专利名称：取样设备和用于浓集微生物的方法
技术领域：
本发明涉及取样设备和利用该设备浓集微生物的方法。
背景技术：
由微生物污染导致的食源性疾病和医院内获得性感染为世界各地许多地方所关注。因此，测定多种诊断样品、食品样品、环境样品或其他样品中细菌或其他微生物的存在以确定所存在的微生物的身份和/或量常常是合乎需要的或是必要的。例如，可测定细菌DNA或细菌RNA，以甚至在存在其他细菌种类的情况下评估特定细菌种类的存在与否。然而，检测特定细菌的存在的能力至少部分地取决于所分析的样品中细菌的数量。可对细菌样品进行铺板或培养，以增加样品中细菌的数量，来确保足够的检测水平，但培养步骤通常需要大量的时间且因此会显著耽搁评估结果。使样品中的细菌浓集可缩短培养时间或甚至消除对于培养步骤的需要。因此，已经开发了通过使用特定细菌株系的特异性抗体(例如，为抗体包被的磁性颗粒或非磁性颗粒的形式)来分离(并由此浓集)该株系的方法。然而，这些方法往往昂贵，而且对于至少一些诊断应用来说速度仍比期望的稍慢。也已经使用了非株系特异性的浓集方法(例如，以获得对样品中所存在的微生物的较为一般性的评估)。在浓集了微生物混合群体之后，如果需要，通过使用株系特异性探针来测定特定株系的存在。已经通过基于碳水化合物和凝集素蛋白相互作用的方法实现了微生物的非特异性浓集或捕集。涂覆壳聚糖的支持物已经用作非特异性捕集装置，并且用作微生物营养素的物质(例如，碳水化合物、维生素、铁螯合的化合物以及铁载体)也已经被描述为可用作配体以进行微生物的非特异性捕集。多种无机材料(例如，羟基磷灰石和金属氢氧化物) 已经用于非特异性结合和浓集细菌。物理浓集方法(例如，过滤、色谱法、离心和重力沉降)已经被用于非特异性捕集， 其使用和/或不使用无机结合剂。这些非特异性浓集方法在速度、成本(至少一些需要昂贵的设备、材料、和/或受过训练的技术人员)、样品要求(例如，样品性质和/或体积限制)、 空间要求、使用的方便性(至少一些需要复杂的多步骤方法)、现场使用的适合性和/或效果方面不同。
发明内容
本发明描述了在取样设备中用浓集剂浓集微生物的方法。更具体地讲，在该设备中在浓集剂存在下从大体积样品浓集微生物的方法可提供快速、低成本、简单(不涉及复杂的装置或程序)和/或有效的微生物浓集过程。
在一个方面，提供用于浓集微生物的方法。该方法包括提供整体式取样设备，该整体式取样设备包括第一贮存器、第二贮存器和通道，该通道具有与第一贮存器连通的第一开口和与第二贮存器连通的第二开口，其中流体可以通过该通道在两个贮存器之间流动。 当整体式取样设备处于竖立位置时，第一贮存器的整个体积空间都在第一开口上方，并且当整体式取样设备处于任何位置时，并非第二贮存器的整个体积空间都在第二开口上方。 第二贮存器具有至少一个可重新密封的外部开口。该方法包括在整体式取样设备中混合浓集剂与含有微生物的样品，从而得到结合有微生物的组合物。该方法还包括使整体式取样设备倒置，使得第二贮存器基本上被定位在第一贮存器上方，以从第二贮存器收集结合有微生物的组合物的大部分。在一个方面，提供整体式取样设备。整体式取样设备包括具有第一开口的第一贮存器、具有第二开口和至少一个可重新密封的外部开口的第二贮存器。整体式取样设备还包括连接第一贮存器与第二贮存器的通道。具有该第一开口的通道与第一贮存器连通，并且该第二开口与第二贮存器连通。当整体式取样设备处于竖立位置时，第一贮存器的整个体积空间都在第一开口上方。当整体式取样设备处于任何位置时，并非第二贮存器的整个体积空间都在第二开口上方。在一个方面，提供用于浓集微生物的方法。该方法包括提供双组件取样设备，该双组件取样设备包括第一贮存器，该第一贮存器具有主体、可重新密封的外部开口和第一端部，该第一端部成形为使得其在距离主体最远的部分处较窄。第一端部的最远部分具有第一连接器，该第一连接器与具有第二连接器的可拆卸的抽吸式第二贮存器连接。第一贮存器被基本上定位上在可拆卸的抽吸式第二贮存器上方。第一连接器能够附接到第二连接器，使得流体能够在两个贮存器之间流动。该方法包括在双组件取样设备中混合浓集剂与含有微生物的样品，从而得到结合有微生物的组合物。该方法还包括将结合有微生物的组合物从第一贮存器的第一端部引导进入到可拆卸的抽吸式第二贮存器中。在一个方面，描述了双组件取样设备。该双组件取样设备包括第一贮存器，该第一贮存器具有主体、可重新密封的外部开口和第一端部，该第一端部成形为使得其在距离主体最远的部分处最窄。最远部分具有第一连接器。