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专利名称：荧光检测方法、荧光检测装置以及程序的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光检测装置和荧光检测方法，其中，接收测量对象物受到激光照射后所发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理。另外，本发明涉及计算机程序，使计算机执行在用特定频率调制的激光照射到测量对象物时作为测量对象物的荧光的荧光信号所得到的多个脉冲形状的荧光信号的信号处理。特别是涉及下述一种荧光检测装置，该装置适用于如在医疗、生物领域应用的流式细胞仪等利用荧光色素发出的荧光对细胞或DNA或RNA等测量对象物进行识别和分析等的分析装置。
背景技术：
应用于医疗、生物领域的流式细胞仪包括接收测量对象物的荧光色素受到激光照射后发出的荧光，由此识别测量对象物种类的荧光检测装置。具体来说，流式细胞仪采用荧光试剂使浑浊液中的细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等活体物质标签化，然后施加压力以使测量对象物在以每秒约IOm以下的速度在管道内流动的鞘液中流动，由此形成分层鞘流。通过向该流动中的测量对象物照射激光，由此接收附着在测量对象物上的荧光色素发出的荧光，并将该荧光作为标签进行识别，由此特定测量对象物。该流式细胞仪例如能够测量出细胞内的DNA、RNA、酶、蛋白质等在细胞内的相对量，且在短时间内能够对这些物质的作用进行分析。另外，可使用通过荧光对特定类型的细胞或染色体进行特定、并仅在特定的细胞或染色体以活着的状态下短时间内进行分选收集的细胞分类器等。例如，用流式细胞仪分析DNA等活体物质时，通过荧光试剂荧光色素预先附着在该活体物质上。而且，该活体物质通过与后述的附着在微胶珠上的荧光色素不同的荧光色素标签化，并混合于包括在其表面上设置有羧基等特别的结构体、且直径为5 20 μ m的微胶珠的液体中。上述羧基等的结构体结合(耦合)于某个已知结构的活体物质。因此，当同时检测微胶珠发出的荧光和活体物质发出的荧光时，可知活体物质与微胶珠的结构体结合。由此能够分析活体物质的特性。准备具有多种耦合用的结构体的多种微胶珠，在短时间内要分析活体物质的特性需要非常多种类的荧光色素。专利文献1中记载了以下内容。将微胶珠等作为测量对象物，用特定频率强度调制的激光照射到该测量对象物，求出此时发出的荧光的荧光弛豫时间。不同种类的荧光色素其荧光弛豫时间也不同，因此利用该荧光弛豫时间能够识别荧光种类并进一步识别测量对象物的种类。专利文献1 特开2006-2^698号公报

发明内容
上述专利文献1中，根据荧光弛豫时间能够在短时间内高效率地识别荧光，但是荧光弛豫时间的测量精度并不一定很高。例如，所接收的荧光弱且接收的荧光信号以多个脉冲形状的荧光信号离散的方式构成时，就无法求出求荧光弛豫时间时必要的相位差。为了解决上述课题，本发明的目的在于，提供一种在所接收的荧光弱且接收的荧光信号以多个脉冲形状的荧光信号离散的方式构成时，能够高精度地求出荧光弛豫时间的荧光检测方法、荧光检测装置及其程序。本发明的荧光检测方法是，接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理的方法。该荧光检测方法的特征在于，包括以特定频率调制的激光照射到测量对象物的工序；接收所述测量对象物发出的荧光，输出多个脉冲形状的荧光信号的工序；设定与所述频率相对应的周期单位的基准时间的工序；在所述基准时间基础上，获得所述的各脉冲形状的荧光信号被输出为止的发生时间的工序；生成所述脉冲形状的荧光信号的发生频率和表示与所述发生时间的关系的累积荧光信号的工序；与所述激光调制相对应的信号作为参照信号，求出该参照信号和所述累积荧光信号之间相位差的工序；利用所述相位差求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间的工序。