析12小时。(2)犬和人IgG Fe片段的制备
pH7. 2、0. OlM PBS将透析后的IgG稀释为100mg/ml，分别加入1000U木瓜蛋白酶，37°C消化2小时。将消化的溶液通过SPA-resin层析柱，洗脱Fe片段。(3)犬和人IgG Fe片段单抗杂交瘤的建立制备
分别将Fe片段(2mg/ml)和福氏完全佐剂等体积混匀，按0. 2mg/只腹腔注射BALB/c小鼠，随后将Fe片段与福氏不完全佐剂等体积混合，同剂量再免疫2次，每次间隔10天。最后一次免疫后3天，取I X IO7个脾细胞与I X IO6个SP2/0细胞混悬于600W聚乙二醇4000中融合lmin,加入20ml无血清RPMI-1640培养基，IOOOrpm离心Imin,去上清,用IOOml含10%血清和HAT的RPMI1640培养基重悬细胞，加入96孔细胞板，200W/孔，37°C 5%C02培养。10天后待出现单个细胞集落时，取适量细胞培养上清进行ELISA检测，阳性者即为单抗分泌阳性杂交瘤细胞。ELISA检测步骤用pH9. 6碳酸盐缓冲液(NaHCO3 2. 93g，Na2CO3 I. 95g，加蒸馏水至1000ml)稀释纯化的IgG Fe片段至5Pg/ml，按100W/孔4°C致敏96孔酶标板10小时，用含5%脱脂奶粉的碳酸盐缓冲液37°C封闭 2小时，用含0. 05%吐温-20的PBS洗板3次，按100W/孔加入待检细胞上清，37°C感作I小时，用含0. 05%吐温-20的PBS洗板3次，按100W/孔加入工作浓度小鼠IgG酶标二抗，37°C感作I小时，用含0. 05%吐温-20的PBS洗板3次，按100耵/孔加入TMB显色液，37°C感作15min,按100W/孔加入加入2M H2SO4终止反应，利用酶联检测仪测定OD45tol值。取高于最低OD值孔两倍以上的细胞孔作为阳性。(4)犬和人IgG Fe片段单抗的制备和纯化
收集扩大培养细胞的上清，通过亲和层析柱进行纯化，洗脱后，备用。亲和层析步骤取Amersham公司的Sepharose 4FF IgG亲和层析柱(装量Iml),以5ml 的 0. IM Tris (pH8. 0)平衡 3 次；加 IM Tris (pH8. 0)0. Iml 到 0. 9ml 待纯化液体内调节PH值，排空层析柱，柱内加入上述待纯化液体1ml，混匀后2V 8°C放置30min，期间混匀3次；排空层析柱，以5ml的0. IM Tris (pH8. 0)洗涤5次，排空柱内液体；以5ml的0. OlMTris (pH8. 0)洗涤5次，排空柱内液体；以0. IM甘氨酸溶液(pH3. 0)1. 8ml洗脱层析柱，回收物滴入盛有0. 2ml IM Tris (pH8. 0)的瓶内，此即为纯化的IgG抗体；将纯化的IgG抗体装入透析袋中，以0. IM PBS (pH7. 2)透析过夜，-20°C保存备用。实施例2 聚苯乙烯微球的致敏
用PH9. 6碳酸盐缓冲液分别稀释犬和人IgG Fe片段单克隆抗体至lmg/ml，等体积混匀后,加入2. 5mg聚苯乙烯微球(直径0. 8Mm)混合,4°C感作过夜。次日，5000rpm离心IOmin,取上清，经紫外分光光度计280nm检测蛋白浓度彡0. 5mg/ml时，致敏合格。将沉淀重悬于含5%脱脂奶粉的碳酸盐缓冲液，37°C封闭2小时。5000rpm离心lOmin，弃上清，0. 5ml 0. IMPBS (pH7.2)重悬，4°C保存。实施例3
乳胶凝集试验检测犬狂犬病中和抗体的灵敏度
