专利名称：肝细胞癌相关基因和蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体地是癌症研究领域。特别地，本发明涉及新的蛋白，ZNFN3A1，其参与肝细胞癌细胞的增生机制。本发明蛋白能够被用来，例如，作为开发抗肝癌药物的靶分子。
背景技术：
肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的癌症之一，而且它的发病率在日本以及美国正逐渐升高(Akriviadis EA等，Br J Surg.1998 Oct；85(10)1319-31)。虽然最近的医学进展已经在诊断方面取得很大进步，很多HCC患者仍然是在晚期才被诊断出，而且他们的疾病依然很难完全治愈。此外，由于肝硬变或慢性肝炎患者具有HCC的高风险，它们可能形成多发肝肿瘤，或者甚至在完全除去原始肿瘤后形成新肿瘤。因此，开发高效化疗药物和预防策略是迫切关心的问题。
最近的分子生物学进展表明多步骤过程在肝癌起源和发展为结肠肿瘤的过程中构成了肝癌发生的基础。这些过程包括各种基因产物的定性和定量改变。在一HCC亚群中，在包括TP53和AXIN1在内的肿瘤抑制基因、以及诸如c-myc、细胞周期蛋白D1和s-连环蛋白等癌基因中观察到基因改变(Tanaka S等，Cancer Res.1993 Jun 15；53(12)2884-7；Satoh S等，NatGenet.2000 Mar；24(3)245-50)。在肝肿瘤细胞中的染色体区4q、6q、8p、8q、9p、9q、13q、16p、16q和17p已经报道了频繁的杂合性的丢失(LOH)(Feitelson MA等，Oncogene 2002 Apr 11；21(16)2593-604)。除了这些基因改变之外，许多基因例如TGFα的表达在改变在肝癌发生中发挥着作用(LeeGH等，Cancer Res 1992 Oct 1；52(19)5162-70)。
发明概述本发明人以前分析了肝细胞癌中基因的基因组范围内表达并鉴定了许多倾向于参与肝癌发生的基因。我们还公开了与患者体内的肝炎病毒类型、肿瘤的组织学等级以及它们的血管浸润状态相关联的基因(Okabe H等，Cancer Res.2001 Mar 1；61(5)2129-37)。虽然已经鉴定了一些肿瘤抑制基因，例如p53和p16INK4A的失活，但迄今为止还没有哪个已知的癌基因被证明在肝细胞癌中通常是激活的。
本申请提供了分离的在肝细胞癌中过表达的基因ZNFN3A1，并鉴定出一种具有锌指结构域和SET结构域的癌蛋白。该新基因ZNFN3A1的表达在HCC中常常是上调的，并倾向于通过转录激活性RNA聚合酶II复合体赋予癌细胞致癌活性，这种致癌活性，反过来，增强靶基因，包括EGFR的转录。因此，ZNFN3A1充当HCC的新的分子靶。
本发明的一个目的是提供参与肝细胞癌细胞增殖机制的新蛋白和编码该蛋白的基因，以及制备并利用它们诊断和治疗肝细胞癌(HCC)的方法。
发明人着手发现治疗HCC的药物发现的新靶标。因此，他们利用全基因组cDNA微阵列分析了HCC的表达概况。本文报道的是新的人类基因ZNFN3A1的鉴定，它的表达在大多数HCC中与相应的非癌肝组织相比显著升高。ZNFN3A1 cDNA由1622个核苷酸组成，它含有一个1284个核苷酸的开放读框，编码公认的带有锌指基元的428个氨基酸的蛋白。有意思的是，ZNFN3A1蛋白的亚细胞定位在细胞周期的进展过程中或者由于培养细胞的密度而发生改变；当细胞在S期中期到晚期或者培养在稀疏(sparse)条件下时，它在核中积聚，而当它们处于其它阶段和生长于密集条件下时，它定位于胞浆及核中。此外，ZNFN3A1直接与RNA螺旋酶KIAA0054结合，并与RNA聚合酶II形成复合体，通过该复合体与5’侧翼区“(C)CCCTCC(T)”元件的直接结合，它激活下游基因包括表皮生长因子受体(EGFR)的转录。一致地，ZNFN3A1在NIH3T3细胞中的外源表达使细胞生长增加，而用反义S-寡核苷酸阻抑它的表达导致肝细胞癌细胞显著的生长抑制。这些发现表明ZNFN3A1通过与RNA螺旋酶和RNA聚合酶II形成复合体，转录激活包括EGFR在内的靶基因，从而赋予癌细胞致癌活性，而且抑制该复合体的活性应该是有前景的治疗HCC的策略。
因此，本发明涉及参与细胞增殖的新的ZNFN3A1蛋白和编码它们的基因，以及它们的制备和应用。更具体地，本发明提供了以下这些本申请提供了促进细胞增殖和靶基因转录激活的新的人类蛋白ZNFN3A1或其功能等价体。在优选的实施方案中，ZNFN3A1蛋白包括由SEQ.ID.NO.1的开放读框编码的公认的具有锌指基元的428个氨基酸的蛋白。锌指结构域(MYND)位于密码子49-87而SET(Su 3-9，zeste增强子，Trihorrax)结构域位于密码子117-246。ZNFN3A1蛋白优选包括SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列。本申请还提供分离的由至少一部分ZNFN3A1多核苷酸序列、或者有至少15％，更优选至少25％与SEQ.ID.NO.1所示的序列互补的多核苷酸序列编码的蛋白。
本发明进一步提供新的人类基因ZNFN3A1，它的表达在大多数HCC中与相应的非癌肝组织相比显著升高。分离的ZNFN3A1基因包括如SEQ.ID.NO.1中所描述的多核苷酸序列。特别地，ZNFN3A1 cDNA包括含有1284个核苷酸的开放读框的1622个核苷酸。本发明进一步涵盖与SEQ.ID.NO.1所示的多核苷酸序列杂交并至少有15％，更优选至少25％与之互补的多核苷酸，只要它们编码ZNFN3A1蛋白或其功能等价体。这种多核苷酸的例子是SEQ.ID.NO.1的简并序列。
如本文所用，“分离的ZNFN3A1基因”是指其结构与天然存在的多核苷酸或者天然存在的跨越3个以上独立基因的基因组多核苷酸片段不同的多核苷酸。因此该术语包括，例如(a)具有其天然存在的生物体基因组中天然存在的基因组DNA分子的部分序列的DNA；(b)掺入到载体或者原核生物或真核生物基因组DNA中，从而使所产生的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不同的多核苷酸；(c)独立的分子例如cDNA、基因组片段、由聚合酶链式反应(PCR)制备的片段或者限制性片段；和(d)杂合基因，即编码融合多肽的基因的部分重组核苷酸序列。该定义具体排除的是存在于不同(i)DNA分子，(ii)转染的细胞或(iii)细胞克隆的混合物中的DNA分子的多核苷酸；例如，象存在于DNA文库例如cDNA或基因组DNA文库的中的这些多核苷酸。
因此，在一方面，本发明提供了编码本文所述的多肽的分离的多核苷酸或其片段。优选地，分离的多肽包括与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有至少60％同一性的核苷酸序列。更优选地，分离的核酸分子与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在分离的多核苷酸长度比参照序列，如SEQ ID NO1更长或相等的情况下，比较是与参照序列的全长进行的。当分离的多核苷酸比参照序列短，例如比SEQ ID NO1短的时候，比较是与相同长度的参照序列片段进行的(排除任何同源计算所需的环)。
还提供了包括ZNFN3A1蛋白和至少一个它的共激活因子的转录激活复合体。在一个实施方案中，共激活因子可以是RNA螺旋酶和/或RNA聚合酶。RNA螺旋酶可以是RNA螺旋酶KIAA0054。RNA聚合酶可以是RNA聚合酶II。在一种形式中，复合体包括ZNFN3A1蛋白、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II。转录激活复合体通过与EGFR基因5’侧翼区“(C)CCCTCC(T)”元件的直接结合，可以激活包括表皮生长因子受体(EGFR)在内的基因的转录。
本申请还提供了治疗癌症的治疗剂。治疗剂可以被描述为如(SEQ.ID.NO.3)中所示的多核苷酸序列。治疗剂还可以被描述为如SEQ.ID.NO.1中所显示和描述的ZNFN3A1多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸的至少一部分。合适的反义S-寡核苷酸是5’-GCGGGAGGATGGAGCC-3’(SEQ.ID.NO.3)。治疗剂可以适当地用来治疗肝细胞癌细胞。治疗剂的作用疗程期望可抑制肝细胞癌细胞的生长。治疗剂可以施用于哺乳动物包括人和驯化的哺乳动物。
本申请还提供了识别ZNFN3A1蛋白的抗体。部分地，还提供了ZNFN3A1基因的反义DNA、核酶及RNAi(RNA干扰物)。
进一步地，提供了筛选抗癌剂候选化合物的方法。该方法包括使ZNFN3A1多肽与候选化合物进行接触，并选择与ZNFN3A1多肽结合的化合物。
ZNFN3A1多肽还可以在共激活因子存在下，在形成ZNFN3A1多肽和其共激活因子的复合体的合适条件下，与候选化合物进行接触。然后可以选择抑制该复合体形成的化合物。共激活因子包括RNA螺旋酶和/或RNA聚合酶II。
本发明进一步提供了筛选抗癌剂候选化合物的方法，其中该方法包括使ZNFN3A1多肽、它的共激活因子以及含有多肽靶序列的DNA与候选化合物，在形成ZNFN3A1多肽和该DNA的复合体的合适条件下接触，并选择抑制该复合体形成的化合物。靶序列期望是侧接EGFR 5’区的CBS序列。
还提供了筛选抗癌剂候选化合物的方法，其中该方法包括使ZNFN3A1多肽、它的共激活因子以及具有为所述多肽和共激活因子复合体识别的转录调控区的报告基因，与候选化合物，在表达报告基因的合适条件下进行接触，并选择抑制报告基因表达的化合物。
本发明进一步提供了诊断癌症的方法，包括测定标本生物样品中ZNFN3A1基因的表达水平，将ZNFN3A1基因的表达水平与正常样品相比较，并将样品中ZNFN3A1基因的高表达水平判定为具有癌症。癌症适当地是肝细胞癌。
本发明还提供了通过用编码ZNFN3A1蛋白的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞，并表达该多核苷酸序列来制备蛋白的方法。
应当理解前述的发明概述以及下列的详细说明是优选的实施方案，并非限制本发明或本发明其它备选的实施方案。
图1A-1C描绘了A6681和ZNFN3A1在HCC中的表达。图1A描绘了通过cDNA微阵列所检测到的A6681在20个原发性HCC中的相对表达比例。它的表达在通过截留滤膜的12个临床HCC中有11个(91.7％)显著上调(Cy3和Cy5信号都大于25,000)。图1B的照片呈现了通过RT-PCR产物的溴乙锭染色所显示的描绘HCC候选基因表达(T，肿瘤组织；N，正常组织)。GAPDH的表达起内部对照的作用。图1C的照片描绘A6681在各种成人组织中的多-组织RNA印迹试验。
图2A描绘了预测的ZNFN3A1蛋白结构和蛋白基元。ZNFN3A1蛋白基元是通过简单�？楣乖煅芯抗ぞ�(Simple Modular Architecture ResearchTool，SMART)预测的。图2B描绘了ZNFN3A1和AK010447的公认氨基酸序列之间的同源性。zf-MYND[锌指蛋白(包含MYND结构域)]结构域(A)和SET[(Su(var)3-9，zeste增强子，Trithorax)]结构域(B)分别表现出94％和95％的同一性。
图3A-3R的照片显示经免疫细胞化学，尤其荧光免疫组化染色所观察到的ZNFN3A1亚细胞定位。图3A-3C的荧光显微照片显示，被表达EGFP-标记性ZNFN3A1的质粒(pEGFP-ZNFN3A1)DNA转染的SNU475细胞。FITC(g、j、m、p)、DAPI(h、k、n、q)、merge(i、l、o、r)。图3D-3F的荧光显微照片显示，表达FLAG-标记性ZNFN3A1的质粒(pFLAG-ZNFN3A1)DNA转染的SNU475细胞。抗-FLAG(d)、DAPI(e)、merge(f)。图3G-3R的荧光显微照片显示ZNFN3A1在SNU475细胞(g-1)和SNU423细胞(m-r)中的内源表达。抗-ZNFN3A1(g、j、m、p)、DAPI(h、k、n、q)、merge(i、l、o、r)。细胞以低浓度(1.25×104细胞/孔)(g-I、m-o)和高浓度(1.0×105细胞/孔)(j-l、p-r)接种。
图4A和4B描绘的是细胞周期进程对ZNFN3A1亚细胞定位的影响。图4A描绘的是通过阿非迪霉素(aphidicolin)同步化的Huh7细胞的FACS分析。通过与7.5μg/ml阿非迪霉素温育36h将细胞生长阻抑在G1期，并通过去除阿非迪霉素而自G1解除。FACS于0、4、8和12h后进行。图4B的图片显示内源ZNFN3A1蛋白在经阿非迪霉素处理而同步化的Huh7中的荧光免疫细胞化学染色。
图5A-5D描绘了ZNFN3A1在NIH3T3中的生长促进效果。图5A是描绘ZNFN3A1在NIH3T3细胞中的集落形成试验结果的图片，比较了ZNFN3A1模拟物、NIH3T3-反义ZNFN3A1和NIH3T3-有义ZNFN3A1的表达。图5B描绘了通过电子光密度测定计数的集落数。集落通过电子光密度测定计数。集落数表示为三份板的均值±SD。(*)表示由Fisher’s保护性最小显著性检验(Fisher’s protected least significant test)所测定的显著性差异(p＜0.05)。图5C的图片显示稳定表达ZNFN3A1的NIH3T3细胞的生长诱导。ZNFN3A1 mRNA在稳定-转染体(NIH3T3-ZNFN3A1)细胞中的表达通过RT-PCR测定。图5D描绘了通过锥虫蓝染色法所检测到的细胞数目的时间曲线。
图6A-6E显示设计用于阻抑ZNFN3A1的反义S-寡核苷酸的生长阻抑效果。图6A显示设计用于阻抑ZNFN3A1的有义(Se)或反义(As)寡核苷酸构建物。图6B的图片显示ZNFN3A1在SNU475细胞中的表达，所述细胞用有义(Se)或者反义(As)寡核苷酸处理24h，经RT-PCR和利用抗-ZNFN3A1抗体进行的蛋白质印迹来检测。图6C的图片显示，利用ZNFN3A1 mRNA的有义或反义寡核苷酸在Huh7、Alexander、SNU423和SNU475细胞中进行的集落形成试验。反义寡核苷酸(As)阻抑生长。图6D显示MIT试验的结果，它评估了在有义或反义寡核苷酸处理Huh7、Alexander、SNU423和SNU475细胞72小时后的细胞存活能力。图6E显示FACS分析结果，它评估Huh7细胞经有义(Se)或反义(As)寡核苷酸处理72小时后的细胞周期。
图7A-7C描绘了ZNFN3A1和RNA螺旋酶KIAA0054之间的相互作用。在图7A中，绘制了KIAA0054的保守结构域以及与ZNFN3A1结合的区域。图7B呈现了描绘酵母双杂交实验结果的图片，其中含有ZNFN3A1的pAS2-1与含有两种不同长度KIAA0054的文库载体共-转染到酵母菌株AH109中。结果显示了在酵母菌株AH109中ZNFN3A1和KIAA0054之间结合的确认信息。图7C呈现了描绘在哺乳动物细胞中ZNFN3A1和KIAA0054之间结合的确认信息的图片。来自HeLa细胞的裂解物与抗-FLAG或抗-HA抗体免疫沉淀。免疫沉淀物用抗-HA或抗-FLAG抗体通过免疫印迹分析。对裂解物直接进行免疫印迹分析，作为对照。
图8的图片证明ZNFN3A1与KIAA0054的相互作用是通过SET结构域和KIAA0054的C-末端区域介导。分析了ZNFN3A1缺失构建物在双杂交系统中与KIAA0054的C-末端区域相互作用的能力。