另外，本发明的荧光检测装置是，接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对在此时所得到的荧光信号进行信号处理的装置。该荧光检测装置的特征在于，包括光源部，以特定频率调制的激光照射到测量对象物；受光部，接收所述测量对象物发出的荧光， 输出多个脉冲形状的荧光信号；处理部，利用通过所述激光照射到测量对象物，从所述受光部输出的荧光信号求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。所述处理部包括基准时间设定部，设定与所述频率相对应的周期单位的基准时间；脉冲发生时间获得部，在所述基准时间基础上，获得所述脉冲形状的各荧光信号被输出为止的发生时间；累积荧光信号生成部， 生成表示所述脉冲形状的荧光信号的发生频率和所述脉冲发生时间关系的累积荧光信号； 相位差获得部，求出该参照信号和所述累积荧光信号之间的相位差；荧光弛豫时间获得部， 利用所述相位差获得部中求得的相位差，求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。另外，本发明的程序是，以特定频率调制的激光照射到测量对象物时，作为测量对象物的荧光的荧光信号所得到的多个脉冲形状的荧光信号的信号处理在计算机上执行的程序。该程序的特征在于，在计算机上通过该程序执行，设定与所述频率相对应的周期单位的基准时间的步骤；在所述基准时间基础上，获得所述脉冲形状的各荧光信号被输出为止的发生时间的步骤；生成表示所述脉冲形状的荧光信号的发生频率和所述发生时间关系的累积荧光信号的步骤；与所述激光的调制相对应的信号作为参照信号，求出该参照信号和所述累积荧光信号之间的相位差的步骤；利用所述相位差求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间的步骤。根据本发明能够高精度地求出荧光弛豫时间。


图1为本发明的荧光检测装置的一个实施例的流式细胞仪概略构成图；图2为用于图1所示的荧光检测装置的控制和处理部的一个例的概略构成图；图3为用于图1所示的荧光检测装置的分析装置的一个例的概略构成图；图4(a)和图4(b)为存储于图1所示的分析装置的存储器的信号的一个例的示意图；图5(a)为图1所示的荧光检测装置中所得到的参照信号的一个例的示意图；图5(b)为图3所示的分析装置的累积荧光信号生成单元中所得到的信号的一个例的示意图； 图5(c)为分析装置的相关值计算单元中所得到的信号的一个例的示意图；图6为表示本发明的荧光检测方法的一个实施例的流程图；图7为用于图1所示的荧光检测装置的分析装置的一个例的概略构成图；图8为表示本发明的荧光检测方法的一个实施例的流程图。附图标记说明10 流式细胞仪12 样品20 信号处理装置22 激光光源部23 光束分离器24,25,26 受光部28 控制和处理部30 管道32:回收容器40 光源控制部42 振荡器44 放大器46 :A/D 转换器50 分析装置52 =CPU54 存储器56 基准时间设定单元58 脉冲发生时间获得单元60 累积荧光信号生成单元62 相关值计算单元64 最大相关时间获得单元66 相位差计算单元68 荧光弛豫时间计算单元70:输入输出端口80 显示器
具体实施例方式以下，基于实施方式详细说明适用本发明的荧光检测装置的流式细胞仪。<第一实施方式>(流式细胞仪的整体构成)首先，结合图1说明本实施方式的流式细胞仪的整体构成。图1为采用本发明的荧光检测装置的流式细胞仪10的一个例的概略构成示意图。流式细胞仪10包括信号处理装置20、分析装置50。激光照射到微胶珠或细胞等样品12时，信号处理装置20检测设置在样品12中的荧光色素发出的荧光的荧光信号并对其进行信号处理。分析装置50利用信号处理装置20中所得到的处理结果，对样品12中的测量对象物进行分析。