专利名称：：胆红素测定冻干校正液及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种胆红素测定冻干校正液，同时，本发明还涉及一种胆红素测定冻干校正液的制备方法。
背景技术：
：胆红素的测定是检验医学中最常用的肝功能项目之一，在临床上它是诊断黄疸的存在以及其类别的重要手段和依据，使用频率很高。胆红素有四个组分即未结合胆红素、单葡萄糖醛酸结合胆红素和双葡萄糖醛酸结合胆红素，及与白蛋白共价结合的胆红素称为S-胆红素。通常我们把四个组分的总体，称总胆红素，把后三者称为直接胆红素。直接胆红素中的前二者又称作结合胆红素。测定胆红素的方法很多，其中最常用的有重氮试剂法、化学氧化法和酶法。这三种方法均采用分光光度法的原理，都用校正液作定量的依据。回顾校正液的历史，在上一世纪的50-60年代，曾经摹仿测量反应生成的颜色(红色)用色素、染料人工配成近似的比色系列，用肉眼或比色计测定。随着测定技术的进步，开始用自然存在的胆红素做成的溶液做成校正液(水溶液)。由于胆红素的不稳定性，这种校正液只能一次性使用，且由于胆红素的四个组分都各自有自己的的光学特征，共同只用此同一个校正液不尽合理。大概在80年代之后，出现用DTB(二牛磺酸胆红素)用作于直接胆红素的校正液。目前，市场上许多同类产品或是多种校正品复合，或是总直胆红素分开，与人体血清中胆红素的存在形式有差异，均不具备与人体内的一致性。近20年多随着自动化生化技术的快速发展，测定胆红素的校正液也发展很快，能和自动生化仪测胆红素配套使用的出现二种剂型一种是不冻的，一种是冻干型。前者呈液体状态，能在低温下保持一定时间的稳定，但在夏天在运输过程容易很快变质。而冻干型产品也只是具备生物材料一经冻干就自然稳定的水平，但残留水分高，一经复溶，出现浑浊，效价速降。因此，长期以来，在胆红素测定领域，人们期盼有一种稳定化、经济的产品的问世。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种接近人体血清中胆红素的存在形式、与人体内血清胆红素具有一致性，稳定化、经济的胆红素测定冻干校正液。本发明的另一目的在于提供一种胆红素测定冻干校正液的制备方法，该方法浓縮冻干血清的液量，减少了常规冻干过程的一半液量，制备出的胆红素测定冻干校正液残留水分低，性能更稳定。本发明的胆红素测定冻干校正液，原料组成为去除脂蛋白的健康人血清9298份、间接胆红素28份、直接胆红素820份、动物血清白蛋白100050000份、抗氧化剂10~100份、络合剂50~500份、防腐剂0.1~10份、赋形剂100050000份，以上均为重量份素数。其中优选去除脂蛋白的健康人血清9498份、间接胆红素35份、直接胆红素1113份、动物血清白蛋白300010000份、抗氧化剂1525份、络合剂150300份、防腐剂0.37份、赋形剂200040000份，以上均为重量份数。进一步优选去除脂蛋白的健康人血清96份、间接胆红素4份、直接胆红素12份、动物血清白蛋白3500份、抗氧化剂20份、络合剂200份、防腐剂0.5份、赋形剂3000份，以上均为重量份数。本发明所述间接胆红为间接反应胆红素，所述直接胆红素为直接反应胆红素，所述动物血清白蛋白为牛血清白蛋白，所述抗氧化剂为二巯基苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、盐酸联氨(H2NNH22HCL)中的一种或几种；所述的络合剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、乙二醇双(2-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)、氨三乙酸(NTA)中的一种或几种；所述防腐剂为抗菌素、柳硫汞、PC_300(通用商品名，市面有售)中的一种或几种；所述赋形剂为乳糖。