图9的图片证明RNA螺旋酶KIAA0054与ZNFN3A1和RNA聚合酶II在体内结合。细胞提取物是从由转染了8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1(完整)和pCMV-HA-KIAA0054(全长)表达载体的HeLa细胞制备的。提取物与抗-RNA聚合酶II抗体、抗-HA抗体或抗-FLAG抗体免疫沉淀。免疫沉淀物用抗-RNA聚合酶II抗体、抗-HA抗体或抗-FLAG抗体通过免疫印迹分析。对裂解物直接进行免疫印迹分析，作为对照。
图10A和10B证明了受ZNFN3A1调节的侯选下游基因。图10A描绘了利用含有全长ZNFN3A1的GST融合蛋白通过结合和扩增反应分离到的寡核苷酸序列。图中显示了含有随机核苷酸区域的核心序列。图10B呈现了描数个基因的延长转录本在外源表达ZNFN3A1的COS7稳定转化体中的反转录分析图片。
图11(A)图示了各种在EGFR 5’侧翼区含有公认的ZNFN3A1-结合元件的报告质粒。相对于公认的转录-起始位点的核苷酸位置由正或负数指示。(B)利用所示的报告质粒对SNU475细胞中EGFR启动子的分析。条，标准偏差(SD)。*，由Fisher’s保护性最小-显著性检验测定的显著性差异(p＜0.05)。
图12示意ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之间形成的复合体，它能调节基因转录。
发明详述除非另外明确指出，如本文所用的词语“一个”、“一种”及“这种”是指“至少一个”。
本申请鉴定了新的人类基因ZNFN3A1，它的表达在HCC中与相应的非癌肝组织中相比显著升高。ZNFN3A1 cDNA由如SEQ.ID.NO.1所示的含有1284个核苷酸的开放读框的1622个核苷酸组成。开放读框编码具有锌指基元的公认的428个氨基酸的蛋白。该蛋白被命名委员会命名为ZNFN3A1(锌指蛋白，3A亚家族(含MYND)，1)。此外，ZNFN3A1直接与RNA螺旋酶KIAA0054结合，并与RNA聚合酶II形成复合体，通过该复合体与EGFR基因5’侧翼区“(C)CCCTCC(T)”元件的直接结合，可以激活下游基因包括表皮生长因子受体(EGFR)的转录。一致地，ZNFN3A1在NIH3T3细胞中的外源表达使细胞生长增加，而用反义S-寡核苷酸阻抑它的表达导致肝癌细胞显著的生长抑制。这些发现表明ZNFN3A1通过与RNA螺旋酶和RNA聚合酶II的复合体转录激活包括EGFR在内的靶基因，从而赋予癌细胞致癌活性，而且抑制该复合体的活性应该是有前景的治疗HCC的策略。
本发明涵盖新的人类基因ZNFN3A1，包括SEQ.ID.NO.1中所述的多核苷酸序列，及其简并体和突变体，只要它们编码ZNFN3A1蛋白，包括如SEQ.ID.NO.2中所示的氨基酸序列或它的功能等价体。与ZNFN3A1功能等价的蛋白的例子包括，例如，与人类ZNFN3A1蛋白相应的其它生物体的同源蛋白，以及人类ZNFN3A1蛋白的突变体。
在本发明中，术语“功能等价体”是指受试蛋白象ZNFN3A1蛋白一样具有促进细胞增殖的活性，并通过与RNA螺旋酶或RNA聚合酶或两者形成转录激活复合体来赋予癌细胞致癌活性，这种致癌活性，反过来，增强靶基因，例如EGFR的转录。受试蛋白是否具有细胞增殖活性可以通过将编码该受试蛋白的DNA引入到表达该蛋白的细胞(如NIH3T3中)，并检测细胞增殖的促进或者集落形成活性的提高来判断。受试蛋白与RNA聚合酶或RNA螺旋酶或两者形成复合体的能力，可以通过免疫共沉淀进行分析，例如下文实施例中所描述的那些。EGRR转录的增强可以利用诸如下文实施例中所描述的那些报告质粒进一步进行测定。
制备在功能上与给定蛋白等价的蛋白的方法是本领域熟练技术人员公知的，并且包括向蛋白引入突变的已知方法。例如，本领域熟练技术人员通过定点突变法在人类ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列中引入合适的突变，能够制备在功能上与人类ZNFN3A1蛋白等价的蛋白(Hashimoto-Gotoh，T.等(1995)，Gene 152，271-275；Zoller，MJ和Smith，M.(1983)，Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)，Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W和Fritz HJ.(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)，Methods Enzymol.85，2763-2766)。氨基酸突变也能天然发生。本发明蛋白包括那些在人ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列中突变一或多个氨基酸所得的蛋白，只要所得的突变蛋白在功能上与人类ZNFN3A1蛋白等价。这样的突变体中待突变的氨基酸数目一般为10个氨基酸或更少，优选6个氨基酸或更少，并且更优选3个氨基酸或更少。
突变或修饰蛋白，具有通过缺失、添加和/或取代某一氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基而修饰的氨基酸序列的蛋白，已知能保留原始的生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666，Zoller，M.J.& Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500，Wang，A.等，Science 224，1431-1433，Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
待突变的氨基酸残基优选突变为不同氨基酸、但保留原氨基酸侧链的性质(公知的保守氨基酸取代操作)。氨基酸侧链性质的例子有疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，以及具有如下共同的官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含羟基的侧链(S、T、Y)；含硫原子的侧链(C、M)；含羧酸和酰胺的侧链(D、N、E、Q)；含碱基的侧链(R、K、H)和含芳基的侧链(H、F、Y、W)。注释，括号中的字母表示氨基酸的单字母代码。
在人类ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.2)中添加一个或多个氨基酸残基所得的蛋白的例子是，含人类ZNFN3A1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人类ZNFN3A1蛋白与其它肽或蛋白的融合物，并且包括在本发明之中。融合蛋白能够通过本领域熟练技术人员公知的技术，例如通过连接编码本发明的人类ZNFN3A1蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白的DNA，使读框适配，将该融合DNA插入到表达载体中并使其在宿主中表达来制备。对于与本发明蛋白融合的肽或蛋白没有限制。
能够作为与本发明蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，FLAG(Hopp，T.P.等，Biotechnology(1988)6，1204-1210)、含6个His(组氨酸)残基的6xHis、10xHis、流感病毒凝激素(HA)、人类c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40 T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B-标签、C蛋白片段等。可以与本发明蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感病毒凝激素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖-结合蛋白)等等。
融合蛋白可通过将编码上文所讨论的融合肽或蛋白的商业可用的DNA与编码本发明蛋白的DNA融合，并表达所制备的融合蛋白来制备。
本领域已知的分离功能等价体蛋白的另一种替代方法是，例如，利用杂交技术的方法(Sambrook，J.等，Molecular Cloning第2版9.47-9.58，冷泉港实验室出版，1989)。本领域熟练技术人员能够容易地分离到与编码人类ZNFN3A1蛋白的DNA序列(SEQ.ID.NO.1)的全部或部分具有高度同源的DNA，并从分离到的DNA中分离人类ZNFN3A1蛋白的功能等价体。本发明蛋白包括那些由与编码人类ZNFN3A1蛋白的全部或部分DNA序列杂交的DNA编码的、并与人类ZNFN3A1蛋白在功能上等价的蛋白。这些蛋白包括与来源于人类或小鼠的蛋白相应的哺乳动物同系物(例如，由猴子、大鼠、兔子和牛基因编码的蛋白)。在从动物中分离与编码人类ZNFN3A1蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选利用来自卵巢或睾丸的组织。
用来分离编码与人类ZNFN3A1蛋白在功能上等价的蛋白的DNA的杂交条件可以由本领域熟练技术人员常规地选择。例如，杂交可以通过利用“Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃进行30分钟或更长时间的预杂交，添加标记探针，并在68℃保温1小时或更长时间进行。可以在，例如，低严谨条件下进行如下的洗涤步骤。低严谨条件为，例如，42℃、2X SSC、0.1％SDS，或者优选50℃、2X SSC、0.1％SDS。更优选利用高严谨条件。高严谨条件为，例如，在2X SSC、0.01％SDS中于室温下20分钟洗涤3次，然后在1X SSC、0.1％SDS中于37℃20分钟洗涤3次，并在1XSSC、0.1％SDS中于50℃20分钟洗涤2次。不过，多种因素例如温度和盐浓度能够影响杂交的严谨性，因而本领域熟练技术人员可以适当第选择这些因素以获得必要的严谨性。
作为杂交的替代，可以用基因扩增法，例如，利用以编码人类ZNFN3A1蛋白的DNA(SEQ.ID.NO.1)序列信息为基础合成的引物，经聚合酶链式反应(PCR)法，分离编码与人类ZNFN3A1蛋白在功能上等价的蛋白的DNA。
由通过上述杂交技术或基因扩增技术所分离到的DNA编码的与人类ZNFN3A1蛋白在功能上等价的蛋白，通常与人类ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列具有高度同源。“高度同源”通常是指40％或更高的同源性，优选60％或更高的同源性，更优选80％或更高的同源性，甚至更优选95％或更高的同源性。蛋白的同源性可以通过如下“Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80，726-730”中的算法测定。
本发明蛋白可能在氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的存在或无、或者形式方面具有变化，取决于用来制备它的细胞或宿主或者所用的纯化方法。然而，只要它具有与本发明的人类ZNFN3A1蛋白(SEQ.ID.NO.2)等价的功能，它就落在本发明的范围之内。
通过本领域熟练技术人员公知的方法，本发明蛋白可以作为重组蛋白或天然蛋白制备。重组蛋白可通过将编码本发明蛋白的DNA(例如包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的DNA)插入到合适的表达载体中，将载体引入到合适的宿主细胞中，获取提取物，并通过使提取物经层析，例如，离子交换层析、反相层析、凝胶过滤或利用固定了针对本发明蛋白的抗体的柱子的亲和层析，或通过不止一个前述柱子的结合来制备和纯化蛋白。
并且当本发明蛋白作为与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白的融合蛋白、或者作为增加了多个组氨酸的重组蛋白在宿主细胞(例如，动物细胞和大肠杆菌(E.coli))内表达时，表达的重组蛋白可利用谷胱甘肽柱或镍柱纯化。
在纯化融合蛋白后，还有可能根据需要用凝血酶或因子-Xa通过切割除去目的蛋白之外的区域。
天然蛋白可通过本领域技术人员已知的方法，例如，通过使亲和柱(该柱结合有下文所述的与ZNFN3A1蛋白结合的抗体)，与表达本发明蛋白的组织或细胞的提取物接触来分离。抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。
本发明还涵盖本发明蛋白的部分肽。所述部分肽具有本发明蛋白特有的氨基酸序列，并由至少7个氨基酸，优选8个氨基酸或更多，更优选9个氨基酸或更多组成。部分肽能用于，例如，制备针对本发明蛋白的抗体，筛选与本发明蛋白结合的化合物，以及筛选本发明蛋白的促进因子或抑制剂。
本发明的部分肽可以通过基因工程方法、通过已知的肽合成方法、或者通过用合适的肽酶消化本发明蛋白来制备。关于肽合成，举例来说，可以利用固相合成或液相合成。
分离的ZNFN3A1蛋白包括公认的428-氨基酸的蛋白，具有锌指基元，由ZNFN3A1多核苷酸序列的开放读框编码。锌指结构域(MYND)位于第49-87位密码子，而SET(Su 3-9，zeste增强子，Trihorrax)结构域位于第117-246位密码子。正如下文所详细讨论的，ZNFN3A1结合区位居SET结构域之中。所以，ZNFN3A1的部分肽优选包括SET结构域。
此外，本发明提供了编码本发明蛋白的DNA。本发明的DNA能够如上所述用于体内或体外制备本发明蛋白，或者能够应用于因编码本发明蛋白的基因的遗传性异常引起的疾病的基因治疗。可以利用任何形式的本发明的DNA，只要它编码本发明蛋白。具体地，可以利用由mRNA合成的cDNA、基因组DNA以及化学合成的DNA。本发明的DNA包括包含了给定的核苷酸序列以及它的简并序列的DNA，只要所得的DNA编码本发明蛋白。
本发明的DNA可以通过本领域熟练技术人员已知的方法制备。例如，本发明的DNA可以通过从表达本发明蛋白的细胞制备cDNA文库，并利用本发明的DNA(例如，SEQ.ID.NO.1)的部分序列作为探针进行杂交来制备。cDNA文库可以，例如，通过Sambrook J.等，《分子克隆》，冷泉港实验室出版(1989)中所描述的方法制备；作为选择地，可利用商业上可获得的cDNA文库。cDNA文库还可以通过从表达本发明蛋白的细胞提取RNA，根据本发明的DNA(例如，SEQ.ID.NO.1)的序列合成oligo DNA，利用该寡聚物作为引物进行PCR，并扩增出编码本发明蛋白的cDNA，来制备。
另外，通过对获得的cDNA测序，可以常规地确定该cDNA编码的翻译区，并且能够容易地获得本发明蛋白的氨基酸序列。而且，通过利用所获得的cDNA作为探针筛选基因组DNA文库，能够分离基因组DNA。
更具体地，可以首先从表达本发明蛋白的细胞、组织或器官(例如，卵巢、睾丸、胎盘等)中分离mRNA。可以利用已知的方法分离mRNA；例如，总RNA可以通过胍超速离心(Chirgwin J.M.等Biochemistry 185294-5299(1979))或AGPC法(Chomczynski P.和Sacchi N.Anal.Biochem.162156-159(1987))制备。另外，mRNA可以利用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等从总RNA中纯化，或者，作为选择地，mRNA可以通过QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化。