信号处理装置20包括激光光源部22、受光部M、25J6、控制和处理部28、管道 30。控制和处理部28包括对来自激光光源部22的激光进行强度调制的光源控制部40 (参照图2、、对来自样品12的荧光信号进行A/D转换的A/D转换器46 (参照图2、。在管道30 中，样品12包括在形成高速流的鞘液中流动，并形成分层鞘流。该流动例如在IOOym流路直径中具有1 IOm/秒的流速。另外，微胶珠作为样品12使用时，微胶珠的球径为数 μπι 30μπι。在管道30的出口处设置有回收容器32。激光光源部22是发射以特定频率强度调制的激光的部分。透镜系统按照使激光聚焦在管道30中的规定位置的方式进行设置，在该聚焦位置上形成有样品12的测量点。(激光光源部)激光光源部22发射规定强度的CW (连续波)激光，且对该CW (连续波)激光进行强度调制后进行发射。从激光光源部22发射的激光，通过未图示的透镜系统聚焦在管道30 中的测量点上。发射激光的光源是例如为半导体激光器。激光的输出功率是例如约为5 lOOmW。 激光波长例如为350nm 800nm。激光光源部22与控制和处理部28连接。控制和处理部28向激光光源部22供给以特定频率调制的调制信号，以对激光进行强度调制。被激光激发的荧光色素附着在所要测量的活体物质或微胶珠等样品12上。样品 12通过作为激光聚焦位置的测量点的数μ秒 数10μ秒期间，在测量点上受到激光照射而发出荧光。(受光部)激光光源部22和管道30之间设置有光束分离器23。从激光光源部22发射的激光的一部分透射光束分离器23后照射到通过测量点的样品12。另外，从激光光源部22发射的激光的一部分从光束分离器23反射后照射到受光部25。受光部M按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置。通过测量点的样品12使透射光束分离器23的激光发生前向散射。受光部M包括输出样品12正通过测量点情况的检测信号的光电转换器。从受光部M输出的信号供给到控制和处理部 28，并作为通知样品12正通过管道30中的测量点的时间的触发信号。受光部25按照从光束分离器23反射的激光的一部分入射的方式配置。受光部25 包括接收从光束分离器23反射的激光、并输出受光信号的光电转换器。从受光部25输出的信号是与激光调制相对应的信号，并将该信号供给到控制和处理部28。从受光部25供给到控制和处理部观的信号作为为了求出与荧光信号的相位差的参照信号来使用。受光部沈按照垂直于发射自激光光源部22的激光发射方向且垂直于管道30中的样品12的移动方向的方式进行配置。透射光束分离器23的激光照射到通过测量点的样品12。受光部沈包括用来接收样品12发出的荧光的光电转换器。光电转换器将在光电表面所接收的光转换成电信号(受光信号)。该受光信号供给到控制和处理部28。例如，受光部沈所接收的荧光非常弱、且获得相当于每一个光子的脉冲形状的信号时，所输出的荧光信号成为非常小的多个脉冲形状的荧光信号。(控制和处理部)图2为控制和处理部28的一个例的概略构成图。控制和处理部28包括光源控制部40、A/D转换器46。光源控制部40包括振荡器42和放大器44。光源控制部40生成调制激光强度的调制信号，并将调制信号供给到激光光源部22。振荡器42输出特定频率的正弦波信号。正弦波信号的频率例如设定为1 50MHz。 从振荡器42输出的特定频率的正弦波信号通过放大器44放大后供给到激光光源部22。A/D转换器46将从受光部沈输出的受光信号、以及从受光部25供给的参照信号进行A/D转换。根据从受光部M供给的触发信号开始进行A/D转换。A/D转换器46使用进行数GHz抽样的转换器。这是因为如后述较弱的荧光的荧光信号中为了获得脉冲形状的离散的荧光信号的缘故。A/D转换的受光信号供给到分析装置50。(分析装置)图3为分析装置50的一个例的概略构成图。分析装置50是通过在计算机上启动规定程序来构成的装置，该装置包括CPTO2、存储器M、输入输出端口 70，除此之外还包括通过运行软件来形成的基准时间设定单元56、脉冲发生时间获得单元58、累积荧光信号生成单元60、相关值计算单元62、最大相关时间获得单元64、相位差计算单元66、荧光弛豫时间计算单元68。