专利名称：微柱凝胶法血小板血型抗原抗体检测技术和试剂盒的制作方法
本项发明属医学生物技术生物制品领域(以下简称微柱凝胶血小板配型技术)，本发明在世界上首次将微柱凝胶红细胞抗原抗体检测技术与红细胞间接血凝试验结合，建立了血小板血型配型的试验技术方法和制备了试剂盒，同时也可用于血小板血型检定，血小板抗体筛选，检测及确定试验。
血小板输血前应该进行配型试验，即检测病人(受血者)血清是否存在供者血小板相应的同种异体血型抗体，阴性结果表明受血者血清不存在该血小板的抗体，称之供者受者血小板血型相容，该血小板输入该病人体内是安全的，不会被排斥，不会引起其它免疫病理反应；阳性结果则表明受者血清中存在该血小板相应抗体，与供者血小板血型不相容，将会发生排斥反应等，不能将该血小板输给病人。血小板血型配型的意义即为病人选择血型相容的供者血小板。但迄今为止，血小板配型试验并没有成为临床血小板输血前的常规检测项目，其原因是没有能在数分钟内可以完成的快速简单的易于标准化的血小板血型检测方法。
血小板细胞膜同种异体抗原分二类，第一类为血小板和其它细胞共有的抗原；ABH抗原和HLA-I类抗原；第二类抗原为血小板特异性抗原。血小板同种异体抗原抗体反应引起的临床综合症主要有1、胎儿及新生儿同种免疫血小板减少症；2、输血后紫癜；3、血小板输血无效症；4、免疫血小板减少症等等。对这些病症的检验预防和治疗都需要血小板血型的检测技术。血型相容的血小板输血是有效地治疗手段。
本发明微柱凝胶血小板配型技术，其微柱凝胶反应不同于传统的血凝反应，传统的血凝反应是红细胞抗原抗体在液体介质中，在玻片上或试管中进行，而微柱凝胶反应是在微柱体积中的凝胶介质中进行的血凝反应。微柱凝胶技术比较传统的血凝技术敏感性强，结果易于判定和较长期保存，特别是操作简单，省略了洗涤过程，试验在更少时间内完成。微柱凝胶技术目前在世界先进国家已广泛应用于红细胞抗原抗体检测的红细胞血型血清学检测中。本发明是世界上首次将目前微柱凝胶试验做以修改，用于血小板血型配型等血小板抗原抗体反应的试验中，能够彻底解决血小板血型检测中长期以来始终未能解决的问题。
由于血小板血型在临床和输血实践中的重要意义，因此已有不少血小板血型检测技术，但都未能成为临床常规试验，除ABO血型可以通过检测受者、供者红细胞确定其两者血小板ABO血型的相容性，在临床和输血实践中，迄今为止还很难应用现有的技术对每一次血小板输血进行应该常规进行的配型试验。目前已存在的血小板血型检测技术有血小板免疫荧光试验、酶联免疫吸咐试验；混合被动血凝技术、混合细胞粘附试验(固相技术)、特异的单克隆抗体对血小板抗原固定试验等，这此试验的操作程序都比较复杂，需要时间长，有的所需设备仪器昂贵。所形成的事实迄今为止在全世界血小板血型配型都没有成为临床血小板输血的常规检测项目。
本发明微柱凝胶免疫检测一血小板配型技术的程序是1、制备指示红细胞O型健康人红细胞与抗人球蛋白致敏，制备成标准的指示红细胞试剂；2、将指示红细胞与病人(血小板输血受者)血清孵育1～5分钟之内均可；3、将待输的血小板指示红细胞依次加入微管凝胶反应腔中，离心1分钟1，000／rpm，取出观察结果见附图
(附图所示微柱凝胶免疫反应格局，表明含O型红细胞-抗人IgG加病人血清的微柱凝胶管，5个管均呈阳性(4+～1+)，含O型红细胞-抗人IgG加健康人血清的微柱凝胶管呈阴性“-”，即阴性对照成立)。阳性以“±至4+”表示，指示红细胞捕获的血清中抗体与血小板特异性结合，离心后指示红细胞与血小板复合物浮于凝胶表面或胶中，该血小板输入该病人体内必然引起排斥和／或其它免疫病理反应，表明该病人与待输血小板血型不相容，即病人血清中存在待输血小板的相应抗体；阴性结果以“-”表示，指示红细胞上抗体与血小板未发生反应，指示红细胞沉淀于微管中凝胶尖底部，表明该病人血清中没有该血小板相应的抗体，两者血小板血型相容，该血小板可以输给该病人。
本发明用于血小板血型检测指示红细胞与已知特异性的血小板抗体经孵育结合后，与被测血小板依次加入微柱凝胶中，阳性结果即表明该特异性抗体相应的血小板血型。
本发明用于病人血小板抗体筛选试验用随机二人份混合血小板检测病人血清，如发生微柱凝胶试验阳性反应，表明病人血清中存在血小板抗体。