所获得的mRNA利用反转录酶用于合成cDNA。cDNA可以利用商业上可获得的试剂盒，例如AMV反转录酶第1链cDNA合成试剂盒(SeikagakuKogyo)合成。作为选择地，cDNA可以按照5’-RACE法合成并扩增(FrohmanM.A.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.858998-9002(1988)；Belyavsky A.等Nucleic Acids Res.172919-2932(1989))，如本文所述，该方法利用引物等，5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech)以及聚合酶链式反应(PCR)。
从PCR产物中制备所需的DNA片段，并将该片段与载体DNA连接。重组载体被用于转化大肠杆菌等，并从挑选的克隆中制备所需的重组载体。所需的DNA的核苷酸序列可以通过常规方法，例如双脱氧核苷酸链终止法检验。
通过考虑用于表达的宿主中的密码子利用频率，可以设计更有效地表达本发明的DNA的核苷酸序列(Grantham R.等Nucleic Acids Res.943-74(1981))。本发明的DNA可以通过商业上可获得的试剂盒或者常规方法进行改变。例如，DNA可以通过用限制酶消化、掺入合成寡核苷酸或合适的DNA片段、添加接头、或者插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA、TGA或TAG)予以改变。
具体地，本发明的DNA涵盖包含了编码位于SEQ.ID.NO.2第49-87位密码子的锌指结构域和位于SEQ.ID.NO.2第117-246位密码子的DET结构域的核苷酸序列的DNA。
此外，本发明提供了在严谨条件下与具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的DNA杂交、并编码如上所述的在功能上与本发明蛋白等价的蛋白的DNA。本领域熟练技术人员可以适当地选择严谨条件。例如，可以使用低严谨条件。更优选地，可以使用高严谨条件。这些条件与上文所述相同。上文的杂交DNA优选为cDNA或染色体DNA。
本发明还提供了插入了本发明的DNA的载体。本发明的载体可用于在宿主细胞中维持本发明的DNA，或者用于表达本发明蛋白。
当大肠杆菌为宿主细胞并且载体在大肠杆菌(如，JM109、DH5α、HB101或XL1Blue)中大量扩增和生产时，载体应当具有在大肠杆菌中扩增的复制起点″ori″以及用来选择转化的大肠杆菌的标记基因(如，由药物例如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等药物进行选择的抗药性基因)。例如，可以利用M13-系列载体、pUC-系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以与上述载体一样用于亚克隆和提取cDNA。当利用载体制备本发明蛋白时，表达载体尤为有用。例如，待在大肠杆菌中表达的表达载体应当具有可在大肠杆菌中扩增的上述特征。当利用大肠杆菌例如JM109、DH5α、HB101或XL1 Blue作为宿主细胞时，载体应当具有能够在大肠杆菌中有效地表达所需基因的启动子，例如，lacZ启动子(Ward等，Nature(1989)341，544-546；FASEB J(1992)6，2422-2427)、arab启动子(Better等，Science(1988)240，1041-1043)或T7启动子等。就这方面而言，举例来说，pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpresssystem”(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况下，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)可用来代替上述载体。
另外，载体还可以含有多肽分泌的信号序列。指导待分泌的蛋白进入大肠杆菌周质的例示性信号序列是pelB信号序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。将载体引入靶宿主细胞的手段包括，例如，氯化钙法以及电穿孔法。
除了大肠杆菌，举例来说，可利用来自哺乳动物的表达载体(例如，pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，p5322)、pEF、pCDM8)、来自昆虫细胞的表达载体(例如，“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、来自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、来自动物病毒的表达载体(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、来自反转录病毒的表达载体(例如，pZIpneo)、来自酵母的表达载体(例如，“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)、以及来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的表达载体(例如，pPL608、pKTH50)生产本发明蛋白。
为了在动物细胞，例如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应当具有在这种细胞中表达所必须的启动子，例如，SV40启动子(Mulligan等，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV启动子等，并且优选具有用于选择转化体的标记基因(例如，进行药物选择的药物抗性基因(如新霉素、G418))。具有这些特征的已知载体的例子包括，例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
另外，可以使用方法稳定地表达基因，并同时扩增细胞中基因的拷贝数。例如，可以将包含互补DHFR基因的载体(例如pCHO I)引入到缺失了核酸合成路径的CHO细胞中、并随后通过氨甲喋呤(MTX)扩增。此外，在基因瞬时表达的情况下，可以使用将包含SV40复制起点的载体(pcD等)转化到在染色体上包含SV40 T抗原表达基因的COS细胞中的方法。
如上所述获得的本发明蛋白可以自宿主细胞的内部或外部(例如培养基中)分离，并纯化为基本纯的均质蛋白。如本文所用的关于给定多肽的术语“基本纯”是指多肽基本上没有其它生物大分子。基本纯的多肽干重纯度至少75％(如，至少80、85、95或99％)。纯度可以通过任何合适的标准方法，例如通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析测量。蛋白分离和纯化的方法不局限于任何特定的方法；事实上，可以利用任何标准方法。
例如，可以适当地选择并组合柱层析、过滤、超滤、盐沉淀、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和重结晶以分离和纯化蛋白。
层析的例子包括，例如，亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，冷泉港实验室出版(1996))。这些层析可以通过液相层析进行，例如HPLC和FPLC。因此，本发明提供了通过上述方法制备的高度纯化的蛋白。
本发明蛋白可以任选地通过在纯化前或后用合适的蛋白酶处理而被修饰或部分缺失。有用的蛋白修饰酶包括，但不限于，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰内肽酶(lysylendopeptidase)、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。
本发明提供了与本发明蛋白结合的抗体。本发明的抗体能够以任何形式应用，例如单克隆抗体或多克隆抗体形式，并且包括通过用本发明蛋白免疫动物例如兔子所获得的抗血清、所有类型的多克隆和单克隆抗体、人类抗体以及通过基因重组制备的人源化抗体。
用作抗原以获得抗体的本发明蛋白可以来自于任何动物物种，但优选来自哺乳动物例如人类、小鼠或大鼠，更优选来自人类。来自人的蛋白可以从本文公开的核苷酸或氨基酸序列获得。
根据本发明，用作免疫抗原的蛋白可以是完整蛋白或该蛋白的部分肽。部分肽可以包含，例如，本发明蛋白的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。这里，抗体被定义为与本发明蛋白的全长或者片段反应的蛋白。
编码本发明蛋白或它的片段的基因可以被插入到已知的表达载体中，然后它被用来转化如本文所述的宿主细胞。所需蛋白或它的片段可以通过任何标准方法自宿主细胞的外部或内部回收，并且可以随后用作为抗原。作为选择地，表达蛋白的完整细胞或它们的裂解物，或者化学合成的蛋白可用作为抗原。
任何哺乳动物可以用该抗原免疫，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。一般地，利用啮齿类(Rodentia)、兔类(Lagomorpha)或灵长类(Primates)动物。
啮齿类动物包括，例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔类动物包括，例如，兔子。灵长类动物包括，例如，狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴子)猴子例如猕猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzees)。
用抗原免疫动物的方法是本领域公知的。腹腔内注射或皮下注射抗原是免疫动物的标准方法。更具体地，抗原可以稀释并悬浮于适量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)、生理盐水中等。如果需要，抗原悬浮液可以与适量的标准佐剂(例如弗氏完全佐剂)混合，制成乳剂，然后给药哺乳动物。优选地，随后每4到21天给药与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原数次。适当的载体也可用于免疫。如上所述免疫之后，通过标准方法检查血清中所需抗体量的增加。
针对本发明蛋白的多克隆抗体可以通过，从血清中所需抗体增加的免疫动物收集血液，并通过任何常规方法从血液中分离血清来制备。多克隆抗体包括含有该多克隆抗体的血清，以及可以从血清中分离的含有多克隆抗体的组份。免疫球蛋白G或M可以从只识别本发明蛋白的组份中，利用例如，偶联本发明蛋白的亲和柱制备，并利用蛋白A或蛋白G柱进一步纯化该组份。
为制备单克隆抗体，从用抗原免疫的、并如上所述检查到血清中所需抗体水平提高的哺乳动物中收集免疫细胞，并使之进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾脏。其它优选的与上述免疫细胞融合的亲本细胞包括，例如，哺乳动物骨髓瘤细胞，并且更优选具备用来由药物选择融合细胞的后天性质的骨髓瘤细胞。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞可以根据已知的方法融合，例如，Milstein等的方法(Galfre，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)。
通过细胞融合所得的杂交瘤可以通过在标准选择培养基中培养它们进行选择，例如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基)。细胞培养通常在HAT培养基中持续数天到数周，培养时间应足以让除了所需的杂交瘤之外的所有其它细胞(未融合细胞)死亡。然后，通过标准的有限稀释筛选和克隆出产生所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述用抗原免疫非人动物制备杂交瘤的方法之外，人类杂交瘤细胞例如那些被EB病毒感染的细胞可以用蛋白、蛋白表达细胞、或它们的裂解物在体外免疫。然后，免疫的淋巴细胞与来自人的能够无限分裂的骨髓瘤细胞，例如U266融合，以得到能产生与所述蛋白结合的所需人类抗体的杂交瘤(未审的
公开日本专利申请No.(JP-A)Sho 63-17688)。
所得的杂交瘤随后被移植到小鼠的腹腔内，并提取腹水。所得的单克隆抗体可以通过，例如，硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联了本发明蛋白的亲和柱纯化。本发明的抗体不仅可用来纯化和检测本发明蛋白，而且可用作本发明蛋白的激动剂和拮抗剂的侯选者。另外，该抗体可用于与本发明蛋白相关的疾病的抗体治疗。当向人体给药所得的抗体(抗体治疗)时，优选人类抗体或人源化抗体以降低免疫原性。
例如，可以用选自蛋白、蛋白表达细胞或其裂解物的抗原免疫具有人类抗体基因库的转基因动物。然后从动物中收集抗体生成细胞，并与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，从中可以制备针对该蛋白的人类抗体(参见WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735和WO96-34096)。
作为选择地，产生抗体的免疫细胞，例如免疫的淋巴细胞，可用癌基因永生化，并用于制备单克隆抗体。
这样获得的单克隆抗体也可以利用基因工程技术重组制备(例如参见Borrebaeck C.A.K.和Larrick J.W.Therapeutic Monoclonal Antibodies，英国MacMillan出版社有限公司出版(1990))。举例来说，可以从免疫细胞，例如产生抗体的杂交瘤或免疫淋巴细胞克隆出编码该抗体的DNA，将该DNA插入到合适的载体中，并引入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供了如上所述制备的重组抗体。
此外，本发明的抗体可以是抗体片段或修饰抗体，只要它与本发明的一或多种蛋白结合。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv(scFv)，其中来自H和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston J.S.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883(1988))。更具体地，抗体片段可以通过用酶，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体产生。作为选择地，可以构建编码抗体片段的基因，将该基因插入到表达载体中，并在合适的宿主细胞中表达(例如参见Co M.S.等J.Immunol.1522968-2976(1994)；Better M.和Horwitz A.H.Methods Enzymol.178476-496(1989)；Pluckthun A.和Skerra A.MethodsEnzymol.178497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121652-663(1986)；Rousseaux J.等Methods Enzymol.121663-669(1986)；Bird R.E.和Walker B.W.Trends Biotechnol.9132-137(1991))。
抗体可通过与多种分子，例如聚乙二醇(PEG)偶联而被修饰。本发明提供了这种修饰抗体。修饰抗体可以通过化学修饰抗体获得。这些修饰方法在本领域中是常规的。