并且，在分析装置50中连接有显示器80。CPU52是设置在计算机上的运算处理器，实质进行基准时间设定单元56、脉冲发生时间获得单元58、累积荧光信号生成单元60、相关值计算单元62、最大相关时间获得单元64、相位差计算单元66、荧光弛豫时间计算单元68的各种计算。存储器M包括硬盘或ROM，存储有程序，通过在计算机上执行程序来形成基准时间设定单元56、脉冲发生时间获得单元58、累积荧光信号生成单元60、相关值计算单元62、 最大相关时间获得单元64、相位差计算单元66、荧光弛豫时间计算单元68 ；RAM，存储通过这些单元计算出的处理结果或从输入输出端口 70供给的信号。从A/D转换器46供给的受光信号和参照信号连续存储在存储器M中。输入输出端口 70接收从A/D转换器46供给的参照信号或受光信号，并且将在各单元完成的处理结果信息输出在显示器80上。显示器80显示在各单元求出的脉冲发生时间、累积荧光信号、相关值、最大相关时间、相位差、荧光弛豫时间等处理结果值。图4为分析装置的存储器M上存储的信号的一个例的示意图。图4(a)为从受光部25供给到A/D转换器46上并且存储在存储器M上的参照信号的一个例的示意图。图 4(b)为从受光部沈供给到A/D转换器46上并且存储在存储器M的受光信号的一个例的示意图。受光部26接收如每接收一个光子得到脉冲形状的荧光信号的强度弱的光时，如图 4(b)所示，每个荧光信号作为脉冲形状的电信号被测量。基准时间设定单元56相对于存储在存储器M上的受光信号和参照信号，设定以一定时间间隔隔开的基准时间(ti:i是整数)。该时间间隔作为与调制激光的频率相对应的周期。例如，调制激光的频率为IOMHz时，IOMHz所对应的周期IOOn秒作为时间间隔。图 4是与调制激光的频率相对应的每个周期(一周期)上设定基准时间的例子。二周期、三周期等的每个单位上设定基准时间也可以。
脉冲发生时间获得单元58根据基准时间ti获得作为脉冲形状的各个荧光信号输出为止的时间的脉冲发生时间。在图4(b)的例中，从基准时间t0到tl期间测量到三个脉冲形状的荧光信号。脉冲发生时间获得单元58获得从基准时间t0到该三个脉冲形状的荧光信号发生的时间(发生时间)。在基准时间tl到t2期间测量到一个脉冲形状的荧光信号。脉冲发生时间获得单元58获得从基准时间tl到该荧光信号发生的时间(发生时间)。 以下，同样，脉冲发生时间获得单元58获得从基准时间ti到脉冲形状的各个荧光信号输出的时间(发生时间)。脉冲形状的荧光信号发生为止的时间(发生时间)是超越脉冲形状的电信号预先设定的临界值的时间和低于该临界值的时间之间的中间时间。之所以设定临界值是为了避免将噪音成分当作脉冲形状的荧光信号获得。累积荧光信号生成单元60求出显示脉冲发生时间获得单元58求出的脉冲发生时间和该脉冲发生时间上输出脉冲形状的荧光信号的频率的关系的累积荧光信号。图5(b) 为分析装置50的累积荧光信号生成单元60中获得的累积荧光信号的一个例的示意图。累积荧光信号生成单元60将脉冲发生时间获得单元58求出的脉冲发生时间分成多个时间区域，并测量在每个时间区域上发生的脉冲发生频率。进一步生成基准时间的时刻作为0时刻，时间区域的中间值作为时间，根据该时间的脉冲形状的荧光信号的发生频率作为信号值来表示的累积荧光信号。累积荧光信号是例如图5(b)所示的柱状的信号。当然，可以通过将时间区域设定较细来生成差别小的累积荧光信号。但是，此时累积的荧光信号的参数少，因此容易发生噪音。因此，优选的是预先探索时间区域的幅度的设定，以生成具有连续性的平滑的累积荧光信号。相关值计算单元62求出累积荧光信号生成单元60求出的累积荧光信号和参照信号的相关值。用于计算相关值的参照信号是利用基准时间区分开的一周期的信号，还可以是利用将存储的参照信号平均化之后的参照信号，还可以是选择一个一周期的参照信号， 并作为代表信号使用。