校正液的基质，就是基础物质，水溶液，生理盐水，人工蛋白质溶液，动物血清，混合的健康人血清均可作冻干血清的基础原料。业内公认；只有采用健康人的混合血清作原料，基质效应最�。畎踩罘媳瓯炯觳庵械囊恢滦缘脑颉Ｎ颐堑幕释耆细�。采用除去血清中固有的脂蛋白的血清，使冻干品复溶后呈澄清透明状态。这样不仅降低了校正液的空白吸光度，还减少了干扰，更重要的是还原了人血清的透明原貌。由于血清中失去了脂蛋白导致白蛋白总量不足，为此我们添加动物血清白蛋白，如牛血清蛋白，可使澄清血清中白蛋白的含量达到常人的低水平，从而有利于胆红素的稳定。本校正液添加间接反应胆红素和直接反应胆红素制成总/直胆红素混合校正液，最接近人体血清中胆红素的存在形式。胆红素是具有四个吡咯环的还原性有机物。不稳定的实质就是被氧化，必需加入适当的抗氧化剂将它保护起来。抗氧化剂可为二巯基苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、盐酸联氨(H2NNH22HCL)中的一种或几种，我们优选为二巯基苏糖醇(DTT)。人血清中�：卸嘀止山鹗粼兀庑┪⒘吭卦谝欢ǖ奶跫露季哂醒趸浴ＭǔＮ颐峭ü尤胂嘤Φ穆绾霞烈猿フ庑┪⒘吭乜赡懿难趸裕龅穆绾霞量晌叶匪囊宜岫�(EDTA-Na2)、乙二醇双(2-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)、氨三乙酸(NTA)中的一种或几种，本发明优选乙二胺四乙酸二钠。人血清是各类细菌最好的培养基。一旦污染细菌，校正液的稳定性很快破坏。可加入的稳定性防腐剂可以是抗菌素、柳硫汞、PC-300等等。冻干制品通过加入不参与反应的赋形剂，使冻干层呈一个比较致密和完整的粉块，外形美观，开瓶不致丢失小粒，保证复溶的准确性。本发明赋形剂优选为乳糖。本发明的胆红素测定冻干校正液的方法，包括下述步骤a.提供合格的健康人血清，反复冻融数次至可见到血清上层大部分呈澄清状态，将上层血清分别用致密滤纸、0.4-0.8pm滤膜、再0.1-0.3nm滤膜过滤制得去脂蛋白血清；b.称取间接胆红素和直接胆红素，加入二甲亚砜或甲醇溶解，配以NaOH或Na2C03助溶至溶液透明；c.按去除脂蛋白的健康人血清9298份、间接胆红素28份、直接胆红素820份、动物血清白蛋白100050000份、抗氧化剂10~100份、络合剂50~500份、防腐剂0.1~10份、赋形剂100050000份重量份数配比，将间接胆红素和直接胆红素加入至去脂蛋白血清，混匀后，再按配比向血清中加入动物血清白蛋白、抗氧化剂、络合剂、防腐剂、赋形剂，每加入一种，充分摇匀溶解呈透明态；d.调整溶液pH达到7.0-8.5的范围内，调节氧化还原电极电位到100mV200mV;e.溶液分装至小瓶，经低温预冻后开始冻干，24h后取出，尽快(即越快越好)用橡胶塞封口，最后盖上外盖，即成产品。我们发现人血清中的脂蛋白，是冻干血清复溶后发生混浊的根本原因。我们采用反复冰冻-融解的方法可除去血清中固有的脂蛋白，使冻干品复溶后呈澄清透明状态。各种添加剂全部加入，充分混匀，调整pH达到7.0-8.5的范围及氧化还原电极电位到100mV200mV。这是一种用物理学方法保护胆红素的还原性，使其周围环境更加适合胆红素的稳定化保存。另外，本校正液通过严格的微孔过滤工艺，确保产品处于无菌状态，而使复溶液不污染，延长稳定时间；本校正液的冻干工艺，浓縮冻干血清的液量，复溶时还原。例如要生产200ml的产品，冻干前只用100ml的原料血清，其添加剂按200ml进行投料。冻干后在复溶时用200ml的水量，使校正液效价与用200ml血清冻干的完全相同。操作方法的这一改进，减少了冻干过程的一半液量，縮短了冻干时间并减轻冻干机的负荷，更重要的是可减少产品的残留水份，使产品能达到水份小于1.5%的优质指标。本发明胆红素测定冻干校正液为总/直胆红素混合校正液，接近人体血清中胆红素的存在形式、与人体内血清胆红素具有一致性，无基质效应，复溶后澄清透明，可持续3天以上，稳定性好；本校正液的冻干工艺，保证冻干品的残留水份小于1.5%,可以充分发挥出冻干品的性状稳定的特有优点。