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专利名称：计数细胞和生物分子的系统和方法
技术领域：
本发明一般地涉及可用于分析和测量细胞和生物样品的分析和监测系统。更特别地，本发明涉及用于成像、测量、计数、分析和监测微观颗粒，如溶液样品中的细胞和生物分子的系统和方法。发明背景
医疗诊断和生物医学研究领域的一个重要方面涉及通过检测生物样品，如血液、脊髓液、细胞培养物和尿液，检测、鉴定、定量和表征各种目标细胞和生物分子。医疗服务提供者和生物医学研究人员常规分析这类生物样品的细胞和生物分子的微观存在和浓度。传统地用于基于细胞试验的荧光检测的是荧光显微镜、荧光读板仪和流式细胞仪。这些方法利用载玻片、微滴定板和流动室进行荧光分析。但是，这些荧光检测方法通常包含昂贵的激发光源(如激光或弧光灯)以进行高强度的激发。通常情况下，用激发光源和带发射滤光片的检测探针来检出特定的荧光信号。在仪器中(如荧光显微镜)，例如，需要二向性滤光器将光从顶端直射(normal)(即以直角)反射到样品室。然后发出的荧光通过二向性滤光器被进入检测器(如照相机、分光计等等)而被检出。因为这些荧光检测方法不是测量特定的流体体积的样品，所以他们也不能用来直接测量样品浓度。以往的荧光细胞计数技术的实例是一种在包含光学器件、照相机和样品架的装置 中利用滤波器室(filter cube)(如由Omega Optical所提供的)的技术。这些装置可以为很多应用提供足够的细胞和其他生物样品的荧光像，并且它提供了用于生成生物样品的荧光像的简单和有效的方法。该技术采用了固定的室容积，其用于直接测量样品的浓度，同时分析荧光强度。然而，它缺乏用于低荧光信号检测和成像的灵敏度。这种系统的一个问题，例如，是激发光可能会泄漏到滤波器室的发射滤波器中。另一个问题是滤波器室形式在颜色选择方面一般是不可变的。仅一个特定的滤波器室和一个LED可用于一种颜色。仪器中没有更多的空间整合其他颜色，因此使其很难用于多色应用。因此，长期以来需要提供低荧光信号(如各种不同类型细胞上的表面标志物)的检测和成像能力的细胞计数系统和方法。发明概述本发明部分地基于发现独特的设计途径导致检测和成像(例如，测量、分析、计数或监测)微观物体的系统的极大改进。该系统包括荧光激发的非常规设计以使得该系统允许两个或多个斜射激发光束。这种新方法极大地解放了系统的整体设计，并使多个光源能够以各种不同的入射角放置。为提高低荧光信号检测的能力，必须降低样品载片的背景和/或必须加强细胞或生物分子的荧光信号。本文提出的本发明描述了通过利用斜射激发光源和多个LED(发光二极管)照明，将样品的荧光信号最大化而同时将样品载片的背景噪音最小化的新方法。该新系统不仅通过放置两个或更多个激发光源为增强(即更强)的激发开避了道路，而且它也使得能够灵活使用和选择激发光束的波长和入射角。通过允许入微激发光束角度的不同组合，可以生成使用现有系统不可能生成或不容易生成的图像。一个方面，本发明一般地涉及用于微观物体成像的系统。该系统包括配置为容纳样品中要成像的物体的悬浮液的样品室，其中样品室包括允许暴露样品的光学透明窗；至少一个能够通过所述窗为样品提供荧光激发光束的荧光光源；能够为样品提供明场光束的明场光源；和至少一个用于检测来自样品的光信号的检测装置，从而形成至少一个微观物体的图像，其中荧光激发光束具有垂直于所述窗的表面平面以外的入射角。
在某些优选的实施方案中，该系统包含至少两个荧光光源，其能够为样品同时提供两个具有相同(或不同)波长的激发光束。在某些优选的实施方案中，该系统包含多个荧光光源，其能够为样品同时提供多个具有相同(或不同)波长的激发光束。在某些实施方案中，突光激发光束相对于样品室窗的表面平面的入射角为约10°到约80° (例如，约30°到约70°、约35°到约55°或低于约45°、大于约45°和小于约90。、或约 45° )。可成像、监测、分析、测量或计数的微观物体包括但不仅限于，微珠、细菌、藻类、真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、蛋白质、DNA分子和表面标志物。