图5(a)为一周期的参照信号的一个例的示意图。相关值计算单元 62在时间方向上错开参照信号的同时，获得参照信号和累积荧光信号的相关值。图5(c)为在分析装置的相关值计算单元62获得的相关值的信号的一个例的示意图。横轴表示在时间方向上错开参照信号的时间，纵轴表示相关值。最大相关时间获得单元64求出相关值计算单元62求出的相关值最大的时间 △t(最大相关时间)。相位差计算单元66利用最大相关时间获得单元64求出的最大相关时间At，求出参照信号和累积荧光信号的相位差。如果激光调制信号的频率为f，则通过式θ =23ifAt 求出相位差θ。荧光弛豫时间计算单元68利用相位差计算单元66求出的相位差θ，求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间τ。荧光弛豫时间τ通过式τ = tan θ / (2 π f)求出。接着，结合图6说明本实施方式的荧光检测方法。图6为表示本实施方式的荧光检测方法的流程图。在本实施方式的荧光检测方法中，首先激光光源部22将以特定频率调制的激光照射到测量对象物上(SlOl)。然后，受光部沈接收测量对象物发出的荧光，并输出包括多个脉冲形状的荧光信号的受光信号。
接着，基准时间设定单元56设定与频率相对应的周期单位的基准时间(S10;3)。然后，脉冲发生时间获得单元58根据基准时间获得脉冲形状的各个荧光信号输出为止的发生时间(S104)。然后，累积荧光信号生成单元60生成表示脉冲形状的荧光信号的发生频率和发生时间关系的累积荧光信号(Sl(^)。然后，相关值计算单元62求出累积荧光信号和参照信号的相关值(S106)。然后，通过相关值计算单元62求得的相关值变为最大的最大相关时间在最大相关时间获得单元64中获得(S107)。然后，相位差计算单元66将与激光的调制相对应的信号作为参照信号，求出参照信号和累积荧光信号的相位差(S108)。然后，利用通过相位差计算单元66求出的相位差，荧光弛豫时间计算单元68求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间(S109)。另外，本实施方式的程序是用来使计算机上执行以特定频率调制的激光照射到测量对象物时作为测量对象物的荧光的荧光信号所得到的多个脉冲形状的荧光信号的信号处理的程序。该程序使计算机进行以下步骤设定与频率相对应的周期单位的基准时间的步骤；根据基准时间获得脉冲形状的各个荧光信号输出为止的发生时间的步骤；生成表示脉冲形状的荧光信号的发生频率和发生时间关系的累积荧光信号的步骤；与激光的调制相对应的信号作为参照信号，求出参照信号和累积荧光信号的相位差的步骤；利用相位差求出测量对象物的的荧光弛豫时间的步骤。该程序存储在分析装置50的存储器M中。根据本实施方式，荧光微弱、且受光信号具有多个脉冲形状的荧光信号构成时，通过利用累积荧光信号能够高精度地测量荧光弛豫时间。<第二实施方式>在第一实施方式中，从激光光源部22发射的激光的一部分从光束分离器23反射， 将受光部25接收的信号作为参照信号。本实施方式中没有设置光束分离器23和受光部 25，将从光源控制部40输出的调制信号供给到激光光源部22和A/D转换器46上，并将从光源控制部40供给到A/D转换器46的调制信号作为参照信号使用，这一点与第一实施方式不同。此时，为了在光源控制部40中分割调制信号利用功率分配器。其它的构成与第一实施方式相同。根据本实施方式，以更简单的构成，即使在荧光较弱时，也可以高精度地测量荧光弛豫时间。<第三实施方式>在第一实施方式中，从A/D转换器46供给到输入输出端口 70的参照信号或荧光信号存储于存储器讨中。在本实施方式中，从A/D转换器46供给到输入输出端口 70的参照信号或荧光信号没有存储于存储器讨中，直接进行之后的信号处理，这一点与第一实施方式不同。预先设定从光源控制部40输出的正弦波信号频率f。为此，与频率f相对应的周期单位的基准时间中，相对于供给到输入输出端口 70的参照信号或荧光信号，基准时间设定单元56设定基准时间。脉冲发生时间获得单元58根据基准时间获得脉冲形状的各荧光信号发生为止的时间(发生时间)。发生时间信息存储在存储器M中。之后，如同第一实施方式，利用发生时间信息求出累积荧光信号，然后进行与第一实施方式同样的处理。