作为选择地，本发明的抗体可以是来自非人抗体的可变区和来自人类抗体的恒定区的嵌合抗体、或者作为包含来自非人抗体的互补决定区(CDR)、来自人类抗体的框架区(FR)以及恒定区的人源化抗体获得。这样的抗体可以利用已知的技术制备。
如上所述获得的抗体可以被纯化为均质的。例如，抗体的分离和纯化可以根据一般蛋白所用的分离和纯化方法进行。例如，抗体可以通过柱层析法的适当选择和组合进行分离，例如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane，冷泉港实验室1988)，但不局限于此。
蛋白A柱或蛋白G柱可用作为亲和柱。可用的例示性蛋白A柱包括，例如，Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了亲和以外的例示性层析包括，例如，离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等，冷泉港实验室出版，1996)。层析操作可以通过液相层析进行，例如HPLC和FPLC。
举例来说，可以利用吸光度测量、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光测量本发明的抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在板上，向板上施加本发明蛋白，然后施加含有所需抗体的样品，例如抗体生成细胞的培养上清或者纯化的抗体。然后，施加识别一抗并且用酶，例如碱性磷酸酶标记的二抗，并温育板。接着，洗涤之后，向板中添加酶底物，例如p-硝基苯基磷酸，然后测量吸光度，以评估样品的抗原结合活性。蛋白片段，例如C-末端或N-末端片段，可作为蛋白应用。可以利用BIAcore(Pharmacia)评估根据本发明的抗体的活性。
上述方法通过将本发明的抗体暴露于预计含有本发明蛋白的样品中，并检测或测量抗体和蛋白形成的免疫复合体，使得能够检测或测量本发明蛋白。
由于检测或测量根据本发明蛋白的方法能够容易地检测或测量蛋白，该方法可用在利用该蛋白的许多实验中。
本发明还提供了与编码人类ZNFN3A1蛋白的DNA(SEQ.ID.NO.1)或其互补链杂交的多核苷酸，它包含至少15个核苷酸。本发明的多核苷酸优选是与编码本发明蛋白的DNA特异性杂交的多核苷酸。如本文所用的术语“特异性杂交”是指在常用的杂交条件下，优选在严谨杂交条件下，与编码其它蛋白的DNA的交叉杂交不显著发生。这样的多核苷酸包括与编码本发明蛋白的DNA或其互补链特异性地杂交的探针、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如，反义寡核苷酸和核酶)。而且，这样的多核苷酸可用于制备DNA芯片。
本发明包括与核苷酸序列SEQ.ID.NO.1之内的任何位点杂交的反义寡核苷酸。该反义寡核苷酸优选是针对核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的至少15个连续的核苷酸。甚至更优选在上述至少15个连续的核苷酸中含有起始密码子的上述反义寡核苷酸。
反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物可作为反义寡核苷酸应用。这种修饰产物的例子包括低级烷基膦酸酯修饰例如甲基膦酸酯型或乙基膦酸酯型修饰、硫代磷酸酯(phosphothioate)修饰和氨基磷酸酯(phosphoramidate)修饰。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”不仅是指其中与构成DNA或mRNA特定区域的那些核苷酸相应的核苷酸是完全互补的那些寡核苷酸，而且指那些具有一个或多个核苷酸误配的核苷酸，只要DNA或mRNA以及反义寡核苷酸能够与核苷酸序列SEQ.ID.NO.1特异性杂交。
本发明包括这样的多核苷酸，如在“至少15个连续核苷酸的序列区域”具有至少70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高同源性的那些多核苷酸。本文所陈述的算法能够用于确定同源性。如在稍后的实施例中所陈述的那样，这样的多核苷酸可作为探针用于分离或检测编码本发明蛋白的DNA，或者可作为引物用于扩增。
本发明的反义寡核苷酸衍生物作用于产生本发明蛋白的细胞，通过与编码本发明蛋白的DNA或mRNA结合、抑制它的转录或翻译、促进mRNA的降解、以及抑制该蛋白的表达，导致对该蛋白功能的抑制。
本发明的反义寡核苷酸衍生物可以通过与适当的对该衍生物无活性的碱性材料混合，制成外用制剂，例如搽剂(liniment)或敷剂(poultice)。
并且，根据需要，衍生物可以通过添加赋形剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂、保存剂、镇痛剂等配制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、脂质体胶囊、注射剂、溶液、鼻滴剂和冷冻干燥制剂。这些可以通过如下通用方法制备。
反义寡核苷酸衍生物给予患者的方式是，直接施用于生病部位或者通过注射到血管中，从而它可到达疾病部位。还可以使用反义-固定(mounting)介质提高耐久性和膜通透性。例子有脂质体、多聚-L-赖氨酸、脂类、胆固醇、脂质转染物(Lipofectin)或这些物质的衍生物。
本发明的反义寡核苷酸衍生物的剂量可以根据患者的情况适当调整并按照所需的量使用。例如，可以给药0.1到100mg/kg，优选0.1到50mg/kg的剂量范围。
本发明的反义寡核苷酸抑制本发明蛋白的表达，因而可用来阻抑本发明蛋白的生物活性。并且，包含本发明反义寡核苷酸的表达抑制剂，就它们能够抑制本发明蛋白的生物活性而言是有用的。
而且，本发明提供了利用本发明蛋白筛选与本发明蛋白结合的化合物的方法。这个筛选方法包括步骤(a)使本发明蛋白或其部分肽与受试样品进行接触；(b)检测本发明蛋白或其部分肽与受试样品结合的活性，和(c)选择与本发明蛋白或其部分肽结合的化合物。
用于筛选的本发明蛋白可以是重组蛋白和得自天然的蛋白，或者它的部分肽。可以使用任何受试样品，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物以及天然化合物。与受试样品接触的本发明蛋白可以是，例如，纯化的蛋白，可溶蛋白，与载体结合的形式或者与其它蛋白融合的融合蛋白。
很多本领域熟练技术人员公知的方法都可以用作筛选蛋白的方法，例如，利用本发明蛋白筛选与本发明蛋白结合的蛋白。这种筛选可以通过，例如免疫沉淀法，具体地，以如下方式进行。编码本发明蛋白的基因通过将该基因插入到用于外来基因的表达载体(如pSV2neo、pcDNA I和pCD8)上，而在动物细胞中表达。表达所用的启动子可以是通常所用的任何启动子，并且包括，例如，SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，GeneticEngineering，第3卷，学院出版社，伦敦，p.83-141(1982))、EF-1α启动子(Kim等，Gene 91，p217-223(1990))、CAG启动子(Niwa等Gene 108，p.193-200(1991))、RSV LTR启动子(Cullen Methods in Enzymology 152，p.684-704(1987))、SRα启动子(Takebe等，Mol.Cell.Biol.8，p.466(1988)、CMV即早期启动子(Seed和Aruffo Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，p.3365-3369(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen和Fiers J.Mol.Appl.Genet.1，p.385-394(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufman等，Mol.Cell.Biol.9，p.946(1989))、HSV TK启动子等。将基因引入到动物细胞中以便表达外来基因时，所述引入可根据任何已知的方法进行，例如，电穿孔法(Chu G.等Nucl.Acids Res.15，1311-1326(1987))、磷酸钙法(Chen，C和Okayama，H.Mol.Cell.Biol.7，2745-2752(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopata，M.A.等Nucl.Acids Res.12，5707-5717(1984))，Sussman，D.J.和Milman，G.Mol.Cell.Biol.4，1642-1643(1985))、脂质转染物法(Derijard，B.Cell 7，1025-1037(1994)；Lamb，B.T.等Nature Genetics 5，22-30(1993)Rabindran，S.K.等Science 259，230-234(1993))等。通过将已经揭示其特异性的单克隆抗体的表位引入本发明蛋白的N-或C-末端，可以将本发明蛋白表达为包含单克隆抗体识别位点(表位)的融合蛋白。可以利用商业上可获得的表位-抗体系统(ExperimentalMedicine 13，85-90(1995))。利用，例如，β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等的多克隆位点而表达与这些蛋白的融合蛋白的载体是商业上可获得的。
还报道了一种融合蛋白，它是通过仅引入由几个到几十个氨基酸组成的小表位而制备的，所述融合不改变本发明蛋白的性质。表位，例如多聚组氨酸(His-标签)、流感标度凝集素HA、人类c-myc、FLAG、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标签)、人单疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、E-标签(单克隆噬菌体上的表位)等，以及识别它们的单克隆抗体，可作为表位-抗体系统用于筛选与本发明蛋白结合的蛋白(ExperimentalMedicine 13，85-90(1995))。
在免疫沉淀中，通过用合适的去污剂制备细胞裂解物，向该裂解物中添加这些抗体，可以形成免疫复合体。该免疫复合体由本发明蛋白、包含与该蛋白结合的活性的蛋白、以及抗体组成。除了利用针对上述表位的抗体之外，免疫沉淀还可以利用针对本发明蛋白的抗体进行。针对本发明蛋白的抗体可以如下制备，例如将编码本发明蛋白的基因引入到合适的大肠杆菌表达载体中，在大肠杆菌中表达该基因，纯化表达的蛋白，并用该蛋白来免疫兔、小鼠、大鼠、山羊、家禽等。抗体还可以通过用本发明蛋白的合成性部分肽免疫上述动物来制备。
当抗体为小鼠IgG抗体时，免疫复合体可以通过蛋白A Sepharose或蛋白GSepharose沉淀。如果将本发明蛋白制成与表位(如GST)的融合蛋白，就可以以相同的方式，利用与这些表位特异性结合的物质(如谷胱甘肽-Sepharose 4B)以及抗本发明蛋白的抗体，形成免疫复合体。
免疫沉淀可以如下，或者根据，例如，文献(Harlow，E.和Lane，D.Antibodies pp.511-552，冷泉港实验室出版，纽约(1988))中的方法进行。
SDS-PAGE通常用于分析免疫沉淀的蛋白，结合的蛋白可以利用合适浓度的凝胶通过蛋白的分子量进行分析。由于与本发明蛋白结合的蛋白难以由普通的染色方法，例如考马斯亮兰染色或银染检测，蛋白的检测灵敏度可以通过在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白并检测所述蛋白而得以提高。在得知蛋白的分子量之后，可以从SDS-聚丙烯酰胺凝胶中直接纯化靶蛋白，并测序。
可以利用West-Western印迹分析作为利用本发明蛋白分离与该蛋白结合的蛋白的方法(Skolnik，E.Y.等，Cell(1991)65，83-90)。具体地，与本发明蛋白结合的蛋白可以如下获得利用噬菌体载体(如ZAP)从预期表达与本发明蛋白结合的蛋白的细胞、组织或器官(例如，诸如卵巢、睾丸和胎盘等组织或培养的细胞)中制备cDNA文库，在LB-琼脂上表达该蛋白，将表达的蛋白固定在滤膜上，使纯化和标记的本发明蛋白与上述滤膜反应，并根据该标记检测处表达与本发明蛋白结合的蛋白的噬菌斑。本发明蛋白可以利用生物素和抗生物素蛋白的结合、或者利用与本发明蛋白特异性结合的抗体或与本发明蛋白融合的肽或多肽(例如GST)进行标记。利用放射性同位素或荧光等的方法也可以使用。
作为选择地，在本发明的筛选方法的另一个实施方案中，可以采用利用了细胞的双杂交(two-hybrid)系统(“MATCHMAKER双杂交系统”、“哺乳动物MATCHMAKER双杂交测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stratagene)；参考文献“Dalton S，和Treisman R(1992)Cell 68，597-612”、“Fields S.和Sternglanz R.TrendsGenet.(1994)10286-292”)。
在双杂交系统中，本发明蛋白被融合到SRF-结合区或GAL4-结合区并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明蛋白结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，该文库在表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后将cDNA文库引入到上述酵母细胞中，并从所测的阳性克隆(当与本发明蛋白结合的蛋白在酵母细胞中表达时，两者的结合可激活报告基因，使得能检测阳性克隆)分离来自该文库的cDNA。由该cDNA编码的蛋白可以通过将如上述分离到的cDNA引入到大肠杆菌中并表达该蛋白来制备。
除了HIS3基因，还可以利用Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等作为报告基因。
与本发明蛋白结合的化合物可以利用亲和层析筛选。例如，可将本发明蛋白固定在亲和柱的载体上，向柱中加入含有预计表达与本发明蛋白结合的蛋白的受试样品。本文中受试样品可以是，例如，细胞提取物、细胞裂解物等。将受试样品上样后，洗涤柱子，制备与本发明蛋白结合的蛋白。
对所得的蛋白的氨基酸序列进行分析，根据该序列合成oligo DNA，并利用该oligo DNA作为探针筛选cDNA文库以获得编码该蛋白的DNA。
利用表面胞质团(plasmon)共振现象的生物传感器可在本发明中用作检测或定量结合化合物的工具。当利用这种生物传感器时，仅利用少量蛋白且无需标记，就可以实时观察本发明蛋白与受试化合物之间的相互作用，其为表面胞质团共振信号形式(例如BIAcore，Pharmacia)。所以，利用生物传感器例如BIAcore评估本发明蛋白与测试化合物之间的结合是可能的。