在某些实施方案中，优选的微观物体包括生物分子和细胞。样品室可以具有固定的深度，范围是约Ιμπι到约Ι,ΟΟΟμπι。在一些优选的实施方案中，固定的深度的范围是从约I μπι到约200 ym(例如，从约IOym到约100 μ m)。覆盖的样品室可配置为容纳约IuL到约1，OOOyL的样品体积。在某些优选实施方案中，覆盖的样品室可配置为容纳约I μ L到约500 μ L(例如约I μ L到约100 μ L)的样品体积。突光光源可以发射波长范围从约300nm到约10，OOOnm (例如从约300nm到约2，OOOnm或从约300nm到约I，OOOnm)的光束。在另一个方面，本发明一般地涉及计数细胞或生物分子的系统。该系统包括配置为容纳样品中细胞或生物分子的悬浮液的覆盖的样品室，其中样品室包含允许暴露样品的光学透明窗；两个或更多个荧光光源，各能够独立地通过所述窗为样品提供荧光激发光束，其中各突光激发光束具有垂直于所述窗的表面平面以外的入射角；能够为样品提供明场光束的明场光源；至少一个用于检测来自样品的光信号的光检测装置；和用于控制明场光束到达样品的通道的光闸。而在另一个方面，本发明一般地涉及测定生物样品的特征的方法。该方法包括通过指引明场光束到样品上来获得生物样品的至少一个静态的明场图像；通过指引激发光束到样品上来获得生物样品的至少一个静态的荧光图像；和比较该至少一个明场图像和该至少一个荧光图像来确定生物样品的特征，其中激发光束与明场光束成斜角。在某些优选的实施方案中，通过指引至少两个激发光束到样品上激发获得荧光图像。在某些其他的优选实施方案中，通过指引多个(例如3、4个)激发光束到样品上激发而获得荧光图像。而在另一个方面，本发明一般地涉及检测样品中的生物分子的方法。该方法包括通过指引明场光束到样品上来获得生物样品的至少一个静态的明场图像；通过指引激发光束到样品上来获得生物样品的至少一个静态的荧光图像；和比较该至少一个明场图像和该至少一个荧光图像来确定生物样品的特征，其中激发光束与明场光束成斜角。而在另一个方面，本发明一般地涉及确定样品的细胞群中特定类型细胞的浓度或计数的方法。该方法包括使包含细胞的样品与特异结合样品中特定类型细胞的荧光标记试剂接触；将样品加载到具有已知高度的覆盖的样品室中，其中细胞群悬浮在样品室中；获得生物样品中细胞群的至少一个静态的明场图像；获得生物样品中细胞群的至少一个静态的荧光图像；和比较明场图像的细胞计数和荧光图像的细胞计数来确定细胞群中特定类型细胞的浓度或细胞计数，其中激发光束与明场光束成斜角。附图简要说明
图I是现有技术的示例性细胞计数系统。图2是依据本发明的示例性系统。图3是本文公开的系统的实施方案的示例性描述。图4是本文公开的系统的实施方案的示例性描述。图5是用具有不同波长的多LED以斜入射激发的LinearFlow珠(Invitrogen公司)荧光发射的示例图像。图6是斜入射设置的背景强度降低的示例。图7是用具有相同波长的多LED以斜入射激发的LinearFlow UV荧光珠的示例图像。图8是用多LED在相同波长下5X物镜的激发光增强的示例。图9是灵敏度增强的示例，其中O. 8%的荧光强度的珠能够使用斜入射设置成像。

图10是用多LED在相同波长下IOX物镜的激发光增强的示例。发明详述本发明涉及用于检测和成像微观颗粒(如细胞和生物分子)的系统和方法。本发明部分地基于使得能够实现用于检测和成像(例如，测量、分析、计数或监测)溶液样品中微观物体的重大改进系统的独特设计的发现。该系统包括非常规的荧光激发方式，从而允许可同时操作的两个或多个斜入射激发光束。该新方式大大改进和解放了成像系统的整体设计并使得多个(相同或不同)光源能够以对于样品的不同入射角放置。因此，该新系统通过放置两个或多个激发光源到适当的位置为增强(即更强)的激发功率开辟了道路。此外它允许灵活使用和选择激发光束的波长和入射角。通过不同的激发光束入射角和组合，可以检测和生成使用现有技术的系统不可能生成或不容易生成的图像。