根据本实施方式，以更小的存储器容量即使在荧光较弱时也能够高精度地测量出荧光弛豫时间。〈第四实施方式〉在第一实施方式中，利用累积荧光信号生成单元60求出的累积荧光信号，相关值计算单元62求出累积荧光信号和参照信号的相关值。在本实施方式中，不求出累积荧光信号和参照信号的相关值，而求出参照信号和累积荧光信号的相位差，这一点与第一实施方式不同。图7为本实施方式的分析装置50的一个例的概略构成图。除了不具有在第一实施方式中的相关值计算单元62和最大相关时间获得单元64之外，其它与第一实施方式相同。累积荧光信号生成单元60将脉冲发生时间获得单元58求出的脉冲发生时间分成多个时间区域，并测量各时间区域上发生的脉冲频率，由此求出累积荧光信号。进一步，本实施方式的累积荧光信号生成单元60用与调制激光的调制信号相同形状的信号(正弦波信号)选配累积荧光信号，由此求出相对于调制信号的累积荧光信号的弛豫时间。选配时用最小二乘法等方法。图5(b)的虚线表示选配累积荧光信号的信号。相位差计算单元66利用累积荧光信号生成单元60求出的累积荧光信号，求出相对于调制信号的累积荧光信号的延迟时间At，并通过该延迟时间At求出相位差。接着，结合图8说明本实施方式的荧光检测方法。图8为表示本实施方式的荧光检测方法的流程图。在本实施方式的荧光检测方法中，首先，激光光源部22将以特定频率调制的激光照射到测量对象物上(S201)。然后，受光部沈接收测量对象物发出的荧光，并输出包括多个脉冲形状的荧光信号的受光信号(S202)。接着，基准时间设定单元56设定与频率相对应的周期单位的基准时间(S20;3)。然后，脉冲发生时间获得单元58根据基准时间获得脉冲形状的各荧光信号输出为止的发生时间(S204)。然后，累积荧光信号生成单元60生成表示脉冲形状的荧光信号的发生频率和发生时间关系的累积荧光信号(S20O。然后，相位差计算单元66将与激光的调制相对应的信号作为参照信号，求出参照信号和累积荧光信号的相位差(S206)。然后，利用通过相位差计算单元66求出的相位差，荧光弛豫时间计算单元68求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间(S207)。根据本实施方式，以更简单的构成，即使在荧光较弱时，也能够高精度地求出荧光弛豫时间。
权利要求
1.一种荧光检测方法，接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对所接收的荧光的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括将以特定频率调制的激光照射到测量对象物的工序；接收所述测量对象物发出的荧光，输出脉冲形状的多个荧光信号的工序；设定与所述频率相对应的周期单位的基准时间的工序；根据所述基准时间，获得所述脉冲形状的各荧光信号输出为止的发生时间的工序； 生成表示所述脉冲形状的荧光信号的发生频率和所述发生时间的关系的累积荧光信号的工序；与所述激光的调制相对应的信号作为参照信号，求出该参照信号和所述累积荧光信号的相位差的工序；利用所述相位差求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间的工序。
2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于所述求出相位差的工序是，根据所述累积荧光信号和所述参照信号的相关值求出所述相位差。
3.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于所述求出相位差的工序是，用与调制所述激光的调制信号相同形状的信号选配所述累积荧光信号，由此求出相对于该调制信号的所述累积荧光信号的延迟时间，并根据该延迟时间求出所述相位差。