通过将已被固定的本发明蛋白暴露于合成化学化合物、或天然物质库、或随机噬菌体肽展示文库而筛选结合分子的方法，或者利用基于组合化学技术的高通量筛选来分离与本发明蛋白结合的蛋白和化学化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法(Wrighton Nc，Farrel FX，Chang R，Kashyap AK，BarboneFP，Mulcahy LS，Johnson DL，Barret RW，Jolliffe LK，Dower WJ；Small peptidesas potent mimetics of the protein hormone erythropoietin，Science(美国)Jul 261996，273 p458-64，Verdine GL.，The combinatorial chemistry of nature.Nature(英国)Nov 7 1996，384，p11-13，Hogan JC Jr.，Directed combinatorial chemistry.Nature(ENGLAND)Nov 7 1996，384 p17-9)，都是本领域公知的。
通过筛选而分离的化合物是促进或抑制本发明蛋白的活性、治疗或预防引起细胞增性疾病(如癌症)的疾病的侯选药物。由本发明的筛选方法获得的化合物还包括这样的化合物，其中通过本筛选方法获得的、具有与本发明蛋白结合的活性的部分结构通过添加、缺失和/或取代而被改变。
而且，本发明提供了筛选促进或抑制本发明蛋白的活性的化合物的方法。由于本发明的ZNFN3A1蛋白具有促进细胞增殖的活性，促进或抑制本发明ZNFN3A1蛋白的这种活性的化合物可以利用这种活性作为指标来筛选。
该筛选方法包括以下步骤(a)在受试样品存在下培养表达ZNFN3A1蛋白的细胞，(b)检测细胞的增生，和(c)选择与不存在受试样品时检测到的增生相比促进或抑制增生的化合物。抑制ZNFN3A1的表达和/或活性的化合物具有抗癌剂的用途。
任何ZNFN3A1蛋白都可以用来筛�。灰前种葡赴鲋车幕钚�。例如，可以利用人类ZNFN3A1蛋白，以及与这些蛋白功能上等价的蛋白。ZNFN3A1蛋白可以由细胞内源表达或外源表达。
任何受试样品，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗制的蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物、天然化合物都可以利用。由上述与本发明蛋白结合的化合物的筛选获得的化合物也可以用作为受试化合物。
通过这种筛选分离的化合物是本发明蛋白的激动剂或拮抗剂。术语“激动剂”是指通过结合本发明蛋白而激活该蛋白的功能的分子。同样地，术语“拮抗剂”是指通过结合本发明蛋白而抑制该蛋白的功能的分子。而且，这种通过筛选分离的化合物是抑制本发明蛋白在体内与分子(包括DNA和蛋白)相互作用的侯选化合物。
细胞增殖可以，例如，通过测定细胞增殖的速度、测量细胞周期等，以及通过测量集落形成活性予以检测，象实施例中所描述的那样。
通过该筛选分离到的化合物是抑制本发明蛋白的活性的侯选药物，它可用于治疗与本发明蛋白相关的疾�。纾┲ⅲ囟ǖ兀蜗赴�。
而且，通过添加、缺失和/或取代而改变了抑制ZNFN3A1蛋白活性的那一部分结构的化合物，包括在由本发明的筛选方法获得的化合物中。
当由本发明的方法分离的化合物作为药物给药人类或其它哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、小鸡、猫、绵羊、猪、牛、猴子、狒狒(baboon)、黑猩猩(chimpanzee)时，分离的化合物可以直接给药，或者可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。例如，根据需要，药物可以作为糖衣片剂、胶囊、药酒和微胶囊口服，或者用水或其它任何药学上可接受的液体配制成用于注射的无菌溶液或悬液形式，非口服给予。例如，化合物可以与药学上可接受的载体或介质，具体地，无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、媒介物、保存剂、粘附剂等，以药物实施通常所接受的单位剂量的形式进行混合。这些药剂中活性成分的含量在指定范围内可获得适当的剂量。
能够混合到片剂和胶囊中的添加剂的例子有，粘附剂例如明胶、玉米淀粉、黄芪胶和阿拉伯胶；赋形剂例如微晶纤维素；膨胀剂例如玉米淀粉、明胶和海藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁；甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精；调味剂例如薄荷油、Gaultheria adenothrix油和樱桃。当单位剂量形式为胶囊时，上述成分中还可以包括液体载体，例如油。用于注射的无菌组合物可以利用媒介物例如用于注射的蒸馏水，按照常规的药物实施进行配制。
生理盐水、葡萄糖以及其它等渗液体包括助剂，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，可以用作为注射水溶液。这些可以与合适的增溶剂联合使用，例如醇类，特别是乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，例如Polysorbate 80(TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可用作油质液体，可以与苯甲酸苄酯或苯甲醇联合用作增溶剂，还可与缓冲液，例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液；镇痛剂，例如盐酸普鲁卡因；稳定剂，例如苯甲醇、酚；以及抗氧化剂一起配制。制备的注射剂可以填充到合适的安瓿中。
可以利用本领域熟练技术人员所公知的方法向患者给药本发明的药物化合物，例如作为动脉注射、静脉注射、经皮注射，并且还可以作为鼻内、经支气管、肌内或口服给药。给药的剂量和方法根据患者的体重和年龄以及给药方法而变化；不过，本领域熟练技术人员能够常规选择它们。如果所述化合物由DNA编码，可将该DNA插入到基因治疗载体中，并给药载体进行治疗。给药的剂量和方法根据患者的体重、年龄和症状变化，但是本领域熟练技术人员能够适当地选择它们。
举例来说，当向标准成年人(体重60kg)口服给药时，虽然就症状而言存在某些差异，但与本发明蛋白结合并调节其活性的化合物的剂量为约0.1mg-100mg每天，优选约0.1mg-50mg每天，更优选约1.0mg-20mg每天。
当以注射形式向标准成年人(体重60kg)肠胃外给药时，虽然就患者、靶器官、症状和给药方法而言存在某些差异，但可以很方面地静脉内注射约0.01mg-30mg每天，优选约0.1mg-20mg每天，更优选约0.1mg-10mg每天的剂量。在其它动物的情况下，可以按60kg体重的标准换算给药量。
而且，本发明提供了利用ZNFN3A1基因作为诊断标志诊断癌症的方法。该诊断方法包括步骤(a)测定标本的生物样品中ZNFN3A1基因的表达水平；(b)将ZNFN3A1基因的该表达水平与正常样品中的进行比较，和(c)将样品中ZNFN3A1基因的高表达水平定义为具有癌症。
ZNFN3A1基因在具体标本中的表达水平可以通过定量相应于ZNFN3A1基因的mRNA或者由ZNFN3A1基因编码的蛋白进行评估。mRNA定量方法是本领域熟练技术人员公知的。例如，与ZNFN3A1基因相应的mRNA可以通过RNA印迹或者RT-PCR进行评估。由于ZNFN3A1基因的全部核苷酸序列已显示在SEQ ID NO1中，本领域任何技术人员都能设计探针和引物的核苷酸序列以定量ZNFN3A1基因。
ZNFN3A1基因的表达水平可以根据该ZNFN3A1基因编码的蛋白的活性或量进行分析。测定ZNFN3A1蛋白量的方法显示于下。例如，免疫测定法可用来测定生物材料中的上述蛋白。任何生物材料都可以用于该蛋白或其活性的测定。例如，分析血样以评估由血清标志所显示的蛋白。另一方面，可以根据待分析的每种蛋白的活性选择合适的方法用于测定ZNFN3A1基因所编码的蛋白的活性。
评估标本(受试样品)中ZNFN3A1基因的表达水平并与正常样品中的进行比较。当这种比较证明ZNFN3A1基因的表达水平高于正常样品中的水平时，则判定受试者染有癌症。来自正常样品和受试者的标本中ZNFN3A1基因的表达水平可以同时进行测定。作为选择地，可以根据对事先从对照组收集的标本中ZNFN3A1基因的表达水平的分析所获得的结果，通过统计学方法确定表达水平的正常范围。将通过检查受试者样品所获得的结果与该正常范围进行比较；当结果未落在正常范围内时，受试者被判定染有癌症。在本发明中，待诊断的癌症优选为肝细胞癌。
本发明还提供了诊断肝细胞癌的诊断试剂。本发明的诊断试剂包含与本发明的DNA或蛋白结合的化合物。优选地，与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸，或者可与本发明蛋白结合的抗体可以作为这些化合物来用。
提供下列实施例是用来举例说明本发明，并帮助普通技术人员制备和利用本发明的。这些实施例并不旨在以任何方式另外限制本发明的范围。
本文所引用的任何专利、专利申请和出版物都并入作为参考。
实施例实施发明的最佳方式本发明通过下列实施例详细地举例说明，但不受限于这些实施例。
材料和方法许多哺乳动物宿主细胞包括人肝细胞癌细胞系Huh7和Alexander、人子宫颈细胞系HeLa和小鼠成纤维细胞系NIH3T3，它们均得自于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，它们都用来分离和鉴定ZNFN3A1。还利用了人肝细胞癌细胞系SNU423和SNU475，它们来自韩国细胞系库。所有的细胞系在合适的培养基中单层培养用于Huh7 Alexander和NIH3T3的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基；用于HeLa的Eagle’s极限必需培养基；用于SNU423和SNU475的、补充有10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)的RPM1640，在含有5％CO2的空气中于37℃生长。
ZNFN3A1的克隆化通常利用KOD-plus(TOYOBO)通过PCR进行。为进行大肠杆菌表达，ZNFN3A1编码区被克隆到pET21a的EcoR I-Kpn I位点。
为进行哺乳动物细胞表达，ZNFN3A1编码区被克隆到pcDNA3.1(+)和(-)(Invitrogen)的EcoR I-Kpn I位点、pFLAG的EcoR I-Kpn I位点以及pEGFP 的EcoR I-Kpn I位点(Clontech)。KIAA0054编码区被克隆到pCMV-HA(Clontech)的EcoR I-Xho I位点。
RNA在如下实验中利用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(Life Technologies)根据制造商的方案通过提取总RNA进行制备。
本文通过RT-PCR扩增RNA。利用poly dT12，18引物(AmershamBiosciences)和Superscript II反转录酶(Life Technologies)将10μg总RNA反转录为单链cDNA。稀释每一单链cDNA用于随后的PCR扩增。标准RT-PCR在20μl体积的PCR缓冲液(TAKARA)中进行，并在Gene Amp PCR系统9700(Perkin-Elmer)中于94℃变性4分钟、接着以94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s进行20个(对于GAPDH)或30个(对于ZNFN3A1)循环予以扩增。引物序列如下，GAPDH正向5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG(SEQ.ID.NO.4)及反向5’-GGTCCACCACTGACACGTTG(SEQ.ID.NO.5)，ZNFN3A1正向5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG(SEQ.ID.NO.6)及反向5’-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT(SEQ.ID.NO.7)。
为检测ZNFN3A1，制备了兔抗-ZNFN3A多克隆抗体。利用睾丸cDNA作为模板通过PCR扩增了ZNFN3A1全长编码序列并克隆到pET21a(Novagen)中。用已克隆的载体转染BL21-CodonPlus感受态细胞(Stratagene)。重组ZNFN3A1蛋白由1.0mM IPTG于30℃诱导6小时。利用Pro BondTMResin(Invitrogen)纯化His-ZNFN3A1融合蛋白。兔子用纯化的His-ZNFN3A1免疫10次。用所得多克隆抗体进行的免疫印迹显示了50kD的单一条带，它是带有FLAG-标记的ZNFN3A1，这与利用抗-FLAG单克隆抗体(Sigma)所检测到的模式(数据未显示)相同。
ZNFN3A1在细胞周期进程中的效果由流式细胞术测定。细胞以1×105细胞/100mm皿的密度铺板。细胞在指定的时间用胰蛋白酶处理，收集于PBS中，并固定在70％冷乙醇中。RNase处理后，细胞在PBS中用碘化丙锭(50μg/ml)染色。在Becton Dickinson FACScan上进行流式细胞计数，并通过CellQuest和ModFit软件(Verity Software House)进行分析。从至少20,000个未经选通的细胞确定处于细胞周期G0/G1、S和G2/M期的核、以及任何亚-G1细胞群的百分比。
还在各种实验中进行了免疫印�：兔庖咦榛治�。在免疫印迹中，细胞用PBS洗涤两次，并用裂解缓冲液(150mM NaCI、1％Triton X-100、50mM Tris-HCI pH7.4、1mM DTT和1X完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche))收集。在细胞匀浆并于10,000xg离心30分钟后，通过Bradford测定(Bio-Rad)对上清进行蛋白浓度标准化。蛋白通过10％SDS-PAGE分离，并用小鼠抗-FLAG、兔抗-RNA聚合酶II、兔抗-HA抗体以及兔抗-ZNFN3A1抗体进行免疫印迹。HRP-偶联的山羊抗-小鼠1gG和抗-兔1gG作为ECL检测系统(Amersham Biosciences)的二抗。
在免疫组化分析中，利用抗-ZNFN3A1抗体进行免疫组化染色。根据制造商建议的方法将石蜡-包埋的组织切片置于SAB-PO过氧化物酶免疫染色系统(Nichirei，东京，日本)中。将柠檬酸缓冲液(pH6)中的载玻片在微波炉中700W预处理10分钟，使抗原从脱石蜡且再水合的组织中回收。
实施例1鉴定在HCC中频繁上调的新基因利用具有23040个基因的基因组范围的cDNA微阵列，我们鉴定了表达序列标签(EST)，它在乙型肝炎-阳性和/或丙型肝炎-阳性HCC中普遍上调。其中，我们聚焦于与一种EST对应的基因A6681(Hs.8109)，因为与相应的非癌肝组织相比，它的表达在12个临床HCC中有11个(91.7％)显著上调(图1A)。基因A6681的表达提高在另外的10个HCC病例中通过RT-PCR也得到了确认(图1B)。通过半定量RT-PCR确认的相对表达与通过cDNA微阵列确认的非常相关。
实施例2A新的人类基因ZNFN3A1的分离和鉴定利用Clonetech的多组织RNA印迹，使32P标记的部分A6681 cDNA与约1.7-kb转录本杂交，该转录本购自Clontech，可在睾丸及骨骼肌中表达(图1C)。A6681探针利用一组引物5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG-3’(SEQ.ID.NO.6)和5′-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT-3′(SEQ.ID.NO.7)通过RT-PCR制备。预杂交、杂交和洗涤根据供应商的建议进行。印迹用增感屏于-80℃放射自显影24小时。约1.7kb的多核苷酸转录本被命名为ZNFN3A1基因。