通过组织样品或体液的微观检查已阐明很多疾病的生物学机制。组织病理学检查也允许开发多种疾病的有效医学治疗。在标准解剖病理学中，在细胞形态学和染色特征的基础上进行诊断。通过标准方法(如苏木精和伊红)染色的组织样品的镜检和分类已显著改善了癌症治疗。例如，可以检验肿瘤样品以鉴定肿瘤类型，并表明病人是否响应于特定形式的化疗。分子医学的最新进展提供了甚至更大的机会来了解疾病的细胞学机制，并选择成功可能性最大的适当的治疗。例如，某些激素依赖性乳腺肿瘤细胞的雌激素受体的表达的增加，表明肿瘤所取自的患者很可能会对特定的抗雌激素药物治疗作出响应。其他的诊断和预后性的细胞学变化包括肿瘤特异性细胞表面抗原的存在(如黑色素瘤中)、胚性蛋白质的产生(如消化道肿瘤所产生的癌胚性糖蛋白抗原)和基因异常(如肿瘤中激活的致癌基因)。多种技术已经发展来检测这些细胞学异常情况的存在，包括利用单克隆抗体的免疫表型分型、利用核酸探针的原位杂交和利用聚合酶链式反应(PCR)的DNA扩增。由于使目前的自动分析系统不能够以经济的、时间敏感的和可重复的方式利用和确认变化的生物标志物，在有效地利用这些生物标志物帮助诊断和确定治疗方案方面还存在阻碍。以往的技术和系统往往被证明不足以有效地分析需要进行多种独立的显微特征、组织学特征和/或分子特征的平行快速分析的组织样品。此外，人工的方法可能是极度费时的并经常需要高度的专业培训和质量控制水平以确认和/或定量细胞。这种情况不但对于肿瘤细胞的识别和检测是如此，而且对于包括嗜中性白细胞碱性磷酸酶分析、网状细胞计数和成熟评估等等的其他应用也是如此。相关的人工劳动在可能由于长期的、艰苦的人工检查可能产生潜在的错误之外还导致了这些过
程的高成本。一种荧光细胞计数技术利用了光学器件、照相机和样品架组件中的滤波器室。在某些应用中，它能够提供足够的细胞和其他生物样品的荧光图像。虽然该技术提供了简单和有效的方法来产生生物样品的荧光图像，但它缺少低荧光信号检测和成像所需的灵敏度。激发光泄漏和系统的设计和颜色选择缺乏灵活性(由于滤波器室形式)是其中的主要缺点。仅一个特定的滤波器室和一个LED可用于一种颜色。没有更多的额外的空间可用于整合其他颜色。(示例性的计数系统和相关方法可发现于PCT/US09/39863及美国专利申请公开 No. 2004/0145805 中。)图I中描述了现有技术的细胞计数系统的实例。该系统包括计数室、荧光光源(连接于荧光光束收缩装置)和明场光源(连接于明场光束收缩装置)。图I中的细胞计数系统还包括检测装置(照相机)和荧光滤波器组件，其使来自荧光光源的激发光照射样品室中的样品。在图I中，荧光激发光以直角(直射)照射在计数室的样品上。本发明至少在两个主要方面大大提高了上述系统的灵敏度和检测限。第一，斜入射激发光源用来使由滤波器室方法共有的从激发滤波器到发射滤波器的光泄漏造成的背景信号减少到最低。第二，通过应用斜激发概念，多个LED可以很容易地整合到一个仪器中来照射样品，从而增加来自样品的荧光信号并减少在滤波器室系统中获得图像所需的曝光时间(从而使新系统与激光或弧光灯激发相当)。参照图2，其是依照本发明的细胞计数系统的示例性实施方案的示意图。该细胞计数系统200包括连接到荧光光束收缩装置215的荧光光源210、连接到明场光束收缩装置225的明场光源220。该细胞计数系统还包括计数室230和检测装置240 (照相机)。在该系统中，荧光激发光以斜角照射在计数室230中的样品250上。该细胞计数系统200还包括显微物镜206和可移动的光闸228。用于获取图像的检测装置可以是照相机，如CCD(电荷耦合器件)照相机。照相机可配备冷却功能。在某些实施方案中，显微物镜是在可操作地连接到系统200上的电脑260的控制下移动的。计数室230有可以预先选定、调节或固定的已知高度。计数室230可以覆盖或以其它方式封关以使得其中的样品悬浮液的体积不会由于蒸发而损失。通过移液将样品移入到样品室230的进样孔而将样品加载到样品室230中。随着样品加载到样品室中，通过样品室230中的放气孔使空气逸出样品室230。