取狂犬病标准血清(法国食品卫生安全署提供)，用PBS (pH7. 2)连续稀释为2、1、0. 5、0. 2,0. 1,0. 05 IU/ml，取无狂犬病免疫史的犬血清作为阴性血清。用pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释狂犬病病毒糖蛋白至lmg/ml，加入2. 5mg聚苯乙烯微球(直径0. 8Mm)混合，4°C感作过夜。次日，5000rpm离心lOmin，取上清，经紫外分光光度计280nm检测蛋白浓度彡0. 5mg/ml时，致敏合格。将沉淀重悬于含5%脱脂奶粉的碳酸盐缓冲液，37°C封闭2小时。5000rpm离心lOmin，弃上清，0. 5ml 0. IM PBS (pH7. 2)重悬，用于常规乳胶凝集试验检测。检测步骤取25沿致敏微球，分别与不同血清样品等体积混合，滴加在载玻片上，置37°C湿盒内感作15min，肉眼观察凝集效果(图I)。改良乳胶凝集试验检测步骤取25W致敏微球，与25W血清混合，置离心管内37°C湿盒内感作15min后，取出25W再分别1呢狂犬病病毒糖蛋白等体积混合，滴加在载玻片上，置37°C湿盒内感作15min，肉眼观察凝集效果(图I)。检测结果如表I所示，常规乳胶凝集试验最低能检测到2 IU/ml的狂犬病中和抗体，改良乳胶凝集试验最低能检测到0. I IU/ml的狂犬病中和抗体。表I犬血清乳胶凝集试验检测灵敏度
权利要求
1.一种提高乳胶凝集试验狂犬病中和抗体检测灵敏度的方法，其特征为利用抗犬和人的IgG Fe片段单克隆抗体等量共同致敏聚苯乙烯微球，分别与等体积的犬或人血清感作，再与狂犬病病毒糖蛋白结合后发生凝集反应，用于提高乳胶凝集试验法检测人和犬血清狂犬病中和抗体滴度的灵敏性。
2.如权利要求I所述提高乳胶凝集试验狂犬病中和抗体检测灵敏度的方法，包括以下步骤 1)抗犬和人IgGFe片段单克隆抗体的制备 利用木瓜蛋白酶消化犬和人lgG，获得其Fe片段；分别取0. 2mg Fe片段腹腔免疫BALB/c小鼠；取免疫小鼠的脾细胞，通过聚乙二醇与SP2/0细胞融合，筛选单克隆抗体分泌阳性的杂交瘤细胞；取106杂交瘤细胞，注射到小鼠腹腔，制备腹水；经亲和层析纯化后，分别获得抗犬和人IgG Fe片段单克隆抗体； 2)单克隆抗体致敏聚苯乙烯微球 分别取Img抗犬和人IgG Fe单克隆抗体,混勻，与5mg聚苯乙烯微球均勻分散于Iml碳酸盐缓冲液(pH9. 5)，4°C静置12h后，5000rpm离心lOmin，弃上清，用0. 5ml PBS(pH7. 4)重悬沉淀； 3)与血清抗体结合 取25M1犬和人血清分别等体积与致敏微球混勻，37°C感作15min, 5000rpm离心IOmin,弃上清，用50W PBS (pH7. 4)重悬沉淀； 4)抗体检测 取25沿(1呢)狂犬病病毒糖蛋白，分别与25W感作后的微球混匀，加到载玻片上，37°C感作15min ;当抗体滴度> 0. I IU/ml时,会出现明显的凝集现象,否则不凝集。
全文摘要
本发明涉及一种提高乳胶凝集试验检测狂犬病中和抗体灵敏度性的方法。利用等量抗犬和人IgGFc片段单克隆抗体同时致敏聚苯乙烯微球，再与等体积的犬或人血清感作，然后与狂犬病病毒糖蛋白结合，用于检测犬和人血清中狂犬病病毒中和抗体滴度。当抗体滴度≥0.1IU/ml时，会出现明显的凝集现象，否则不凝集。
文档编号G01N33/577GK102749445SQ20121022049
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者刘晔, 张守峰, 张菲, 扈荣良, 连海 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所