双组件取样设备包括具有第二连接器的可拆卸的抽吸式第二贮存器。第一连接器附接至第二连接器，使得流体能在第一贮存器和可拆卸的抽吸式第二贮存器之间流动。在一个方面，提供用于浓集微生物的方法。该方法包括提供整体式取样设备，该整体式取样设备包括具有第一开口和至少一个可重新密封的外部开口的第一贮存器，以及具有第二开口的第二贮存器。整体式取样设备还包括具有壳体和位于壳体内的可动部件的元件，以及第二外部开口。可动部件具有至少第一位置和第二位置。第二贮存器的内部位于可动部件内，并且第二开口位于可动部件的一部分的外部上。当整体式取样设备处于竖立位置时，第一贮存器位于元件上方。当整体式取样设备处于竖立位置时，第二外部开口位于元件下方。在第一位置处，第一通道连接第一贮存器与第二贮存器，使得第一开口与第二开口连通。在第二位置处，第二通道连接第二贮存器与第二外部开口，使得第二开口与第二外部开口成流体连通。该方法包括在取样设备中混合浓集剂与含有微生物的样品，从而得到结合有微生物的组合物。该方法还包括从第一位置到第二位置转移所述结合有微生物的组合物，使得第二开口与第二外部开口成流体连通。
在一个方面，提供整体式取样设备。整体式取样设备包括具有第一开口和至少一个可重新密封的外部开口的第一贮存器、具有第二开口的第二贮存器、元件和第二外部开口。该元件包括壳体和位于壳体内的可动部件。可动部件具有至少第一位置和第二位置。 第二贮存器的内部位于可动部件内，并且第二开口位于可动部件的一部分的外部上。当整体式取样设备处于竖立位置时，第一贮存器位于元件上方。当整体式取样设备处于竖立位置时，第二外部开口位于元件下方。在第一位置处，第一通道连接第一贮存器与第二贮存器，使得第一开口与第二开口成流体连通。在第二位置处，第二通道连接第二贮存器与第二外部开口，使得第二开口与第二外部开口成流体连通。在一个方面，提供用于浓集微生物的方法。该方法包括提供整体式取样设备，该整体式取样设备包括第一贮存器，该第一贮存器具有第一开口、第一可重新密封的外部开口和第一体积空间。该整体式取样设备包括第二贮存器，该第二贮存器具有第二开口、第二外部开口和第二体积空间。该整体式取样设备还包括具有密封件的柱塞。密封件位于柱塞的邻近柱塞远端的部分上。密封件将第二贮存器的第二体积空间与第一贮存器的第一体积空间分隔开。第二体积是通过第二外部开口移出，并且当取样设备处于竖立位置时，第一贮存器位于第二贮存器上方。该方法包括在整体式取样设备中混合浓集剂与含有微生物的样品，从而得到结合有微生物的组合物。该方法还包括用柱塞通过第二外部开口转移位于第二贮存器中的结合有微生物的组合物。在一个方面，提供整体式取样设备。该整体式取样设备包括第一贮存器、第二贮存器和柱塞。第一贮存器具有第一开口、第一可重新密封的外部开口和第一体积空间。第二贮存器具有第二开口、第二外部开口和第二体积空间。柱塞具有密封件。密封件位于柱塞的邻近柱塞远端的部分上。密封件将第二贮存器的第二体积空间与第一贮存器的第一体积空间隔开。第二体积是通过第二外部开口移出，并且当取样设备处于竖立位置时，第一贮存器位于第二贮存器的上方。
图1是用于浓集微生物的方法的示意图。图2是具有第一贮存器、第二贮存器和通道的整体式取样设备的示意图。图3是具有第一贮存器和可拆卸的抽吸式第二贮存器的双组件取样设备的示意图。图4是图2的整体式取样设备的示意图，其具有可重新密封的外部开口，该可重新密封的外部开口装备有封闭件，该封闭件具有延伸到通道中的凸起。图5是图2的整体式取样设备的示意图，其具有可重新密封的外部开口，该可重新密封的外部开口装备有封闭件，该封闭件具有不延伸到通道中的凸起。图6是图2的整体式取样设备的示意图，其具有通道，该通道居中于从第一贮存器的中心延伸至第二贮存器的中心的轴线上。图7是图2的整体式取样设备的示意图，其具有通道，该通道不居中于从第一贮存器的中心延伸至第二贮存器的中心的轴线上。图8是整体式取样设备的示意图，其具有第一贮存器、第二贮存器、元件和第二外部开口。该整体式取样设备示出为处于第一位置。
图9是图8的整体式取样设备的示意图；该整体式取样设备示出为处于第二位置。图10是图8的元件的侧视示意图。图11是具有第一贮存器、第二贮存器和柱塞的整体式取样设备的示意图。该柱塞定位于第二贮存器上方。图12是图11的整体式取样设备的示意图，该整体式取样设备具有延伸穿过第二贮存器的柱塞。