虽然实际样品大小可能根据不同的应用和仪器设置而变化，但示例性的样品大小为20 μ I。一旦样品被加载到样品室230中，通过系统外壳中的插槽将样品室230装入计数系统200中。荧光光源和明场光源可以是发光二极管。荧光光束收缩装置和明场光束收缩装置可以是准直仪。一旦获取图像，可以由计数室的高度和成像的样品的面积获得所探测的样品体积。可以得到各探测样品的体积，并对于获取的图像是已知的。应该注意的是，样品室的高度可以根据应用而变化，只要探测样品的体积可以获得或已知。系统200配置用于样品室230中样品的明场成像和荧光成像。细胞计数系统200的组件封装在外壳中。明场光源220定位在外壳的基部，并配置为发射光到同线地(in-line)定位在明场光源220上方的样品室230中的样品上。在样品室230和明场光源220之间是明场光束收缩装置225。光束收缩装置使明场光源220发射的光聚焦，并指引光到样品室230中的样品上。定位在样品室230和明场光源220之间的还有可移动的光闸228。可移动的光闸228位于明场光束收缩装置225上方和样品室230下方。光闸228被连接到用于移动光闸的机构上，如电机或螺线管。光闸228被机械地与明场光源220同线地移动，以允许来自明场光源220的光在明场成像过程中与样品室230中的样品相互作用。 光闸228被机械地与明场光源220同线地移动，以阻断来自明场光源220的光在荧光成像过程中与样品室230中的样品相互作用。当来自明场光源220的光束通过样品室230中的样品后，光线随后通过显微物镜206。显微物镜206负责初始图像形成并参与决定由系统200能够生成的图像质量。显微物镜206还参与决定特定样品的放大倍数和决定系统200中可以观察的微小样品细节的分辨率。显微物镜可从奥林巴斯美国公司(Center Valley, PA)买到。当来自明场光源220的光经过显微物镜206后，来自样品的发射的光经过发射滤波器265，并且由检测装置240获得来自样品室230中的样品230的发射的光。发射滤波器265与明场光源220、明场光束收缩装置225、样品室230、显微物镜206和检测装置240同线。示例性检测装置是可从奥林巴斯美国公司(Center Valley, PA)买到的CXD相机。来自检测装置240的图像传送给具有分析软件211的计算机260。如图2中所示，该系统包括至少一个用于样品室230中样品的荧光成像的荧光光源210。荧光光源210通过荧光束收缩装置215发射激发光。在荧光检测过程中，光闸228与明场光源220同线地机械移动以阻止来自明场光源220的白光在荧光成像过程中与样品室230中的样品相互作用。图2显示了一套荧光光源和荧光光束收缩装置。两套或多套荧光光源和荧光束收缩装置可用于荧光激发和发射检测。图3显示具有两套荧光激发光源的这种系统。利用在相同样品上可得的两套或多套(例如3或4套)荧光激发和发射，可以获得可变的和/或更强的激发，以及超过一种荧光标记可用于高水平的分析。图4A和4B是显示了示例性细胞计数系统的不同视图的照片。因此，本发明的细胞计数系统包括荧光激发的非传统设计以便该系统能允许两个或多个斜入射激发光束。这种新方式极大地解放了系统的整体设计，并使多个光源能够以各种不同的入射角放置。本文所述的细胞计数系统捕获样品室中细胞或生物分子明场和荧光图像，分析细胞或生物分子的数目、各细胞的大小和荧光强度，然后将这些数据转换成浓度、大小和荧光直方图散点图。本发明的细胞计数系统可用于各种生物分析和其他应用。