具体实施例方式实施例1取合格的健康人血清150ml，将原料血清置于塑料瓶中，置于-2(TC冰箱中12小时，再马上置于室温12小时，如此反复冻融7次至可见到血清上层大部分呈澄清状态。用吸管将上层小心分离，不使混淆；分别用致密滤纸、0.45pm滤膜、再0.22pm滤膜过滤，使之成为透明的无菌去脂蛋白血清。取上述血清96ml("96mg,血清密度和水密度接近)于200ml容量的三角烧瓶中备用。称取间接反应胆红素4mg，加0,2mol/L的Na2CO3溶液lml，充分混匀到无干粉漂浮于液面上，再加甲醇lml充分摇匀，至完全溶解透明；称取直接反应胆红素12mg，加水2ml混匀，至完全溶解透明。将间接反应胆红素和直接反应胆红素溶液加入至上述盛放去脂蛋白血清三角烧瓶中，混匀后，向血清中加入以下添加剂牛血清白蛋白5g二巯基苏糖醇25mg乙二胺四乙酸二钠150mg乳糖3gPC-3000.5mg每加入一种，应充分摇匀溶解呈透明态。调整溶液pH达到7.0-8.5的范围内，调节氧化还原电极电位到150mV，充分摇匀，2-8'C冰箱过夜，次日用0.45nm滤膜过滤后，以每瓶0.5ml分装棕色玻璃小瓶。分装好的小瓶经低温预冻后开始冻干，一般历时约24小时。然后将已冻干小瓶从冻干机中取出，尽快用橡胶塞封口，最后盖上外盖，即成产品。按适当比例随机抽取产品，分别用lml水复溶后，立即用性能优良的分析仪，用可量值溯源的参考品为模板，以参考方法进行准确定值，完成后贴上标签，完成产品包装。实施例2取合格的健康人血清150ml，将原料血清置于塑料瓶中，置于-2(TC冰箱中12小时，再马上置于室温12小时，如此反复冻融7次至可见到血清上层大部分呈澄清状态。用吸管将上层小心分离，不使混淆；分别用致密滤纸、0.45nm滤膜、0.22pm滤膜过滤，使之成为透明的无菌去脂蛋白血清。取上述血清94ml("94mg)于200ml容量的三角烧瓶中备用。称取间接反应胆红素3mg，加0.2mol/L的Na2C03溶液lml，充分混匀到无干粉漂浮于液面上，再加甲醇lml充分摇匀，至完全溶解透明；称取直接反应胆红素llmg，加水4ml混匀，至完全溶解透明。将间接反应胆红素和直接反应胆红素溶液加入至上述盛放去脂蛋白血清三角烧瓶中，混匀后，向血清中加入以下添加剂牛血清白蛋白3gN-乙酰-L-半胱氨酸30mg乙二醇双(2-氨基乙基)醚四乙酸200mg乳糖5g柳硫汞lmg每加入一种，应充分摇匀溶解呈透明态。调整溶液pH达到7.0-8.5的范围内，调节氧化还原电极电位到140mV，充分摇匀，2-8'C冰箱过夜，次日用0.45pm滤膜过滤后，以每瓶0.5ml分装棕色玻璃小瓶。分装好的小瓶经低温预冻后开始冻干，一般历时约24小时。然后将已冻干小瓶从冻干机中取出，尽快用橡胶塞封口，最后盖上外盖，即成产品。按适当比例随机抽取产品，分别用lml水复溶后，立即用性能优良的分析仪，用可量值溯源的参考品为模板，以参考方法进行准确定值，完成后贴上标签，完成产品包装。实施例3取合格的健康人血清150ml，将原料血清置于塑料瓶中，置于-2(TC冰箱中12小时，再马上置于室温12小时，如此反复冻融7次至可见到血清上层大部分呈澄清状态。用吸管将上层小心分离，不使混淆；分别用致密滤纸、0.45拜滤膜、0.22pm滤膜过滤，使之成为透明的无菌去脂蛋白血清。取上述血清96ml("96mg)于200ml容量的三角烧瓶中备用。称取间接反应胆红素5mg，加0.2mol/L的Na2C03溶液lml，充分混匀到无干粉漂浮于液面上，再加甲醇lml充分摇匀，至完全溶解透明；称取直接反应胆红素13mg，加水2ml混匀，至完全溶解透明。将间接反应胆红素和直接反应胆红素溶液加入至上述盛放去脂蛋白血清三角烧瓶中，混匀后，向血清中加入以下添加剂牛血清白蛋白8g盐酸联氨15mg氨三乙酸250mg乳糖10g抗菌素5mg每加入一种，应充分摇匀溶解呈透明态。