利用Clontech的Marathon cDNA扩增试剂盒根据制造商的指示通过cDNA末端5’快速扩增(5’RACE)，从而测定转录本5’区序列。为扩增ZNFN3A1 cDNA的5’部分，采用基因特异性反向引物(5’-CTGCCAAGAAGTCGGAGTCTGGAG)[SEQ.ID.NO.8]。cDNA模板通过RT-PCR自人睾丸mRNA合成。PCR产物利用Invitrogen的TA克隆化试剂盒进行克�。湫蛄杏美醋訟pplied Biosystems的ABI PRISM 377 DNA测序仪进行测定。结果，组装得到SEQ.ID.NO1所示的具有1622个核苷酸的序列，它含有编码428个氨基酸的1284个核苷酸的开放读框。
由于在EST数据库中未鉴定出含有ZNFN3A1基因5’部分的EST克�。诨蜃槭菘庵胁檎伊擞隯NFN3A1 cDNA相应的基因组序列。在基因组序列对比中发现了归属于染色体带1q44的粘粒序列，它也包括ZNFN3A1基因。利用GENSCAN和Gene Recognition(GENSCAN来自MIT(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)而GRAIL 2来自IMS(http//www.genome.ad.jp))以及ABI提供的Assembly Internet Link程序(AutoAssembler 2.1)，预测了侯选外显子序列，并进行了外显子连接。
实施例2B分离并鉴定新的人类蛋白，ZNFN3A1利用含有编码428个氨基酸的开放读框的1622个核苷酸的序列，利用简单�？楣乖煅芯抗ぞ�(SMART)从中EMBL(http//smart.embl-heidelberg.de)鉴定到了蛋白ZNFN3A1。SMART提示，ZNFN3A1蛋白含有zf-MYND[锌指蛋白(含MYND结构域)]结构域(密码子49-87)以及SET[(Su(var)3-9，zeste增强子，Trithorax)]结构域(密码子117-246)(图2A)。ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列与小鼠(Mus musculus)ES细胞cDNA的氨基酸序列(GenBank登录号AK010447)享有94％的同一性(图2B)，编码该蛋白的基因被命名委员会命名为“ZNFN3A1”/(锌指蛋白，亚家族3A(含MYND结构域)，1)。
实施例3ZNFN3A1亚细胞定位与ZNFN3A1相应的完整编码区被克隆到pEGFP-N1载体和pFLAG-CMV-5a载体中，这些构建物被转染到SNU475细胞中并表达。EGFP标记型ZNFN3A1和FLAG标记型ZNFN3A1通过蛋白质印迹确认(数据未显示)。通过荧光免疫细胞化学分析，在胞浆和核中都检测到均质的ZNFN3A1-EGFP融合蛋白和FLAG-标记的ZNFN3A1蛋白(图3A-F)。利用ZNFN3A1特异性抗体观察了内源ZNFN3A1蛋白的亚细胞定位。
有趣的是，ZNFN3A1蛋白的亚细胞定位在细胞周期进程中或者因培养细胞的密度而改变。通过进行内源ZNFN3A1蛋白的免疫细胞化学分析，有些量的蛋白在低细胞浓度培养的情况下定位于核内(图3G-I和图3M-O)。不过，在高细胞浓度培养的情况下，大多数ZNFN3A1蛋白定位于胞浆中(图3J-L和图3P-R)。这些结果揭示ZNFN3A1的亚细胞定位取决于细胞浓度。当细胞处于S期中期到晚期或者培养于稀疏条件下时，ZNFN3A1在核中积聚，而当它们处于其它时期或生长在密集条件下时，ZNFN3A1定位于胞浆和核中。
进行免疫细胞化学分析，用含4％多聚甲醛的PBS将培养的细胞在带有小格的载玻片上固定15分钟，然后用含0.1％Triton X-100的PBS室温下处理2.5分钟使之渗透。细胞用2％BSA在PBS中于4℃覆盖24小时以封闭非特异性杂交，随后与1∶2000稀释的小鼠抗-FLAG抗体和1∶3000稀释的兔抗-ZNFN3A1抗体(一抗)温育。抗体用荧光底物偶联的抗-小鼠IgG和抗-兔1gG二抗(ICN/Cappel和Jackson Immuno Research)染色。核用4′，6′-联脒-2′-苯基吲哚二氢氯化物(4’，6’-diamidine-2’-phenylindole dihydrochioride)(DAPI)复染。荧光图像用ECLIPSE E800显微镜获取。
ZNFN3A1的定位可能取决于细胞周期，因而利用流式细胞仪在不同细胞浓度的SNU475细胞中分析细胞周期。细胞以1×105细胞/100mm皿的密度铺板。细胞在指定的时间用胰蛋白酶处理，收集于PBS中，并固定在70％冷乙醇中。RNase处理后，细胞在PBS中用碘化丙锭(50μg/ml)染色。在Becton Dickinson FACScan上进行流式细胞计数，并通过CellQuest和ModFit软件(Verity Software House)进行分析。从至少20,000个未经选通的细胞确定处于细胞周期G0/G1、S和G2/M期的核、以及任何亚-G1细胞群的百分比。
将低细胞浓度和高细胞浓度相比，处于G0/G1期的细胞群在高细胞浓度的情况下升高，然而S和G2/M期的细胞群大大下降。为详细确定细胞周期对ZNFN3A1定位的影响，利用阿非迪霉素(aphidicolin)使Huh7细胞同步化，并观察ZNFN3A1的亚细胞定位(图4a，b)。大多数Huh7细胞在阿非迪霉素处理36小时之后停留在G0/G1期，并且ZNFN3A1定位于胞浆中。当从培养基中除去阿非迪霉素后，细胞周期得以前进，并且ZNFN3A1蛋白从胞浆转移到核中。这些数据证明ZNFN3A1蛋白的亚细胞定位受细胞周期状态的调控，而且ZNFN3A1蛋白在增殖条件下转移到核中。
实施例4ZNFN3A1对正常组织细胞系NIH3T3细胞的生长的促进为分析ZNFN3A1基因转移对肝细胞癌细胞系生长的影响，用包含有义ZNFN3A1和反义-ZNFN3A1的表达质粒pcDNA3.1转染正常组织细胞系NIH3T3细胞。
利用FuGENE 6转染试剂根据供应商的建议用含有全长ZNFN3A1编码序列的pcDNA3.1载体(Invitrogen)转染NIH3T3细胞。细胞在含有10％FBS和0.9mg/ml遗传霉素(geneticin)的DMEM中维持，并挑选单个集落。通过RT-PCR确定组成型ZNFN3A1表达。
NIH3T3细胞通常不表现出ZNFN3A1 mRNA的内源表达。在集落形成时，有义ZNFN3A1表达载体促进的NIH3T3细胞的集落形成，而模拟物和反义-ZNFN3A1载体与之则相比显示未生长，如图5A、5B所示。
集落形成测定通过将细胞以1×105细胞/100mm皿的密度铺板来进行。24小时后，利用FuGENE 6转染试剂(Roche)用质粒载体转染细胞，并用适当浓度的遗传霉素培养2周。细胞用100％甲醇固定，并用Giemsa溶液染色。这些集落形成测定通过三个独立的实验确认。
为进一步研究ZNFN3A1的生长促进效果，进一步对ZNFN3A1稳定转染的NIH3T3细胞进行检查。被有义ZNFN3A1稳定转染的细胞表达组成型ZNFN3A1 mRNA(图5C，5D)。表达由RT-PCR测定。如图5C、5D中所示，持续表达ZNFN3A1的集落与被反义ZNFN3A1和对照载体转染的细胞相比，表现出高的生长能力，表明ZNFN3A1对于肝细胞癌细胞的生长促进具有重要作用。
实施例5反义寡核苷酸所致的ZNFN3A1表达的降低阻抑了肝细胞癌细胞的生长为调查阻抑ZNFN3A1是否可诱导HCC细胞的生长迟缓和/或细胞死亡，合成了许多反义寡核苷酸以抑制ZNFN3A1的表达。跨起始密码子的ZNFN3A1的有义或反义S-寡核苷酸利用LIPOFECTIN试剂(GIBCO-BRL)转染。硫代磷酸酯修饰的ODN序列如下反义S-寡核苷酸5’-GCGGGAGGATGGAGCC(SEQ.ID.NO.3)。
细胞与有义和反义S-寡核苷酸培养24小时，并通过RT-PCR和利用抗-ZNFN3A1抗体的蛋白质印迹对它们的ZNFN3A1和ZNFN3A1表达进行分析。
用跨起始密码子的反义S-寡核苷酸转染的细胞显著降低组成型地表达大量ZNFN3A1的SNU475和Huh7细胞中ZNFN3A1的内源表达(图6A、B)。如先前所描述的集落形成测定所确定的，反义S-寡核苷酸的转染还显著抑制Huh7和SNU475细胞的细胞数目。
MTT试验通过将细胞以1×105细胞/100mm皿的密度铺板来进行。第二天，细胞用ZNFN3A1的有义或反义S-寡核苷酸转染，一式三份。培养72小时之后，培养基用含5mg 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑溴化物(MTT)(SIGMA)的10ml新鲜培养基替换。于37℃进一步温育4小时之后，细胞通过添加1ml 0.01N HCI/10％SDS裂解。颜色反应用ELISA板阅读器在570nm测试波长处定量(参比，630nm)。细胞存活力表示为与对照相比较的吸光度。
还在其它HCC细胞系包括Alexander细胞和SNU423细胞中观察到因反义-ZNFN3A1转染所引起的与对照S-寡核苷酸相比的细胞生长阻抑，如图6C、6D所示，所述两种细胞也都组成型地表达大量的ZNFN3A1。集落形成测定结果通过三个独立实验得到确认。此外，流式细胞计数显示抑制ZNFN3A1表达可显著降S期细胞群的细胞数目并提高亚-G1期的数目(图6E)。这些结果揭示，阻抑ZNFN3A1表达可诱导HCC的生长抑制和促进其凋亡。
实施例6ZNFN3A1与RNA螺旋酶KIAA0054的相互作用为调查ZNFN3A1的致癌机制，利用酵母双杂交筛选系统寻找与ZNFN3A1相互作用的蛋白。酵母双杂交试验利用Clontech的MATCHMAKER GAL4双杂交系统2和系统3根据制造商的方案进行。全长ZNFN3A1编码序列被克隆到pAS2-1的EcoR I位点中作为诱饵载体。为筛选文库，将人睾丸文库克隆到pACT2(Clontech)中。将同时共转化的AH109酵母细胞(带有pAS2-1诱饵载体和多个pACT2捕获载体)涂板在添加有25mg/L X-α-Gal(Clontech)和25mM 3-氨基-1，2，4，-三唑(Sigma)的SD基本培养基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)上。从阳性集落中分离文库质粒，并对序列和读框进行确认。
在鉴定的克隆中，RNA螺旋酶KIAA0054的C-末端区与ZNFN3A1通过利用pAS2.1-ZNFN3A1和pACT2-KIAA0054进行的同时转化而相互作用(图7A、7B)。RNA螺旋酶构成一个利用核苷三磷酸作为能源解开双链RNA的蛋白家族。很清楚RNA螺旋酶是事实上发现于所有的生物过程中的广泛分布的一组蛋白。
为进一步确认ZNFN3A1和KIAA0054的相互作用，制备了FLAG-标记的ZNFN3A1蛋白。每10-cm皿HeLa细胞用8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1和pCMV-HA-KIAA0054 DNA转染，并且再过48小时后收集。细胞用含150mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(PBS)(pH7.4)洗涤1次，并在NET-N缓冲液(150mM NaCl、0.5％NP-40、20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、和1X完全蛋白酶抑制剂混合物)中裂解。在典型的免疫沉淀反应中，300μgHela全细胞裂解物提取物与1μg所需抗体和20μl蛋白A或蛋白G Sepharose珠子(Zymed)于4℃温育1-2小时。珠子用1ml NET-N缓冲液洗涤4次。结合于珠子的蛋白通过在SDS样品缓冲液中煮沸而洗脱，通过SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。膜如上所述用于免疫印迹。裂解物用抗-FLAG抗体和抗-HA抗体作为对照通过免疫印迹进行直接分析。ZNFN3A1蛋白显示了它与表达在HeLa哺乳动物细胞中的HA-标记的KIAA0054蛋白的结合(图7C)。
为鉴定ZNFN3A1中负责与KIAA0054相互作用的区域，利用ZNFN3A1缺失片段进行双杂交试验。缺乏氨基酸1-250或者100-428的突变体与KIAA0054 C-末端区的相互作用为阴性，而含有氨基酸100-250的片段为阳性(图8)。这说明ZNFN3A1-结合区位于SET结构域中。
实施例7ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之间的相互作用RNA螺旋酶通过结合转录因子和RNA聚合酶II对转录起着关键作用。这些结果显示存在着锌指蛋白ZNFN3A1通过不仅与RNA螺旋酶KIAA0054而且与RNA聚合酶II结合调控转录的可能性。ZNFN3A1、RNA螺旋酶KIAA0054和RNA聚合酶II之间的结合由共免疫沉淀测试(图9)。每10-cm皿HeLa细胞用8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1和pCMV-HA-KIAA0054 DNA转染，并且再过48小时后收集。细胞用含150mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(PBS)(pH 7.4)洗涤1次，并在NET-N缓冲液(150mM NaCl、0.5％NP-40、20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、和1X完全蛋白酶抑制剂混合物)中裂解。在典型的免疫沉淀反应中，300μg全细胞裂解物提取物与1μg抗体和20μl蛋白A或蛋白G Sepharose珠子(Zymed)于4℃温育1-2小时。珠子用1ml NET-N缓冲液洗4次。结合于珠子的蛋白通过在SDS样品缓冲液中煮沸而洗脱，通过SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜上。膜如上所述用于免疫印迹。
利用抗-FLAG抗体、抗-HA抗体和抗-RNA聚合酶II抗体检测到与内源RNA聚合酶II的结合。当抗-FLAG抗体用于免疫沉淀并且抗RNA聚合酶II抗体用于免疫印迹的时候，RNA聚合酶II特异性带在共同表达FLAG-ZNFN3A1蛋白和HA-KIAA0054蛋白的情况下被强烈检测到，并且在仅表达FLAG-ZNFN3A1蛋白的情况下少量检测到。在另一方面，当抗-HA抗体用于免疫沉淀并且抗RNA聚合酶II抗体用于免疫印迹的时候，RNA聚合酶特异性带不仅在共同表达FLAG-ZNFN3A1蛋白和HA-KIAA0054蛋白的情况下，而且还在仅表达HA-KIAA0054蛋白的情况下被强烈检测到。而且，通过改变用于免疫沉淀和免疫印迹的抗体反向进行了共免疫沉淀。结果与利用对等抗体的情况相似。这些结果证明RNA螺旋酶KIAA0054通过分别与ZNFN3A1蛋白和RNA聚合酶II接触，可以介导ZNFN3A1蛋白和RNA聚合酶II之间的复合体的形成。因此，ZNFN3A1、RNA螺旋酶KIAA0054和RNA聚合酶II的转录调控可能在肝细胞癌致癌作用中对促进细胞生长方面具有重要作用。图12是ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之间形成的复合体调控基因转录的图解。
