专利名称：一种一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物制剂技术领域。具体涉及一种一步法乙肝病毒前SI (PreSl)抗原(Ag)酶联免疫测定试剂盒及制备方法。
背景技术：
我国属于乙型肝炎病毒高发区，乙型肝炎已经成为�：ξ夜嗣裆硖褰】档纳缁峁谛晕侍猓倚透窝撞《狙灞曛疚�(HBVM)作为乙型肝炎病毒诊断的常规项目已不能满足临床，HBV-DNA、病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒前SI (PreSlAg)抗原都作为HBV在人体内感染和复制的证据。HBV为嗜肝DNA病毒，由一个不完全双链DNA组成，约3200个氨基酸，有4个开放读码框为S区、C区、P区、X区。S基因区又可分成三段，从上游开始依次为前SI (preSl)区、前S2(preS2)区和S区。PreSl原具有较强的免疫原性，是由108或119个氨基酸组成。HBV以前SI区氨基酸21-47片段作为结合部位结合肝细胞，只要这一片段完好就有传染性和高度的免疫源性。PreSl抗原出现在急性乙型肝炎病毒感染的最早期，比HbeAg出现早，是早期传染性的标志。乙型肝炎病毒的大量复制，导致大量的PreSlAg表达，刺激机体产生较强的免疫应答，从而导致大量肝细胞损伤，并认为PreSl作为HBV的外壳蛋白成份，在HBV感染宿主细胞的过程中起着关键的作用，最重要的介导部位是前SI蛋白的氨基(AA)21-47片段，变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。PreSl在病毒感染机体的整个周期中，PreSl的独特作用，使其能够较充分的反应机体的体液免疫状况，直至病程的转阴过程，如急性肝炎时PreSlAg阴转是病毒清除的最早迹象，反之，PreSlAg持续阳性，急性肝炎将发展至慢性肝炎。因此，PreSlAg与HBV-DNA在反映乙肝病毒复制有良好的一致性。PreSlAg较HBeAg更敏感地反映HBV复制的情况。但是目前普遍使用双抗体夹心法检测乙肝病毒PreSl抗原，具有很好的特异性，但是单纯利用无力吸附吧单克隆抗体或者多克隆抗体吸附在酶标板上会存在单抗使用量大，活性损失大，特别是批间精密度差等缺点，而将亲和素包被在板上，再加入生物素化的抗体，则可以很好的解决这一问题，其不但可以减少批间差，而且可以在检测过程中可一步直接加入样品血清和酶标记抗体进行反应，形成固相亲和素-生物素话抗体-乙肝病毒PreSl抗原-酶标抗PreSl抗原抗体复合物，然后加入底物缓冲液甲和乙进行反应，就可以定量分析血清中的乙肝病毒PreSl抗原的含量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决传统酶标板批间差不足的问题，设计并建立了一步法PreSl抗原的检测试剂盒。本发明提供了一种“一步法PreSl抗原酶联免疫测定试剂盒”，该试剂盒是包括主要成分亲和素预先包被后加入生物素化抗乙肝病毒PreSl单克隆抗体或抗HBS抗体的酶标板包被反应条、酶标记前SI抗体、阳性对照液一支、阴性对照液一支、20倍浓洗涤液I瓶、底物缓冲液甲I瓶、底物缓冲液乙I瓶及终止液(2N H2S04) I瓶组成。1、抗体制备(I)利用HBV-DNA重组PreSl Ag基因片段通过原核表达或者真核表达制备抗原；(2)制备抗体的制备和纯化用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤；细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗PreSl抗体，其纯度95%以上。(3)用亲和素先包被酶标板，并加入生物素标记的抗乙肝病毒PreSl单克隆抗体或抗HBS进行二次包被反应,制成抗体预包被反应条48-96孔；(4)辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗乙肝病毒PreSl抗体酶联，制成酶标抗体；(5)配制阳性对照液、阴性对照液；(6)配制20倍浓缩洗液；(7)配制底物缓冲液甲；(8)配制底物缓冲液乙；(9)配制终止液(2N H2S04)。(10)分装上述试剂盒除预报被板其余七种成分，按需要分装在小瓶或尖底离心管中；(11)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密性、稳定性合格；(12)组装成成品。2、本发明的试剂盒在使用时可以如下操作(I)取出已包被条孔或板，恢复至室温。(2)配液将浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释备用(20倍浓洗涤液lml+19ml蒸馏水即为工作液)。(3)加样每孔加待检血清50ul，各板设阳性对照一孔(50ul)，阴性对照一孔(50ul)，空白对照一孔(加蒸馏水50ul)，然后除空白对照孔外，各孔加酶标记液50ul，(4)温育用封板膜封板后置37°C温育30分钟。(5)洗涤小心揭掉封板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(6)每孔加入显色液A、B各I滴(50ul)，轻轻振荡混匀，37°C避光显色15分钟(7)测定OD值每孔加终止液I滴(50ul)，轻轻振荡混匀，设定酶免分析仪波长于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定各孔OD值。