一个方面，本发明一般地涉及用于微观物体成像的系统。该系统包括配置为容纳样品中要成像的悬浮液的样品室，其中样品室包含允许暴露样品的光学透明窗；至少一个能够通过所述窗为样品提供荧光激发光束的荧光光源；能够为样品提供明场光束的明场光源；和至少一个用于检测来自样品的光信号的光检测装置，从而形成微观物体的至少一个图像，其中荧光激发光束具有与所述窗的表面平面垂直以外的入射角。在某些优选的实施方案中，该系统包括至少两个荧光光源，其能够为样品同时提供两个具有相同(或不同)波长的激发光束。在某些优选的实施方案中，该系统包括多个荧光光源，其能够为样品同时提供多个具有相同(或不同)波长的激发光束。在某些实施方案中，突光激发光束相对于样品室窗的表面平面的入射角为约10°到约80° (例如，约30°到约70°、约35°到约55°、或低于约45°、大于约45°和小于约90°、或约45° )。在某些实施方案中，两个或多个荧光激发光束相对于所述窗的表面平面具有相同的入射角。在某些实施方案中，两个或多个荧光激发光束相对于所述窗的表面平面具有不 同入射角的组合。在某些实施方案中，两个或多个荧光激发光束具有不同的波长。在某些实施方案中，两个或多个荧光激发光束具有相同的波长。激发光源可以具有可选择的激发波长。可成像、监测、分析、测量或计数的微观物体包括但不仅限于，微珠、细菌、藻类、真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、蛋白质、DNA分子和表面标志物。在某些实施方案中，优选的微观物体包括生物分子和细胞。在一些优选的实施方案中，样品室被覆盖(或封闭)。样品室可以具有固定的深度，其范围是约I μ m到约Ι,ΟΟΟμπι。在一些优选的实施方案中，固定深度的范围是从约Iym到约200μπι(例如，从约IOym到约100 μ m)。覆盖的样品室可配置为容纳约I μ L到约1，000 μ L的样品体积。在某些优选实施方案中，覆盖的样品室可配置为容纳为约I μ L到约500 μ L(例如约I μ L到约100 μ L)的样品体积。荧光光源可以发射范围从约300nm到约10，OOOnm(例如从约300nm到约2，OOOnm或从约300nm到约1，OOOnm)的光束。在另一个方面，本发明一般地涉及用于计数细胞或生物分子的系统。该系统包括配置为容纳样品中的细胞或生物分子的悬浮液的覆盖的样品室，其中样品室包含允许暴露样品的光学透明窗；两个或更多个荧光光源，其各能够通过所述窗为样品独立提供荧光激发光束，其中各个突光激发光束具有与所述窗的表面平面垂直以外的入射角；能够为样品提供明场光束的明场光源；至少一个用于检测来自样品的光信号的光检测装置；和用于控制到达样品的明场光束通道的光闸。而在另一个方面，本发明一般地涉及用于测定生物样品的特征的方法。该方法包括通过指引明场光束射到样品上来获得生物样品的至少一个静态的明场图像；通过指引激发光束到样品上来获得生物样品的至少一个静态的荧光图像；和比较该至少一个明场图像和该至少一个荧光图像来确定生物样品的特征，其中激发光束与明场光束成斜角。在某些优选的实施方案中，通过指引至少两个激发光束到样品上激发来获得荧光图像。
在某些其他的优选实施方案中，通过指引多个(例如3、4个)激发光束到样品上激发来获得荧光图像。各个激发光束可以具有与明场光束相同(或不同)的斜角。激发光源可以发射范围从约300nm到约10，OOOnm(例如从约300nm到约2，OOOnm或从约300nm到约1，OOOnm)的光束。而在另ー个方面，本发明一般地涉及用于检测样品中生物分子的方法。该方法包括通过指引明场光束射到样品上来获得生物样品的至少ー个静态的明场图像；通过指引激发光束到样品上来获得生物样品的至少ー个静 态的荧光图像；和比较该至少ー个明场图像和该至少ー个荧光图像来确定生物样品的特征，其中激发光束与明场光束成斜角。在某些实施方案中，激发光束与明场光束成约45°角。在某些实施方案中，激发光束与明场光束成小于约45°的角。在某些实施方案中,激发光束与明场光束成大于约45°的角。而在另ー个方面，本发明一般涉及用于确定样品的细胞群中特定类型细胞的浓度或计数的方法。该方法包括使包含细胞的样品与特异性结合样品中特定类型细胞的荧光标记试剂接触；将样品上样到具有已知高度的覆盖的样品室中，其中细胞群悬浮在样品室中；获得样品中细胞群的至少ー个静态的明场图像；获得样品中细胞群的至少ー个静态的荧光图像；和比较明场图像的细胞计数的荧光图像的细胞计数来确定细胞群中特定类型细胞的浓度或细胞计数，其中激发光束与明场光束成斜角。本发明具有至少两个优于以往设计的独特优势。