实施例8ZNFN3A1蛋白的序列特异性结合利用含有20个随机核苷酸的核心的寡核苷酸构建物测定了ZNFN3A1的共有DNA结合位点。利用随机寡核苷酸通过DNA选择手段寻找公认的能够在体外与ZNFN3A1蛋白结合的保守性序列。制备了GST-ZNFN3A1融合蛋白，并将其固定在Sepharose 4B是噶报告，选出能与该蛋白结合的双链随机寡核苷酸DNA。在经过10次选择和随后的扩增之后，扩增的DNA被克隆到PCR载体(Clontech)中，并对92个克隆进行了测序。在这92个克隆中，32个(34.8％)含有共有序列5’-CCCTCC-3’，这是比计算概率高102倍的发生率(图10A)。为制备表达ZNFN3A1锌指结构域的重组蛋白，利用一对引物5’-CGGAATTCATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAAAG-3’[SEQ.ID.NO.9]和5’-CCGCTCGAGGGATGCTCTGATGTTGGCGTCG-3’[SEQ.ID.NO.10]，通过RT-PCR扩增了与全长ZNFN3A1密码子对应的cDNA片段，将其亚克隆到pGEX-6P质粒中合适的克隆位点上。如前所述制备重组融合蛋白并由Sepharose 46柱纯化。具有序列“5’-GGGAGAATTCCGACACGCGT(N20)CTCGAGCGTCTACATGGATCCTCA-3”’[SEQ.ID.NO.11]的寡核苷酸，用于按照上文所述进行选择和扩增。
利用真核启动子数据库(http//www.epd.isb-slb.ch/index.html)，寻找ZNFN3A1下游候选基因，并挑选到5个候选基因。首�。ü攵縍T-PCR在外源表达ZNFN3A1的COS7稳定转染体中测定每个基因的表达水平(图10B)。这些结果揭示EGFR、myc和Bc12的表达被ZNFN3A1上调。
在EGFR的5’侧翼区-213-bp和-207-bp之间(CBS1)、-106-bp和-100-bp之间(CBS2)、-65-bp和-59-bp之间(CBS3)、以及-46-bp和-40-bp之间(CBS4)，鉴定到四个公认的ZNFN3A1结合位点，它们的共有靶序列为5’-(C)CCCTCC(T)或(A)GGAGGG(G)-3’。通过将CBS1、CBS2、cBS3和CBS4每个序列克隆到pGL3-基础载体(Promega)的合适的酶位点中，制备了含有这些序列的野生型报告质粒(P1)以及该质粒的四个缺失构建体(P2、P3、P4和P5)。质粒P1、P2、P3、P4和P5通过扩增来制备，其中用到P1-F(5′-GGGGTACCCAGTGCTGGGAACGCCCCTCTCG-3′)[SEQ.ID.NO.12]、P2-F(5’-GGGGTACCCACTCCCGCCGGAGACTAGGTCC-3’)[SEQ.ID.NO.13]、3-F(5’-GGGGTACCCTCGCATTCTCCTCCTCCTCTGC-3’)[SEQ.ID.NO.14]、4-F(5’-GGGGTACCTGGTCCCTCCTCCTCCCGCCCTG-3’)[SEQ.ID.NO.15]或P5-F(5’-GGGGTACCTCCCGCCCTGCCTCCCGCGCCTC-3’)[SEQ.ID.NO.16]以及相同的反向引物(P1-R；5’-GAAGATCTAG GTGGCCTGTCGTCCGGTCTG G-3’)[SEQ.ID.NO.17]。利用QuickChange定点诱变试剂盒根据供应商(Stratagene)的建议用CATTCC取代CCCTCC，从而对两个公认的ZNFN3A1结合位点进行定点诱变。
每个报告质粒(2μg)利用FuGENE6试剂(Boehringer)根据制造商的说明与0.2μg pRL-TK质粒(Promega)共转染。利用双重-萤光素酶报告子测定系统(Promega)按照制造商的方案进行萤光素酶测定。
实施例9ZNFN3A1对EGFR启动子活性的上调既然在HCC中报道了增强的EGFR表达，我们聚焦于该报告分子并测试它的启动子是否受ZNFN3A1-结合序列的调控。我们在它的5’侧翼区鉴定到四个可能的ZNFN3A1-结合基元(CBS1、2、3和4)，并制备了含有这四个基元的报告质粒(P1)以及多个缺失形式(P2、P3、P4和P5)。当这些报告质粒被转染到SNU475细胞中时，P1的活性显著高于P2、P3、P4或P5。考虑到P4的活性与P5的非常相似的事实，我们认为-261和-50之间含有CBS1、CBS2和CBS3的区域，可能与EGFR的转录激活相关。为揭露这些结构域的作用，我们构建了含有突变体CBS1(P1m1)和突变体CBS2(P1m2)或者突变的CBS3(P1m3)的报告质粒，其中每个候选结合基元由5’-CCCTCC-3’变为5’-CATTCC-3’(图11A)。报告子测定揭示含突变基元的片段(P1m1、P1m2和P1m3)激活EGFR转录的程度比P1弱(图11B)。这些结果意味着这三个公认的ZNFN3A1-结合基元参与EGFR的转录激活。
工业实用性新的人类基因ZNFN3A1在肝细胞癌中的表达与非癌肝组织相比显著提高。因此，该基因可作为HCC的诊断标志，而其所编码的蛋白因此可用于诊断测定。
本发明人还已经证明新蛋白ZNFN3A1的表达促进细胞生长，反之细胞生长受与ZNFN3A1相应的反义寡核苷酸的抑制。这些发现表明ZNFN3A1刺激致癌活性。因此，这种新的癌蛋白是开发抗癌医药品的有用靶。举例来说，封闭ZNFN3A1表达或者阻止它的活性的制剂可能会找到作为抗癌制剂的治疗用途，特别是治疗HCC的抗癌制剂。这类制剂的例子包括识别ZNFN3A1的反义寡核苷酸和抗体。
此外，本发明人已经证明ZNFN3A1直接与RNA螺旋酶联合并与RNA聚合酶II形成复合体。该复合体随即通过与5’侧翼区元件“(C)CCCTCC(T)”的直接结合，激活下游靶基因，包括EGFR的转录。因此，抑制该复合体活性的制剂可能也会找到治疗和预防HCC的用途。
尽管已经详细并参照其中的具体实施方案对本发明进行了描述，对本领域熟练技术人员显而易见的是，能够对其进行各种变化和修饰而不偏离本发明的精神和范围。
序列表<110>东京大学总长代表日本国(JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THEUNIVERSITY OF TOKYO ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)<120>肝细胞癌相关基因和蛋白<130>ONC-A0206P<150>US 60/324.261<151>2001-09-25<150>US 60/391,666<151>2002-06-26<150>CA<151>2002-08-23<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1622<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(96)..(1382)<223>
<400>1gtgcgcgcag ggcgcaggcg cgcgggtccc ggcagcccgt gagacgcccg ctgctggacg60cgggtagccg tctgaggtgc cggagctgcg ggagg atg gag ccg ctg aag gtg 113Met Glu Pro Leu Lys Val1 5gaa aag ttc gca acc gcc aac agg gga aac ggg ctg cgc gcc gtg acc 161Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn Gly Leu Arg Ala Val Thr10 15 20
ccg ctg cgc ccc gga gag cta ctc ttc cgc tcg gat ccc ttg gcg tac 209Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg Ser Asp Pro Leu Ala Tyr25 30 35acg gtg tgc aag ggg agt cgt ggc gtc gtc tgc gac cgc tgc ctt ctc 257Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val Cys Asp Arg Cys Leu Leu40 45 50ggg aag gaa aag ctg atg cga tgc tct cag tgc cgc gtc gcc aaa tac 305Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln Cys Arg Val Ala Lys Tyr55 60 65 70tgt agt gct aag tgt cag aaa aaa gct tgg cca gac cac aag cgg gaa 353Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp Pro Asp His Lys Arg Glu75 80 85tgc aaa tgc ctt aaa agc tgc aaa ccc aga tat cct cca gac tcc gtt 401Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg Tyr Pro Pro Asp Ser Val90 95 100cga ctt ctt ggc aga gtt gtc ttc aaa ctt atg gat gga gca cct tca 449Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu Met Asp Gly Ala Pro Ser105 110 115gaa tca gag aag ctt tac tca ttt tat gat ctg gag tca aat att aac 497Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp Leu Glu Ser Asn Ile Asn120 125 130aaa ctg act gaa gat aag aaa gag ggc ctc agg caa ctc gta atg aca 545Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu Arg Gln Leu Val Met Thr135 140 145 150ttt caa cat ttc atg aga gaa gaa ata cag gat gcc tct cag ctg cca 593Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln Asp Ala Ser Gln Leu Pro155 160 165cct gcc ttt gac ctt ttt gaa gcc ttt gca aaa gtg atc tgc aac tct 641Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala Lys Val Ile Cys Asn Ser170 175 180ttc acc atc tgt aat gcg gag atg cag gaa gtt ggt gtt ggc cta tat 689Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu Val Gly Val Gly Leu Tyr185 190 195
ccc agt atc tct ttg ctc aat cac agc tgt gac ccc aac tgt tcg att 737Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Cys Ser Ile200 205 210gtg ttc aat ggg ccc cac ctc tta ctg cga gca gtc cga gac atc gag 785Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg Ala Val Arg Asp Ile Glu215 220 225 230gtg gga gag gag ctc acc atc tgc tac ctg gat atg ctg atg acc agt 833Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu Asp Met Leu Met Thr Ser235 240 245gag gag cgc cgg aag cag ctg agg gac cag tac tgc ttt gaa tgt gac 881Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln Tyr Cys Phe Glu Cys Asp250 255 260tgt ttc cgt tgc caa acc cag gac aag gat gct gat atg cta act ggt 929Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp Ala Asp Met Leu Thr Gly265 270 275gat gag caa gta tgg aag gaa gtt caa gaa tcc ctg aaa aaa att gaa 977Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu Ser Leu Lys Lys Ile Glu280 285 290gaa ctg aag gca cac tgg aag tgg gag cag gtt ctg gcc atg tgc cag 1025Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln Val Leu Ala Met Cys Gln295 300 305 310gcg atc ata agc agc aat tct gaa cgg ctt ccc gat atc aac atc tac 1073Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu Pro Asp Ile Asn Ile Tyr315 320 325cag ctg aag gtg ctc gac tgc gcc atg gat gcc tgc atc aac ctc ggc 1121Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp Ala Cys Ile Asn Leu Gly330 335 340ctg ttg gag gaa gcc ttg ttc tat ggt act cgg acc atg gag cca tac 1169Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr Arg Thr Met Glu Pro Tyr345 350 355agg att ttt ttc cca gga agc cat ccc gtc aga ggg gtt caa gtg atg 1217Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val Arg Gly Val Gln Val Met360 365 370