调整溶液pH达到7.0-8.5的范围内，调节氧化还原电极电位到160mV，充分摇匀，2-8'C冰箱过夜，次日用0.45pm滤膜过滤后，以每瓶0.5ml分装棕色玻璃小瓶。分装好的小瓶经低温预冻后开始冻干，一般历时约24小时。然后将已冻干小瓶从冻干机中取出，尽快用橡胶塞封口，最后盖上外盖，即成产品。按适当比例随机抽取产品，分别用lml水复溶后，立即用性能优良的分析仪，用可量值溯源的参考品为模板，以参考方法进行准确定值，完成后贴上标签，完成产品包装。为说明本发明胆红素测定冻干校正液的优异效果，我们抽取了部分产品进行了如下试验试验一以市售欧洲某著名公司的混合校正液及英国某公司的混合校正液为对比样品1和2测试浊度。在岛津2450型分光光度计上，用340nm波长(可显示浊度)，光径lcm，将上述产品按说明书复溶后，各取样150微升，加生理盐水3.0毫升，上机测浊度。测试结果见表l所示。表1本发明及对比样品校正液复溶后浊度测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明胆红素测定冻干校正液复溶后澄清透明，上述结果可说明原料深加工的实际效果。试验二以市售英国某公司混合校正液为对比样品，2-8'C(冷藏冰箱)条件下，复溶后与本发明校正液的稳定性进行对比观察，结果如表2所示。表22-8'C下本发明及对比样品校正》皮复溶后稳定性测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2数据均系样品在光度计上的测定变化值，其变异<10%判为稳定。本发明胆红素测定冻干校正液与市售产品比较，复溶后测定TBIL可稳定五天，测定DBIL也可稳定五天，而对比样品测定TBIL仅可稳定为三天，测DBIL为四天。试验三在-2(TC(冰冻)条件下，只融冻一次，观察校正液的稳定性，结果见表3所示。表3-20°<3下2|^发明胆红素测定冻干校正液复溶后稳定性测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3数据均系样品在光度计上的测定变化值，其变异<10%判为稳定。从测试结果可以看出，本发明胆红素测定冻干校正液，复溶后测定TBIL和DBIL至少均可稳定八天，稳定性较高。试验四对本发明胆红素测定冻干校正液，我们也测定了其冻干品残留水份，这项测定我们委托宁波市三生药业有限公司代为完成，结果测得样品残留水份含量为1.1%，说明冻干工艺中采用改进的半量操作取得的实际效果。综上，本发明胆红素测定冻干校正液复溶液完全澄清透明，残留水份含量低，稳定性好，完全满足胆红素准确测定的全部要求，而且还可以满足远途运输中保持稳定的需要，因此它当之无愧应是目前市场中的理想产品。上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。权利要求1、胆红素测定冻干校正液，其特征在于原料组成为去除脂蛋白的健康人血清92～98份、间接胆红素2～8份、直接胆红素8～20份、动物血清白蛋白1000～50000份、抗氧化剂10～100份、络合剂50～500份、防腐剂0.1～10份、赋形剂1000～50000份，以上均为重量份数。2、根据权利要求1所述的胆红素测定冻干校正液，其特征在于原料组成为去除脂蛋白的健康人血清9498份、间接胆红素35份、直接胆红素1113份、动物血清白蛋白300010000份、抗氧化剂15~25份、络合剂150~300份、防腐剂0.3~7份、赋形剂200040000份，以上均为重量份数。3、根据权利要求2所述的胆红素测定冻干校正液，其特征在于原料组成为去除脂蛋白的健康人血清96份、间接胆红素4份、直接胆红素12份、动物血清白蛋白3500份、抗氧化剂20份、络合剂200份、防腐剂0.5份、赋形剂3000份，以上均为重量份数。