专利名称：一种大鼠cyp450酶质谱绝对定量方法
技术领域：
本发明属于蛋白质组学的技术领域，涉及一种同时测定大鼠5种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法。
背景技术：
药物进入体内后可经过代谢过程以一种或多种有活性或无活性的代谢产物形式排出体外。由于遗传多态性及表观遗传的因素，使得作用于药物代谢过程的酶有明显的种族差异和个体差异。因此，药物代谢酶的定性和定量分析对于药物开发，评价药物的代谢过程以及研究药物-药物相互作用具有重要的参考价值和意义。目前，用于酶定量分析的方法主要包括探针药物法、Western bLotting法、2-D电泳法和mRNA检测法，但这些方法都存在着一定的不足。例如，CYP450酶家族属于同工酶，其底物常常具有交叉现象，很难找到CYP450酶绝对专一的探针药物，至今只有极少数CYP450酶底物的专一性得到了全面的验证；CYP450酶特别是亚家族内同工酶序列存在高度同源性，这为Western bLotting法中所需特异性抗体的制备和纯化提出了很高的要求；2_D电泳法，操作连续性强，劳动密集，而且不能用于CYP450膜结合蛋白的分析；由于蛋白质的表达受到多种机制的调控，利用mRNA表达的水平代表其对应的蛋白含量并不十分可靠。这些方法的最大的不足是专属性差，无法区分同源性很高的如CYP2B1和CYP2B2等CYP450酶亚型；并且定量时仅能给出相对含量的信息，而酶的绝对含量对于评价其生物学意义是十分重要的。因此，建立一种药物代谢酶亚型绝对定量方法是十分必要的。与本发明相近的现有技术是CN102175804的发明专利申请。涉及的是测定人的CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法；在蛋白样品预处理中没有进行固相萃取和浓缩复溶，影响检测的定量准确性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，建立一种可以同时测定大鼠的5种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法。涉及的CYP450酶亚型是CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2。本发明采取的技术方案是，选取经胰酶水解CYP450酶获得的特异性肽段，其中特异性是指肽段只由其相对应的CYP450酶经胰酶水解产生，其他蛋白质经胰酶水解并不能产生该肽段。基于液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)技术，利用多重反应监测(MRM)模式对特异性肽段进行扫描分析，建立特异性肽段稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法。所测得特异性肽段浓度经由蛋白浓度校正获得CYP450酶亚型绝对含量。采取上述方法即可实现利用正常肽段定量CYP450酶亚型水平。正常肽段即是待测肽段。本发明的具体技术方案如下所述。一种大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法，涉及5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2 ;过程有蛋白样品预处理，标准曲线制备，最后进行蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定；
所述的蛋白样品预处理，有如下5步骤，( I)蛋白样品的还原，于聚乙烯管中加入100 μ L大鼠肝微粒体样品；加入50mg固体变性剂，涡流溶解混匀,所述的固体变性剂,是尿素；加入10 μ L pH缓冲液，涡流混匀，所述的pH缓冲液，是500mM的碳酸氢氨溶液；加入4 μ L还原剂，涡流混匀，所述的还原剂，是300mM的二硫苏糖醇溶液；37°C孵育I小时，得到反应液；(2)半胱氨酸的封闭，于反应液中加入12 μ L半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；室温孵育40min ;所述的半胱氨酸封闭剂，是300mM的碘乙酰胺溶液；(3)肝微粒体样品的胰酶消化，经半胱氨酸封闭的反应液中加入400 μ L消化缓冲液，再加入20 μ L胰酶溶液，涡流混合，37°C孵育12 16h得到肝微粒体样品反应液，后13000g离心5min得肝微粒体样品酶解反应上清溶液；所述的消化缓冲液，是50mM的碳酸氢氨溶液；所述的胰酶溶液，是0.5mg/mL的胰酶溶液；(4)肝微粒体样品酶解反应液的固相萃�。诠滔噍腿≈屑尤隝mL甲醇溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入ImL洗脱溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入ImL淋洗溶液，至液体自然流完，两遍洗；取肝微粒体样品酶解反应上清溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入ImL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗；于固相萃取柱中加入ImL洗脱溶液，至液体自然流完，得肝微粒体样品洗脱液，置于聚乙烯管中；所述的洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液，所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液；(5)肝微粒体样品洗脱液的浓缩、复溶，将肝微粒体样品洗脱液真空离心蒸干，加入100 μ L去离子水，涡流混匀，得到肝微粒体样品复溶液；所述的标准曲线制备，是利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5 μ g/ μ L，得到特异性肽段储备液；利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至50、100、300、1000、3000、IOOOOpg/μ L ；取20 μ L进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以特异性肽段浓度为横坐标，特异性肽段峰面积为纵坐标，用加权W=l/x2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线；所述的蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定，是取肝微粒体样品复溶液20 μ L进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将肽段峰面积代入标准曲线，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应CYP450酶亚型浓度；经样品蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度除以蛋白浓度，得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量；