(8)结果判定阴性对照(A值)*2. 5 =临界值(cut off值)，阴性对照高于O. 05时按实际OD值算，阴性对照小于O. 05按O. 05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。本发明的试剂盒能非常专一地检测患者血清中HBsAg-PreSl蛋白的浓度。它具有简便、灵敏和稳定等特点。且本试剂盒操作简便快速，采用一步法可在30分钟左右获得实验结果，比PCR检测法省时(PCR法最快需要6-8小时完成实验)，经临床试用PreSl蛋白检测阳性与PCR检测的HBV-DNA阳性有很好的符合率，本试剂盒和PCR法相比，PCR需贵重的仪器设备，消耗性试剂昂贵，收费价又高，而本试剂盒整个实验中无需贵重仪器设备，消耗性试剂便宜且收费价低廉，能适用于各级医院及临床测试中心，也可用于流行病学普查。一步法PreSl Ag试剂盒，具有简便、灵敏、重复性好的优点，能检出完整HBV，将可被普遍使用。
具体实施例方式实施例11、制备一步法乙肝病毒前SI蛋白酶免试剂盒的生产步骤1、生物素化抗体制备(I)纯化包被抗体(HBsAb):用重组抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗PreSl抗体，其纯度95%以上。效价大于10万。(2)生物素偶联抗PreSl抗体用常规方法将生物素(BNHS)溶于N，N_二甲基酰胺(DMF)配成lmg/Ml，用O.1mol/L pH值为9. O的NaHC03将纯化的抗PreSl抗体稀释成l_2mg/mL，按BNHS与抗体的容积比为1: 8或重量比为1: 7左右混合，室温搅拌下反应2-4h，装入透析对O. 05mol/LpH值为7. 2的PBS，4°C透析过夜，结合物加等体积的甘油，小量分装，_20°C —下保存备用。2、酶标记抗体制备(I)抗体制备基因重组的PreSl Ag免疫豚鼠得抗PreSl抗体或重组的PreSl Ag免疫Balb/C小鼠得腹水，抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗PreSl抗体，其纯度95%以上。效价大于10万。(2)酶标记抗体制备抗PreSl抗体用过碘酸钠法与辣根过氧化物偶联(3)酶标记抗体浓度选定采用方阵滴定法选择酶标记抗体的工作浓度大于1: 2000。PreSl重组抗原从10ug/ml倍增稀释，包被酶标板，加梯度稀释的酶标抗体测定，以确定最适稀释度。3、预包被抗体板的制备(I)包被用O. 05M的pH值为4. 5-5. O的柠檬酸缓冲液配制所需浓度的亲和素包被液，将包被液加入固相载体酶标上，置湿盒中加盖，40C过夜甩干。(2)洗涤用生理盐水洗涤三遍，以去除剩余亲和素。(3)封闭Na2HP04.12H202.6g·
NaH2P04. 12H200. 4g
20%Tween-202. 5mL
NaCl8.2g
BSAIOg Proclin300 ImL
重蒸水定容至lOOOmL调整PH至7. 2，将封闭液300 μ L加入微孔板各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复三次，甩掉封闭液，拍干。(4) 二次反应包被将生物素化的抗PreSl抗体用O. 02Μ的PBS稀释至合适浓度，加110 μ L于微孔板各孔中，置湿盒中加盖，40C过夜甩干。用O. 02Μ的PBS溶液洗涤三遍并抽湿干燥，放入有干燥剂铝箔袋封存备用。4、阳性对照的制备HBeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者血清。600C放置I个小时，除菌过滤，用本药盒测定A值> O. 3，备用，分装。5、阴性对照的制备用本试剂盒测定正常人血清A值在0-0. 03，加万分之二硫柳汞，分装备用。6、酶标单抗配置用含10%小牛血清和90% O. 15MPBS稀释Ant1-presl-HRP，稀释20倍，分装。7、酶标单抗稀释液
BSAO.5gNa2HP04. 12H202.6g
NaH2P04. 2H20O. 4g
NaCl8.2g
20%Tween-20100ml
Proclin300ImL
调整pH至7. 28、底物液A
Na2HP04. 12H201. 7g
柠檬酸.H200. 5g
3%H202200 μ I
重蒸水100ml
调整pH至5. 0
9、底物液BNa2HP04. 12H201. 7g柠檬酸·H200. 5g重蒸水100ml调整pH 至 5· O 后，加入 IOmlDMSO 含 60mgTMB 的溶液 25 μ I10、终止液浓H2S04IOml重蒸水80ml11、20X 洗涤液
Na2HP04.12H202. 6g
NaH2P04. 2H200. 4g
Tween-202.5 μ I
重蒸水50ml