第一个优势是多发射光整合的灵活性，它采用多个LED和多个滤波器以进行多色荧光检測。第二个独特优势是降低了由从激发泄漏到发射滤光器的光所引起的背景。此外，由于激发光是斜入射的，通过物镜反射回来的散射光较少，从而进一歩降低了背景。可使用本发明的方法分析的样品包括得自或源自活生物体的生物物质。通常样品包括细胞、组织或生物分子，如蛋白质、多核苷酸(如DNA或RNA)、有机物质以及任何上述物质的组合。这些样品包括，但不仅限于，头发、皮肤、组织、培养的细胞、培养的细胞介质和体液。组织是连接的细胞和/或细胞外基质物质的团，例如，中枢神经系统组织、神经组织、眼组织、肝组织、胎盘组织、乳腺组织、胃肠道组织、肌肉骨骼组织、泌尿生殖系统组织等等，例如来自人类或其他哺乳动物的，并包括与细胞和/或组织相关的连接物质和液体物质。体液是源自于例如人类或其它哺乳动物的液体物质。这种体液包括，但不仅限于，血液、血衆、血清、血清衍生物、胆汁、痰、唾液、汗液、羊水、乳腺液(mammary fluid)和脑脊液(CSF)，如腰椎或脑室CSF。样品也可以是包含细胞或生物物质的介质。本发明的系统也可以用于探測(interrogate)细胞系。细胞系是指可以在给定的合适的培养基和条件下可以无限生长的特定细胞。本发明的系统可用于探测任何类型的细胞系。细胞系可以是哺乳动物细胞系、昆虫细胞系或植物细胞系。示例性的细胞系可包括肿瘤细胞系或干细胞系。
实施例使用Lumenera Vision照相机和标准的Thor实验室部件构成仪器(图2)。带有160mm镜头筒的相机安置于顶部并且带有发射滤波器的标准DIN物镜直接位于物镜上方。荧光激发光源以约42°安置于样品台上方，使光束中心照射样品区域。样品台周围同时设置多个LED。样品制备100和O. 8%的UV突光珠(LinearFlow, Invitrogen)用于测试仪器设置的可行性。此外，也对非荧光珠的非特异性信号进行了测试。将100%的UV、蓝色、緑色和红色荧光珠(LinearFlow, Invitrogen)混合,并用来测试多发射的仪器设置的可行性。使用AdobePhotoshop叠加获得的图像(图5)。降低背景信号仅利用Nexcelom计数载片而无样品以斜入射使用蓝色、绿色和UV LED获取图像来测定该方法的背景效应。采用各种不同的曝光时间和用不同的LED获取图像来与滤波器室方法进行比较(图6)。 多个LED信号增强通过利用I至4个LED和测量珠信号来比较信号增强(图7、8、10)。这些均采用高强度珠和低強度珠进行，其中O. 8%的最低百分比荧光珠能够成像(图9)。多发射设置通过利用斜入射照明方法，多荧光发射成为可能。在图5中，使用各种颜色获取四个图像并使用Adobe Photoshop进行合并。在明场图像和突光图像之间观察到清晰的匹配四种不同类型的珠，这确认了多重荧光检测设置的使用。背景信号降低通过使用斜入射方法，蓝、绿和UV LED的背景显著降低。在图6中，蓝、绿和UV LED的背景降低分别为约2、8和3倍。因此，检测限显著提高(从而允许各种不同激发光源或荧光团的较低的荧光)。蓝、绿和UV LED的背景降低分别为2、8和3倍。此外，信号的增强与LED的数目线性相关；因此，在使用4个LED的情况下，存在四倍的增强。对于4个LED，信噪比(S/N)，Ni = N/2、8或3和V =4得到蓝色、绿色和UV LED的最终S/N增强为8、32和12倍。通过引用引入本文中对其他资料，如专利、专利申请、专利公开、期刊、图书、报纸、网站内容进行了參考和引用。此处通过引用引入为所有目的整体引入所有这些文献。等同代表性的实例意图是为了帮助说明本发明，它们没打算，也不应被解释为限制本发明的范围。事实上，本发明的各种修改和许多进一步的实施方案，除本文所显示的和描述的那些，对于本领域的技术人员来说从本文全部内容(包括实施例和本文包括的科学和专利參考文献的引用)而成为显而易见的。实施例包含了重要的附加信息、例证和指导，其可在不同的实施方案中及其等同方案中用于本发明的实施。
权利要求