具体实施例方式虽然本文以具体的实施例来描述了本发明，但对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，可在不脱离本发明的精神的前提下进行各种修改、重组和替换。因此本发明的保护范围仅受本文所附权利要求书的限制。由端点表述的数值范围包括包含在该范围内的所有数值(例如，1至5包括1、 1. 5、2、2. 75,3,3. 8、4 和 5)。如本说明书和所附的权利要求书中所包括的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物，除非所述内容另外明确指出。因此，例如，对含有“(一种)化合物”的组合物的提及包括两种或更多种化合物的混合物。本说明书和所附权利要求书中使用的术语 “或”的含义通常包括“和/或”的含义，除非所述内容另外明确指出。除非另外指明，否则在所有的情况下，说明书以及权利要求书中所用的所有表示量或成分、性质的量度等等的数字都应理解为受词语“约”来修饰。因此，除非有相反的指示，否则在上述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本领域的技术人员利用本发明的教导寻求获得的期望性质而变。在最低程度上，每一个数值参数应当至少按照所记录的有效数位并通过应用惯常的四舍五入法来理解。虽然阐述本发明的广义范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实例中所列出的数值尽可能精确地记录。然而，任何数值都固有地包含由存在于各自试验测量中的标准偏差所必定引起的误差。本发明描述了用于从大体积样品浓集微生物的方法。提供了具有第一贮存器和第二贮存器的整体式取样设备，以用于混合浓集剂与含有微生物的样品，从而形成结合有微生物的组合物。还描述了双组件取样设备。浓集剂浓集样品中存在的微生物的至少一部分。 结合有微生物的组合物被收集在取样设备的第二贮存器中。提供了具有一体化(如单件构造)的第一贮存器和第二贮存器的整体式取样设备。相似地，本文所述的双组件取样设备指的是具有独立的第一贮存器和独立的第二贮存器(如可拆卸的第一和第二贮存器)的两组件设备。可以连接第一贮存器和第二贮存器以形成双组件取样设备。取样设备的第一贮存器的体积通常比第二贮存器的体积大。第二贮存器用于收集含有结合有微生物的组合物的较小体积样品。本文所述的取样设备使得可以迅速且有效地收集具有低微生物浓度的大体积样品。在一些实例中，这种取样设备可以被密封，可以被打开以容纳大体积样品，然后可以被再次密封以浓集样品中存在的微生物。浓集剂被添加到取样设备，以与样品混合并形成结合有微生物的组合物。这里所述的本申请的取样设备是紧凑的、便携的(如用在野外环境中)，并且是一次性的，从而消除了样品之间污染的可能性。
当前的技术例如膜过滤和离心被用来从大体积样品获得微生物的直接计数。然而，用于诸如水的样品的微生物分析的这些方法通常是费用高的多步骤工序，需要非常复杂的设备以及受过良好训练的人员。另外，膜过滤或离心技术的操作要求使得这些技术难以现场实施(如用在野外环境中)。对水样中的微生物计数的方法记载于(例如)美国公共卫生协会(American Public Health Association)、美国自来水工程协会(American Water Works Association)和水环境联合会(Water Environment Federation)的第 21 版的“水和废 /JC^^f/KillTj (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, SMEffff) ”。这类方法和水质量测试条例规定了测试100ml样品体积，这是不易于在野外环境中实施的。图1是通过本文所述的方法浓集微生物的过程流程图。如图1所示，含有微生物的大体积样品被添加到取样设备。大体积样品在取样设备中与浓集剂混合以形成结合有微生物的组合物。然后，将结合有微生物的组合物收集在第二贮存器中。在一些实施例中，可以在添加含有微生物的样品之前将浓集剂添加到取样设备。在一些实施例中，可以在添加含有微生物的样品之后将浓集剂添加到取样设备。在一些实施例中，取样设备可以包含浓集剂，以在野外应用中有效且便携地使用。在样品采集的地点，可以打开具有浓集剂的取样设备，以用于样品的递送和容纳。在已经通过混合浓集剂和样品而形成结合有微生物的组合物之后，结合有微生物的组合物可以被收集以用于进一步的分析。本文所述的取样设备中的每一个都提供第一贮存器和第二贮存器。第一贮存器被设计成容纳大体积样品，该样品具有足够的体积以用于混合样品和浓集剂，从而形成结合有微生物的组合物。