4、根据权利要求l、2或3所述的胆红素测定冻千校正液，其特征在于所述间接胆红素为间接反应胆红素，所述直接胆红素为直接反应胆红素。5、根据权利要求l、2或3所述的胆红素测定冻干校正液，其特征在于所述动物血清白蛋白为牛血清白蛋白，所述的络合剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二醇双醚四乙酸、氨三乙酸中的一种或几种。6、根据权利要求l、2或3所述的胆红素测定冻干校正液，其特征在于所述抗氧化剂为二巯基苏糖醇、N-乙酰-L-半胱氨酸、盐酸联氨中的一种或几种。7、根据权利要求l、2或3所述的胆红素测定冻干校正液，其特征在于所述防腐剂为抗菌素、柳硫汞、PC—300中的一种或几种。8、根据权利要求l、2或3所述的胆红素测定冻干校正液，其特征在于所述赋形剂为乳糖。9、胆红素测定冻干校正液的制备方法，其特征在于步骤为a.提供合格的健康人血清，反复冻融数次至可见到血清上层大部分呈澄清状态，将上层血清分别用致密滤纸、0.4-0.8pm滤膜、0.1-0.3nm滤膜过滤制得去脂蛋白血清；b.称取间接胆红素和直接胆红素，加入二甲亚砜或甲醇溶解，配以NaOH或Na2C03助溶至溶液透明；c.按去除脂蛋白的健康人血清9298份、间接胆红素28份、直接胆红素820份、动物血清白蛋白100050000份、抗氧化剂10-100份、络合剂50-500份、防腐剂0.1~10份、赋形剂100050000份重量份数配比，将间接胆红素和直接胆红素加入至去脂蛋白血清，混匀后，再按配比向血清中加入动物血清白蛋白、抗氧化剂、络合剂、防腐剂、赋形剂，每加入一种，充分摇匀溶解呈透明态；d.调整溶液pH达到7.0-8.5的范围内，调节氧化还原电极电位到100mV200mV;e.溶液分装至小瓶，经低温预冻后开始冻干，24h后取出，尽快用橡胶塞封口，最后盖上外盖，即成产品。10、根据权利要求9所述的胆红素测定冻干校正液的制备方法，其特征在于步骤为-a.提供合格的健康人血清，反复冻融数次至可见到血清上层大部分呈澄清状态，将上层血清分别用致密滤纸、0.4-0.8pm滤膜、0.1-0.3pm滤膜过滤制得去脂蛋白血清；b.称取间接反应胆红素和直接反应胆红素，加入二甲亚砜或甲醇溶解，配以NaOH或Na2C03助溶至溶液透明；c.按去除脂蛋白的健康人血清96ml、间接反应胆红素4mg、直接反应胆红素12mg、牛血清白蛋白3.5g、二巯基苏糖醇20mg、乙二胺四乙酸二钠200mg、PC—3000.5mg、乳糖3g配比，将间接反应胆红素和直接反应胆红素加入至去脂蛋白血清，混匀后，再按配比向血清中加入牛血清白蛋白、DTT、乙二胺四乙酸二钠、乳糖、PC-300，每加入一种，充分摇匀溶解呈透明态；d.调整溶液pH达到7.0-8.5的范围内，调节氧化还原电极电位到100mV200mV;e.溶液分装至小瓶，经低温预冻后开始冻干，24h后取出，尽快用橡胶塞封口，最后盖上外盖，即成产品。全文摘要本发明公开了一种胆红素测定冻干校正液及其制备方法，该胆红素测定冻干校正液原料组成为去除脂蛋白的健康人血清92～98份、间接胆红素2～8份、直接胆红素8～20份、动物血清白蛋白1000～50000份、抗氧化剂10～100份、络合剂50～500份、防腐剂0.1～10份、赋形剂1000～50000份，以上均为重量份数；本发明胆红素测定冻干校正液是一种接近人体血清中胆红素的存在形式、与人体内血清胆红素具有一致性，稳定化、经济的胆红素测定冻干校正液；制备方法浓缩冻干血清的液量，减少了常规冻干过程的一半液量，制备出的胆红素测定冻干校正液残留水分低，性能稳定。文档编号G01N33/72GK101109754SQ200710070200公开日2008年1月23日申请日期2007年7月23日优先权日2007年7月23日发明者宋克征,邹炳德申请人:宁波美康生物科技有限公司
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