1.一种用于微观物体的成像系统，包括 配置为容纳样品中待成像物体的悬浮液的样品室，其中所述样品室包含允许暴露样品的光学透明窗； 至少一个能够通过所述窗为样品提供突光激发光束的突光光源； 能够为样品提供明场光束的明场光源；和 至少一个用于检测样品的光信号的光检测装置，从而形成所述微观物体的至少一个图像， 其中所述荧光激发光束具有与所述窗的表面平面垂直以外的入射角。
2.权利要求I的系统，其中所述系统包括能够为样品同时提供具有相同或不同波长的两个激发光束的至少两个荧光光源。
3.权利要求2的系统，其中所述系统包括能够为样品同时提供具有相同或不同波长的四个激发光束的至少四个荧光光源。
4.权利要求I的系统，其中所述荧光激发光束相对于所述窗的表面平面的入射角为约10。到约 80°。
5.权利要求I的系统，其中所述荧光激发光束相对于所述窗的表面平面的入射角为约30。到约 70。。
6.权利要求I的系统，其中所述荧光激发光束相对于所述窗的表面平面的入射角为约35。到约 55°。
7.权利要求I的系统，其中所述荧光激发光束相对于所述窗的表面平面的入射角为约45。。
8.权利要求I的系统，其中所述荧光激发光束相对于所述窗的表面平面的入射角为小于约45°。
9.权利要求I的系统，其中所述突光激发光束相对于所述窗的表面平面的入射角大于45。并小于90°。
10.权利要求2的系统，其中所述至少两个荧光激发光束各具有相同的相对于所述窗的表面平面的入射角。
11.权利要求2的系统，其中所述至少两个荧光激发光束相对于所述窗的表面平面的入射角不同。
12.权利要求10的系统，包含具有相对于所述窗的表面平面的相同入射角的多个荧光激发光束。
13.权利要求10的系统，包含具有相对于所述视窗的表面平面的不同入射角的多个荧光激发光束。
14.权利要求10或11的系统，其中所述激发光束具有不同的波长。
15.权利要求10或11的系统，其中所述激发光束具有相同的波长。
16.权利要求10或11的系统，其中所述激发光束包含可选择的波长。
17.权利要求I的系统，其中所述微观物体选自于微珠、细菌、藻类、真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、蛋白质、DNA分子和表面标志物。
18.权利要求17的系统,其中所述微观物体选自于蛋白表面标志物、弱突光标记和DNA分子。
19.权利要求I的系统，其中所述微观物体包含生物分子。
20.权利要求I的系统，其中所述样品室被覆盖。
21.权利要求20的系统，其中所述样品室具有固定的深度。
22.权利要求21的系统，其中所述固定的深度的范围为约Ιμπι到约Ι,ΟΟΟμπι。
23.权利要求22的系统，其中所述固定的深度的范围为约Ιμπι到约200μ m。
24.权利要求23的系统，其中所述固定的深度的范围为约10μ m到约100 μ m。
25.权利要求20的系统，其中所述覆盖的样品室配置为容纳约Iμ L到约1，000 μ L的样品体积。
26.权利要求25的系统，其中所述覆盖的样品室配置为容纳约Iμ L到约500 μ L的样品体积。
27.权利要求26的系统，其中所述覆盖的样品室配置为容纳约Iμ L到约100 μ L的样品体积。
28.权利要求I的系统，其中所述至少一个荧光光源包含范围为约300nm到约10,OOOnm的波长。
29.权利要求28的系统，其中所述至少一个荧光光源包含范围为约300nm到约2，OOOnm的波长。
30.一种用于计数细胞或生物分子的系统，包括 配置为容纳样品中细胞或生物分子的悬浮液的覆盖的样品室，其中样品室包含允许暴露所述样品的光学透明窗； 两个或更多个荧光光源，各自能够通过所述窗为样品独立地提供荧光激发光束，其中各荧光激发光束具有与所述窗的表面平面垂直以外的入射角； 能够为样品提供明场光束的明场光源； 至少一个用于检测样品的光信号的光检测装置；和 用于控制明场光束到达样品的通道的光闸。
31.权利要求30的系统，其中所述系统包括能够为样品同时提供具有相同或不同波长的两个激发光束的四个荧光光源。
32.权利要求31的系统，其中所述四个荧光激发光束各具有相对于所述窗的表面平面约10°到约80°的不同的入射角。