例如，结合有微生物的组合物可以是可分散在样品中的，然后被从取样设备的第一贮存器收集至或转移至第二贮存器。第二贮存器的体积比第一贮存器�。员闳菽山岷嫌形⑸锏淖楹衔�。图2示出了整体式取样设备10。整体式取样设备10包括第一贮存器20、第二贮存器35、通道40和可重新密封的外部开口 30。邻近第一贮存器20的开口 25是任选的。第一贮存器20在交界部55处连接至第二贮存器35，从而提供整体式结构。第一贮存器20和第二贮存器35都具有体积。第一贮存器20具有第一体积60，第二贮存器35具有第二体积 45。通道40具有与第一贮存器20连通的第一开口 22和与第二贮存器35连通的第二开口 27。第一贮存器20在交界部55处接触第二贮存器35。在一些实施例中，含有至少一种微生物的样品可以经可重新密封的外部开口 30 被添加到图2的整体式取样设备10。浓集剂可以被添加到整体式取样设备10内的样品中， 或者浓集剂可以在添加样品之前存在于整体式取样设备10中。样品和浓集剂可以在处于竖立位置的整体式取样设备10的第一贮存器20中混合，使得第一贮存器20的整个体积空间在第一开口 22上方，从而得到结合有微生物的组合物。例如，结合有微生物的组合物可以从第一贮存器20通过通道40沉降到第二贮存器35中。整体式取样设备10可以被倒置， 使得第二贮存器基本上被定位在第一贮存器上方。结合有微生物的组合物的至少大部分能被收集在第二贮存器35的第二体积45中。整体式取样设备10使得可以将结合有微生物的组合物从第一贮存器20有效地转移至第二贮存器35。图3中示出了双组件取样设备300。双组件取样设备300包括第一贮存器320，该第一贮存器320基本上被定位在可拆卸的抽吸式第二贮存器340上方。第一贮存器320具有主体355、可重新密封的外部开口 315、第一端部325、第一体积310、和第一连接器330。 第一连接器330在相交部335处附接至可拆卸的抽吸式第二贮存器340。可拆卸的抽吸式第二贮存器340具有第二体积350和第二连接器345，该第二连接器345在相交部335处与第一贮存器320的第一连接器330接触。在一些实施例中，含有微生物的样品可在图3的可重新密封的外部开口 360处被添加至双组件取样设备300。浓集剂可以在添加样品之前或之后被添加至双组件取样设备 300。样品和浓集剂可以在第一贮存器320中混合，从而得到结合有微生物的组合物。在一些实施例中，结合有微生物的组合物可以通过重力作用行进通过主体355内的样品，例如到达第一贮存器320的第一端部325。第一贮存器320的第一连接器330可以在相交部335 处在第二连接器345处连接至可拆卸的抽吸式第二贮存器340。结合有微生物的组合物可以通过第一贮存器320的第一端部325的锥形从第一端部325被引导至可拆卸的抽吸式第二贮存器340。已知体积的结合有微生物的组合物可以被收集在可拆卸的抽吸式第二贮存器340中，以用于进一步的分析。图4示出了整体式取样设备400的一个实施例。第二贮存器435具有可重新密封的外部开口 450，该可重新密封的外部开口 450包括具有凸起465的封闭件430。当封闭件 430附接至可重新密封的外部开口 450时，凸起465通过通道440从第二开口 470延伸至第一开口 445。凸起465被选择用来防止在将整体式取样设备400倒置且将结合有微生物的组合物收集在第二贮存器435中之后结合有微生物的组合物再次进入第一贮存器480。在一些实施例中，凸起465可以在添加样品和/或浓集剂之前将第一贮存器480 与第二贮存器435分隔开。在一些实施例中，凸起465可以用来将第二贮存器435内的结合有微生物的组合物的至少一部分与第一贮存器480分隔开。凸起465可以减少或防止结合有微生物的组合物经通道440流过第一开口 445并流过整体式取样设备400的第二开口 470。图5示出了整体式取样设备500的一个实施例。第二贮存器535具有可重新密封的外部开口 550，该可重新密封的外部开口 550包括具有凸起565的封闭件530。当封闭件 530附接至可重新密封的外部开口 550时，凸起565从封闭件530延伸靠近第二开口 570， 而不延伸进入到通道540中。凸起565被选择用来在将整体式取样设备500倒置且将结合有微生物的组合物收集在第二贮存器535中之后至少部分地阻止结合有微生物的组合物再次进入第一贮存器580。