4.根据权利要求1至3任一项所述的荧光检测方法，其特征在于与所述激光的调制相对应的信号通过接收所述激光的一部分而获得。
5.根据权利要求1至3任一项所述的荧光检测方法，其特征在于与所述激光的调制相对应的信号是调制所述激光的调制信号。
6.一种荧光检测装置，接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括激光光源部，将以特定频率调制的激光照射到测量对象物； 受光部，接收所述测量对象物发出的荧光，输出脉冲形状的多个荧光信号； 处理部，利用通过将所述激光照射到测量对象物在所述受光部输出的荧光信号，求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间；其中，所述处理部包括基准时间设定部，设定与所述频率相对应的周期单位的基准时间； 脉冲发生时间获得部，根据所述基准时间，获得所述脉冲形状的各荧光信号输出为止的发生时间；累积荧光信号生成部，生成表示所述脉冲形状的荧光信号的发生频率和所述脉冲发生时间的关系的累积荧光信号；相位差获得部，将与所述激光的调制相对应的信号作为参照信号，求出该参照信号和所述累积荧光信号的相位差；荧光弛豫时间获得部，利用在所述相位差获得部求出的相位差，求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间。
7.根据权利要求6所述的荧光检测装置，其特征在于所述相位差获得部是根据所述累积荧光信号和所述参照信号的相关值求出所述相位差。
8.根据权利要求6所述的荧光检测装置，其特征在于所述相位差获得部是，用与调制所述激光的调制信号相同形状的信号选配所述累积荧光信号，由此求出相对于该调制信号的所述累积荧光信号的延迟时间，并根据该延迟时间求出所述相位差。
9.一种程序，用来使计算机执行在以特定频率调制的激光照射到测量对象物时作为测量对象物的荧光的荧光信号所得到的多个脉冲形状的荧光信号的信号处理，其特征在于， 使计算机执行如下步骤设定与所述频率相对应的周期单位的基准时间的步骤；根据所述基准时间，获得所述脉冲形状的各荧光信号输出为止的发生时间的步骤；生成表示所述脉冲形状的荧光信号的发生频率和所述脉冲发生时间的关系的累积荧光信号的步骤；将与所述激光的调制相对应的信号作为参照信号，求出该参照信号和所述累积荧光信号的相位差的步骤；利用所述相位差求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间的步骤。
10.根据权利要求9所述的程序，其特征在于所述求出相位差的步骤是根据所述累积荧光信号和所述参照信号的相关值求出所述相位差。
11.根据权利要求9所述的程序，其特征在于所述求出相位差的步骤是，用与调制所述激光的调制信号相同形状的信号选配所述累积荧光信号，由此求出相对于该调制信号的所述累积荧光信号的延迟时间，并根据该延迟时间求出所述相位差。
全文摘要
本发明涉及的荧光检测方法，包括将以特定频率调制的激光照射到测量对象物的工序；接收测量对象物发出的荧光，输出脉冲形状的多个荧光信号的工序；设定与频率相对应的周期单位的基准时间的工序；根据基准时间，获得脉冲形状的各荧光信号输出为止的发生时间的工序；生成表示脉冲形状的荧光信号的发生频率和发生时间的关系的累积荧光信号的工序；与激光的调制相对应的信号作为参照信号，求出该参照信号和累积荧光信号的相位差的工序；利用相位差求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间的工序。
文档编号G01N21/64GK102317762SQ20108000769
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月4日 优先权日2009年2月17日
发明者林弘能 申请人:三井造船株式会社