在标准曲线制备及蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定过程中，色谱条件为:LC_20ADXR SHIMADZU型液相色谱系统；色谱柱:p印tide C18柱，50mmX2.1mm 1.D., 5 μ m粒径；流动相:甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占0.1%的乙腈，梯度洗脱；柱温40°C ;流速0.5mL/min ;进样量20 μ L ;所述的梯度洗脱程序，过程如下表所示:
权利要求
1.一种大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法，涉及5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2 ;过程有蛋白样品预处理，标准曲线制备，最后进行蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定； 所述的蛋白样品预处理，有如下5步骤， (1)蛋白样品的还原， 于聚乙烯管中加入100 μ L大鼠肝微粒体样品； 加入50mg固体变性剂，涡流溶解混匀，所述的固体变性剂，是尿素； 加入10 μ L pH缓冲液，涡流混匀，所述的pH缓冲液，是500mM的碳酸氢氨溶液； 加入4μ L还原剂,润流混勻,所述的还原剂,是300mM的二硫苏糖醇溶液； 37°C孵育I小时，得到反应液； (2)半胱氨酸的封闭， 于反应液中加入12 μ L半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；室温孵育40min ;所述的半胱氨酸封闭剂，是300mM的碘乙酰胺溶液； (3)肝微粒体样品的胰酶消化， 经半胱氨酸封闭的反应液中加入400 μ L消化缓冲液,再加入20 μ L胰酶溶液,涡流混合，37°C孵育12 16h得到肝微粒体样品反应液，后13000g离心5min得肝微粒体样品酶解反应上清溶液；所述的消化缓冲液，是50mM的碳酸氢氨溶液；所述的胰酶溶液，是0.5mg/mL的胰酶溶液； (4)肝微粒体样品酶解反应液的固相萃�。� 于固相萃取柱中加入ImL甲醇溶液，至液体自然流完； 于固相萃取柱中加入ImL洗脱溶液，至液体自然流完； 于固相萃取柱中加入ImL淋洗溶液，至液体自然流完，两遍洗； 取肝微粒体样品酶解反应上清溶液，至液体自然流完； 于固相萃取柱中加入ImL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗； 于固相萃取柱中加入ImL洗脱溶液，至液体自然流完，得肝微粒体样品洗脱液，置于聚乙烯管中； 所述的洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液，所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液； (5)肝微粒体样品洗脱液的浓缩、复溶， 将肝微粒体样品洗脱液真空离心蒸干，加入100 μ L去离子水，涡流混匀，得到肝微粒体样品复溶液； 所述的标准曲线制备，是 利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5 μ g/μ L，得到特异性肽段储备液； 利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至50、100、300、1000、3000、IOOOOpg/μ L ； 取20 μ L进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以特异性肽段浓度为横坐标，特异性肽段峰面积为纵坐标，用加权W=l/x2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线； 所述的蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定，是取肝微粒体样品复溶液20 μ L进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将肽段峰面积代入标准曲线，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应CYP450酶亚型浓度；经样品蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度除以蛋白浓度，得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量； 在标准曲线制备及蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定过程中， 色谱条件为:LC-20ADXR SHIMADZU型液相色谱系统；色谱柱:p印tide C18柱，50mmX2.1mm 1.D., 5 μ m粒径；流动相:甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占·0.1%的乙腈，梯度洗脱；柱温40°C ;流速0.5mL/min ;进样量20 μ L ;所述的梯度洗脱程序，过程如下表所示:
2.根据权利要求1所述的大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法，其特征在于，样品测定期间利用质量控制样品对方法进行验证；所述的质量控制样品按照如下步骤制备: ①利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5μ g/μ L，得到特异性肽段储备液； ②利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至100、1000、3000pg/l.!L ； ③标准肽段每浓度取三个样本，根据标准曲线，得出标准肽段浓度，计算质量控制样品准确度。
全文摘要
本发明的大鼠CYP450酶亚型质谱绝对定量方法，属于蛋白质组学技术领域。本发明基于LC/MS/MS技术，利用CYP450酶经胰酶水解产生的特异性肽段对酶进行定量的策略，实现了同时对大鼠肝微粒体等体系中5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2的绝对定量。本发明主要包括如下步骤蛋白样品的预处理、标准曲线的制备、质控样品的制备以及蛋白样品的测定。本发明的方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、精密、可靠，可用于新药开发、药物代谢研究及药物相互作用的评价。
文档编号G01N30/88GK103149315SQ20131006172
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者胡良海, 刘喜东, 孙严彤, 杨艳, 顾景凯 申请人:吉林大学
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