本发明用于病人血小板抗体检测及确定性试验用已知血型的血小板检测病人血清称之血型抗体检测血小板血型；用已知血型的多份血小板的血小板谱细胞检测病人血清称之抗体特异性确定试验。本发明之前，由于血小板血型抗原抗体检测方法复杂很难大量标本工作，因此在我国血小板血型抗原频率，抗体发生频率等血小板同种异型多态性研究和应用工作都没能系统进行，本发明使之成为可能性。
综上所述，在世界上首次将用于红细胞抗原抗体检测的微柱凝胶技术用于血小板配型和血小板抗原(血型)检测，血小板抗体筛选、血小板抗体特异性检定及鉴定。
本发明实用性比以往的方法更为简单、省时及可靠、易标准化的方法和试剂盒，使得临床常规可以进行血小板血型配型，确保了血小板安全输血，也使得血小板血型抗原(血型)检测、血小板抗体筛选、血小板特异性检定以及鉴定都可以系统地大规模地进行。
本发明原理也可适用于白细胞、淋巴细胞及其它人体组织细胞的配型试验及血型检定试验，应用于器官移植相关的配型及其它有关检测项目，具备了新颖性、创造性、实用性条件，故向国家专利局及有关部门申报发明专利。
权利要求
1．一种简单、快速、可靠的微柱凝胶法血小板配型检测技术及试剂盒适用于血小板配型，血小板血型检定，血小板抗体筛选，血小板抗体特异性检测及鉴定。包括微柱凝胶试验试剂盒制备方法和用于检测血小板细胞膜上同种异体抗原抗体(血型抗原抗体)免疫反应的胶凝集试验方法及其应用。
2．根据权利要求1的方法，试剂盒制备方法包括微柱凝胶、微型柱(体积25μl~500μl)+葡聚糖凝胶、微型柱为单管和／或2管至12管一联；指示红细胞健康人O型红细胞(用筛检红细胞和谱细胞检测为阴性)加单克隆抗体或多克隆抗体抗人IgG致敏、病人自身红细胞；1人份或2至200人份为一个试剂盒，每一人份即一个微柱凝胶管。
3．根据权利要求1的方法，其中胶凝集试验方法及其应用如下配型试验(1)指示红细胞(同2．)与抗人IgG(单克隆或／或多克隆抗体)反应致敏的方法，应用病人红细胞的方法；(2)指示红细胞与病人血清反应；(3)依次加血小板与病人血清反应后的指示红细胞于微柱凝胶中；(4)离心；(5)结果阳性为“±～4+”，两者不相容；阴性为“-”，两者相容。血小板抗体筛选(1)指示红细胞(同2．)与抗人IgG(单克隆或／和多克隆抗体)反应，致敏红细胞；(2)指示红细胞与病人血清反应；(3)随机选两人份血小板混合；(4)依次加入微柱凝胶中血小板及指示红细胞；(5)离心后结果阳性“±～4+”表明病人血清中有该血小板抗体；“-”表明病人血清中无该血小板相应抗体。血小板血型检定(1)指示红细胞(同2．)；(2)已知特异性血小板抗体与指示红细胞反应；(3)依次加入微柱凝胶中待测血小板及与已知特异性血小板抗体结合的指示红细胞(4)离心后结果阳性(±～4+)表明血小板血型为该血小板抗体已知的特异性一致；阴性结果“-”表明该血小板与该血小板已知的特异性抗体不一致。血小板抗体特异性检定及鉴定用已知某血小板血型抗原阴性一人份、阳性血小板一人份检测病人血清称之血小板特异性检定，而用已知的具有和缺失系统的血小板抗原的多人份血小板检测病人血清称之血小板特异性确定试验。(1)指示红细胞(同2．)；(2)指示红细胞与待测的血小板抗体孵育结合；(3)取已知血小板血型的血小板，依次加入该血小板及经过(2)步程序的指示红细胞；离心后结果，阳性表明待测抗体与已知特异性血小板抗原一致，阴性表明，两者不一致。
4．从属
权利要求
器官移植工作中和／或组织配型工作中，应用微柱凝胶技术及试剂盒，靶细胞为供者的组织细胞或血细胞。
全文摘要
本发明微柱凝胶法血小板血型抗原抗体检测技术和试剂盒属生物制品领域。本发明将微柱凝胶红细胞抗原抗体检测技术与红细胞间接血凝试验结合,建立了血小板血型配型的试验技术方法并制备了试剂盒,适用于各种血小板同种异体抗体产生的临床综合症如输血后紫癜、血小板输用无效症等病症的诊断预防和治疗。用此技术进行的检测方法比传统技术简便,十分钟内可完成试验、易于标准化,在国内外首次能够使血小板配型技术成为临床常规检测项目。
文档编号G01N33/50GK1282871SQ00105438
公开日2001年2月7日 申请日期2000年3月29日 优先权日2000年3月29日
发明者李勇, 刘莹, 张立身, 杨贵贞, 刘景汉, 朱建春, 童军, 蔡红霞, 王玉华 申请人:长春生物制品研究所
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