aaa gtt ggc aaa ctg cag cta cat caa ggc atg ttt ccc caa gca atg 1265Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly Met Phe Pro Gln Ala Met375 380 385 390aag aat ctg aga ctg gct ttt gat att atg aga gtg aca cat ggc aga 1313Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met Arg Val Thr His Gly Arg395 400 405gaa cac agc ctg att gaa gat ttg att cta ctt tta gaa gaa tgc gac 1361Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu Leu Leu Glu Glu Cys Asp410 415 420gcc aac atc aga gca tcc taa gggaacgcag tcagagggaa atacggcgtg 1412Ala Asn Ile Arg Ala Ser425tgtctttgtt gaatgcctta ttgaggtcac acactctatg ctttgttagc tgtgtgaacc1472tctcttattg gaaattctgt tccgtgtttg tgtaggtaaa taaaggcaga catggtttgc1532aaaccacaag aatcattagt tgtagagaag cacgattata ataaattcaa aacatttggt1592tgaggatgcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1622<210>2<211>428<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Pro Leu Lys Val Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn1 5 10 15Gly Leu Arg Ala Val Thr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg20 25 30Ser Asp Pro Leu Ala Tyr Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val35 40 45Cys Asp Arg Cys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln50 55 60
Cys Arg Val Ala Lys Tyr Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp65 70 75 80Pro Asp His Lys Arg Glu Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg85 90 95Tyr Pro Pro Asp Ser Val Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu100 105 110Met Asp Gly Ala Pro Ser Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp115 120 125Leu Glu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu130 135 140Arg Gln Leu Val Met Thr Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln145 150 155 160Asp Ala Ser Gln Leu Pro Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala165 170 175Lys Val Ile Cys Asn Ser Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu180 185 190Val Gly Val Gly Leu Tyr Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys195 200 205Asp Pro Asn Cys Ser Ile Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg210 215 220Ala Val Arg Asp Ile Glu Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu225 230 235 240Asp Met Leu Met Thr Ser Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln245 250 255Tyr Cys Phe Glu Cys Asp Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp260 265 270Ala Asp Met Leu Thr Gly Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu275 280 285Ser Leu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln290 295 300
Val Leu Ala Met Cys Gln Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu305 310 315 320Pro Asp Ile Asn Ile Tyr Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp325 330 335Ala Cys Ile Asn Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr340 345 350Arg Thr Met Glu Pro Tyr Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val355 360 365Arg Gly Val Gln Val Met Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly370 375 380Met Phe Pro Gln Ala Met Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met385 390 395 400Arg Val Thr His Gly Arg Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu405 410 415Leu Leu Glu Glu Cys Asp Ala Asn Ile Arg Ala Ser420 425<210>3<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>3gcgggaggat ggagcc16<210>4<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>4acaacagcct caagatcatc ag22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>5ggtccaccac tgacacgttg 20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>6ttcccgatat caacatctac cag 23<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>7agtgtgtgac ctcaataagg cat 23<210>8<211>24
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>8ctgccaagaa gtcggagtct ggag 24<210>9<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>9cggaattcat ggagccgctg aaggtggaaa ag 32<210>10<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>10ccgctcgagg gatgctctga tgttggcgtc g 31<210>11<211>64<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(40)<223>″n″＝A，G，C或T<400>11gggagaattc cgacacgcgt nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ctcgagcgtc tacatggatc60ctca 64<210>12<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>12ggggtaccca gtgctgggaa cgcccctctc g 31<210>13<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>13ggggtaccca ctcccgccgg agactaggtc c 31<210>14<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>14
ggggtaccct cgcattctcc tcctcctctg c 31<210>15<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>15ggggtacctg gtccctcctc ctcccgccct g 31<210>16<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>16ggggtacctc ccgccctgcc tcccgcgcct c 31<210>17<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一个人工合成的引物序列<400>17gaagatctag gtggcctgtc gtccggtctg g 3权利要求
1.分离的DNA，为下面(a)到(d)中任何之一(a)编码由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2组成的蛋白的DNA；(b)包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的编码区的DNA；(c)编码由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2组成的蛋白的DNA，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，从而所编码的蛋白是由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2组成的蛋白的功能等价体；和(d)在严谨条件下与由核苷酸序列SEQ.ID.NO.1组成的DNA杂交的DNA，从而所编码的蛋白是由任何一种SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白的功能等价体。
2.分离的DNA，编码由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2组成的蛋白的部分肽。
3.载体，其中插入了权利要求1或2的DNA。
4.转化的细胞，包含权利要求1或2的DNA，或者权利要求3的载体。
5.分离的蛋白，由根据权利要求1的DNA编码，具有促进细胞增殖和靶基因的转录激活的活性。
6.分离的多肽，由根据权利要求2的DNA编码。
7.制备权利要求5的蛋白的方法，包括培养权利要求4的转化细胞，并从细胞或其培养上清收集所表达的蛋白的步骤。
8.转录激活复合体，包括权利要求5的蛋白及其至少一种共激活因子。
9.权利要求8的复合体，其中的共激活因子选自RNA螺旋酶或RNA聚合酶。
10.抗体，它识别并特异性结合权利要求5的蛋白或权利要求8的复合体。
11.多核苷酸，与由核苷酸序列SEQ.ID.NO.1组成的DNA或其互补链杂交，并包括至少15个核苷酸。
12.用于治疗癌症的治疗制剂，包括权利要求10的抗体或者权利要求11的多核苷酸。
13.筛选与权利要求5所述蛋白结合的化合物的方法，包括步骤(a)使包含至少一种测试化合物的受试样品与权利要求5的蛋白或其部分肽进行接触；(b)检测受试样品与蛋白或其部分肽的结合活性；和(c)选择与蛋白或其部分肽结合的测试化合物。
14.与权利要求5的蛋白结合的化合物，它能够通过权利要求13的方法分离。
15.筛选抑制权利要求5所述蛋白的活性的化合物的方法，包括步骤(a)在存在包含至少一种测试化合物的受试样品的时候培养表达权利要求5的蛋白或其部分肽的细胞；(b)检测细胞增殖；和(c)选择与不存在受试样品时所检测到的增殖相比抑制增殖的测试化合物。
16.抑制权利要求5的蛋白的活性的化合物，它能够通过权利要求15的方法分离。
17.筛选抗癌活性的化合物的方法，包括步骤(a)使包含至少一种测试化合物的受试样品与权利要求5的蛋白、它的共激活因子以及包含所述蛋白的靶序列的DNA，在允许所述蛋白和DNA形成复合体的合适条件下接触；和(b)选择抑制复合体形成的测试化合物。
18.权利要求17的方法，其中所述靶序列包括侧接EGFR 5’区的CBS序列。
19.筛选抗癌活性的化合物的方法，包括步骤(a)使包含至少一种测试化合物的受试样品与权利要求7的复合体和具有为所述复合体识别的转录调控区的报告基因接触；和(b)选择抑制报告基因表达的测试化合物。
20.抗癌组合物，包括通过权利要求18或19的方法分离的化合物作为活性成分。
21.抗癌组合物，包括与权利要求1的DNA结合的反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA作为活性成分。
22.诊断癌症的方法，其中所述方法包括步骤(a)测定标本的生物样品中ZNFN3A1基因的表达水平；(b)将ZNFN3A1基因的表达水平与正常样品中的水平相比较，和(c)将样品中ZNFN3A1基因的高表达水平判定为具有癌症。
23.权利要求13的方法，其中癌症是肝细胞癌。
24.诊断肝细胞癌的诊断剂，包括与权利要求1的DNA或者权利要求5的蛋白结合的化合物。
全文摘要
本申请提供了新的人类基因ZNFN3A1，它的表达在大多数HCC中与相应的非癌肝组织相比显著升高。该基因编码的蛋白具有锌指结构域以及SET结构域，并发现与RNA螺旋酶和RNA聚合酶形成调节复合体。
文档编号G01N33/15GK1628179SQ0282340
公开日2005年6月15日 申请日期2002年9月25日 优先权日2001年9月25日
发明者中村佑辅, 古川洋一 申请人:东京大学总长代表日本国, 肿瘤疗法科学股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