调整 pH至7. 212、半成品及成品的组成上述(一)一(十一)步骤所得产品装入小瓶及尖底离心管中，即为半成品。抽出三份经过特异性、稳定性、灵敏度及精密度检定合格才能组装成presl试剂盒。组装成盒后还需抽出三份同半成品一样经过检定合格才能出售。实施例2一步法乙肝病毒前SI蛋白酶免试剂盒的操作步骤1、操作步骤如下(I)取出已包被条孔或板，恢复至室温。(2)配液将浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释备用(20倍浓洗涤液lml+19ml蒸馏水即为工作液)。(3)加样每孔加待检血清50ul，各板设阳性对照一孔(50ul)，阴性对照一孔(50ul)，空白对照一孔(加蒸馏水50ul)，然后除空白对照孔外，各孔加酶标记液50ul。(4)温育用封板膜封板后置37°C温育30分钟。(5)洗涤小心揭掉封板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(6)每孔加入显色液A、B各I滴(50ul)，轻轻振荡混匀，37°C避光显色15分钟(7)测定OD值每孔加终止液I滴(50ul)，轻轻振荡混匀，设定酶免分析仪波长于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定各孔OD值。(8)结果判定阴性对照(A值)*2. 5 =临界值(cut off值)，阴性对照高于O. 05时按实际OD值算，阴性对照小于O. 05按O. 05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。
权利要求
1.ー种“一歩法こ肝病毒PreSl抗原酶联免疫测定试剂盒”，其特征在于该试剂盒包括 (1)用亲和素先包被酶标板，并加入生物素标记的前SI单克隆抗体或抗HBS进行二次包被反应，制成抗体预包被反应条48-96孔； (2)酶标记前SI抗体； (3)阳性对照液I支、阴性对照液I支； (4)20倍浓缩洗液I瓶； (5)底物缓冲液甲I瓶； (6)底物缓冲液こI瓶； (7)終止液(4NH2S04) I瓶组成。
2.—种如权利I所描述的ー种“ー步法こ肝病毒PreSl抗原酶联免疫测定试剂盒”的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤 (1)利用HBV-DNA重组PreSlAg基因片段通过原核表达或者真核表达制备抗原； (2)制备抗体的制备和纯化用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreSl抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髄瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗PreSl抗体，其纯度95%以上，效价大于10万。
(3)用亲和素先包被酶标板，并加入生物素标记的抗こ肝病毒PreSl单克隆抗体或抗HBS进行二次包被反应，制成抗体预包被反应条48-96孔； (4)辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗こ肝病毒PreSl抗体酶联，制成酶标抗体； (5)配制阳性对照液、阴性对照液； (6)配制20倍浓缩洗液； (7)配制底物缓冲液甲； (8)配制底物缓冲液こ； (9)配制终止液(2NH2S04)。
(10)分装上述试剂盒除预报被板其余七种成分，按需要分装在小瓶或尖底离心管中； (11)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密性、稳定性合格； (12)组装成成品。
3.根据权利1所述的一种“一歩法こ肝病毒PreSl抗原酶联免疫测定试剂盒”，其特征在于其中所述的抗体预包被反应条48-96孔、酶标记前抗体、阳性对照液为HBV-DNA和HBeAg均阳性血清，阴性对照液为正常人血清、浓洗涤液为磷酸-Tween-20缓冲液，底物缓冲液甲为H202、底物缓冲液乙为3. 3’，5. 5’ -四甲基联苯胺和终止液为(4N H2S04)。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述亲和素包被固相载体酶标板采用一下方法用0. 05M的pH值为4. 5-5. 0的柠檬酸缓冲液配制所需浓度的亲和素包被液，将包被液加入固相载体酶标上，并洗涤、封闭，再加入生物素化的こ肝病毒PreSl单克隆抗体或抗HBS抗体进行反应后，经洗涤、抽湿干燥后用铝箔袋密封。
5.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述浓缩洗涤液配方为含0.02MPBS,8.9%NaCl 和 0. 5% Tween-20 o
全文摘要
本发明提供了一种“一步法PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”，能非常专一地检测患者血清中HBsAg-PreS1蛋白的浓度。该试剂盒是包括主要成分亲和素预先包被后加入生物素化抗乙肝病毒PreS1单克隆抗体或抗HBS抗体的酶标板包被反应条、酶标记前S1抗体、阳性对照液一支、阴性对照液一支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶及终止液(2NH2SO4)1瓶组成。本发明具有较好的均一性，特异性，灵敏度，采快速简便，用一步法可在30分钟左右获得实验结果，比PCR检测法省时(PCR法最快需要6-8小时完成实验)，经临床试用PreS1蛋白检测阳性与PCR检测的HBV-DNA阳性有很好的符合率。
文档编号G01N33/577GK103048456SQ20121037696
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者张年 申请人:武汉康珠生物技术有限公司
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