33.权利要求31的系统，其中所述四个荧光激发光束各具有相对于所述窗的表面平面约10°到约80°相同的入射角。
34.权利要求33的系统，其中所述四个荧光激发光束各具有相对于所述窗表的面平面约45°的入射角。
35.权利要求30的系统，其中所述细胞选自于由选自细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞的物体组成的组。
36.权利要求35的系统，其中所述细胞或生物分子选自于细菌、藻类、真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、蛋白质、DNA分子和表面标志物。
37.权利要求30的系统，其中所述样品室具有固定的深度。
38.权利要求39的系统，其中所述固定深度的范围为约Iym到约Ι,ΟΟΟμπι。
39.权利要求40的系统，其中所述固定深度的范围为约Ιμπι到约200μπι。
40
41
42.权利要求41的系统，其中所述固定的深度的范围为约10μ m到约100 μ m。
43.权利要求30的系统，其中所述至少一个荧光光源包含范围为约300nm到约10，OOOnm的波长。
44.权利要求43的系统，其中所述至少一个荧光光源包含范围为约300nm到约2，OOOnm的波长。
45.一种用于测定生物样品特征的方法，包括 通过指引明场光束到样品上来获得所述生物样品的至少一个静态明场图像； 通过指引激发光束到样品上来获得所述生物样品的至少一个静态荧光图像；和 比较该至少一个明场图像和该至少一个荧光图像来确定所述生物样品的特征， 其中所述激发光束与所述明场光束成斜角。
46.权利要求45的方法，其中所述荧光像是通过指引至少两个激发光束到样品上激发而获得的。
47.权利要求46的方法，其中所述荧光像是通过指引四个激发光束到样品上激发而获得的。
48.权利要求46的方法，其中所述激发光束各与所述明场光束成相同的斜角。
49.权利要求48的方法,其中所述激发光束各与所述明场光束成45°角。
50.权利要求45的系统，其中所述至少一个激发光束包含范围为约300nm到约10，OOOnm的波长。
51.权利要求50的系统，其中所述至少一个激发光束包含范围为约300nm到约2000nm的波长。
52.一种用于检测样品中的生物分子的方法，包括 通过指引明场光束到样品上来获得所述生物样品的至少一个静态明场图像； 通过指引激发光束到样品上来获得所述生物样品的至少一个静态的荧光图像；和 比较该至少一个明场图像和该至少一个荧光图像来确定生物样品的特征， 其中所述激发光束与所述明场光束成斜角。
53.权利要求52的方法，其中所述荧光像是通过指引至少两个激发光束到样品上激发而获得的。
54.权利要求53的方法，其中所述荧光像是通过指引四个激发光束到样品上激发而获得的。
55.权利要求54的方法,其中所述激发光束各与所述明场光束成相同的斜角。
56.权利要求55的方法,其中所述激发光束各与所述明场光束成45°角。
57.一种用于确定样品中的细胞群中细胞类型的浓度或计数的方法，包括 使包含细胞的样品与特异性地结合样品中特定类型的细胞的荧光标记试剂接触； 将样品加载到具有已知高度的覆盖的样品室中，其中所述细胞群悬浮在所述样品室中； 获得所述样品中细胞群的至少一个静态的明场图像； 获得所述样品中细胞群的至少一个静态的荧光图像；和 比较所述明场图像的细胞计数和所述荧光图像的细胞计数来确定细胞群中特定类型细胞的浓度或计数，其中所述激发光束与所述明场光束成 斜角。
全文摘要
本发明一般地涉及用于分析和测量细胞和生物样品的分析和监测系统。更特别地，本发明涉及用于成像、测量、计数、分析和监测微观颗粒，如溶液样品中的细胞和生物分子的系统和方法。
文档编号G01N33/483GK102834718SQ201180008975
公开日2012年12月19日 申请日期2011年1月11日 优先权日2010年1月12日
发明者L·L·陈, P·李 申请人:耐克思乐生物科学有限责任公司