在一些实施例中，凸起565可以将第一贮存器580与第二贮存器535部分地分隔开。在整体式取样设备500中混合浓集剂和含有微生物的样品后，可将整体式取样设备500 倒置，使得第二贮存器535基本上被定位在第一贮存器580上方。在倒置步骤过程中，封闭件530的凸起565可以将结合有微生物的组合物的至少一部分引导到第二贮存器535中以供收集。图6示出了整体式取样设备610的一个实施例。整体式取样设备610的通道620 包括第一开口 615和第二开口 625。通道620居中于从第一贮存器630的中心延伸至第二贮存器640的轴线605上。在一些实施例中，图6的整体式取样设备610的通道620可以使得结合有微生物的组合物在第一开口 615处从第一贮存器630通过通道620流动至第二贮存器640的第二开口 625。可将整体式取样设备610倒置，使得第二贮存器640被定位在第一贮存器630上方，从而结合有微生物的组合物的至少大部分可收集在第二贮存器640中。图7示出了整体式取样设备710的一个实施例。整体式取样设备710的通道740 包括第一开口 715和第二开口 725。通道740不居中于从第一贮存器725的中心延伸至第二贮存器735的轴线705上。在一些实施例中，图7的整体式取样设备710的通道740可以使得结合有微生物的组合物从第一贮存器725通过不居中于轴线705上(如偏离中心)的通道740流动。可将整体式取样设备710倒置，使得第二贮存器735被定位在第一贮存器725上方，从而结合有微生物的组合物的至少大部分可收集在第二贮存器735中。图8示出了整体式取样设备800。整体式取样设备800包括第一贮存器810、第二贮存器850、元件820和第二外部开口 880。第一贮存器810具有第一开口 860和至少一个可重新密封的外部开口 890。第二贮存器850具有第二开口 870。元件820包括壳体830 和位于壳体830内的可动部件840。可动部件840具有第一位置，在该第一位置，第一通道连接第一开口 860与第二开口 870，使得第二贮存器850与第一贮存器810成流体连通。第二贮存器850的内部位于可动部件840内，并且第二开口 870位于可动部件840的一部分的外部上。当整体式取样设备800处于竖立位置时，第一贮存器810位于元件820上方。在一些实施例中，整体式取样设备800的第二贮存器850可以具有用于容纳结合有微生物的组合物的至少一部分的第一位置。第二贮存器850通常具有固定的体积以收集结合有微生物的组合物。包含第二贮存器850的可动部件840可以进行旋转以选择第一贮存器810和第二贮存器850之间的位置。图9示出了整体式取样设备900，该整体式取样设备900包括第一贮存器910、第二贮存器950、元件920和第二外部开口 980。第一贮存器910具有第一开口 960和至少一个可重新密封的外部开口 990。第二贮存器950具有第二开口 970。元件920包括壳体930 和位于壳体930内的940。可动部件940具有第二位置，在该第二位置，第二通道将第二贮存器950连接到第二外部开口 980，使得第二开口 970与第二外部开口 980成流体连通。在一些实施例中，位于整体式取样设备900的可动部件940内的第二贮存器950 可以具有第二位置，使得保留在第二贮存器950内的固定体积的结合有微生物的组合物可以经第二通道被转移。在第二位置处的第二通道将第二贮存器950连接到第二外部开口 980，以将结合有微生物的组合物从第二贮存器950递送。图10示出了元件1020的侧视图。元件1020具有壳体1030和可动部件1040。 可动部件1040具有第一组件1070，用于将第二贮存器从第一位置移动至第二位置(未示出)。在一些实施例中，第一组件1070从可动部件1040突出，以能够到达可动部件1040。图11示出了整体式取样设备1100。整体式取样设备1100包括第一贮存器1110、 第二贮存器1120和柱塞1130。第一贮存器1110具有第一开口 1190、第一可重新密封的外部开口 1170和第一体积1115。第二贮存器1120具有第二外部开口 1140和第二体积1125。 柱塞1130具有密封件1160，该密封件1160位于柱塞1130邻近远端1155的部分上。密封件1160将第二贮存器1120的第二体积空间1125与第一贮存器1110的第一体积空间1115 分隔开。第二体积空间1125可以通过第二外部开口 1140从第二贮存器1120移出。当整体式取样设备1100处于竖立位置时，第一贮存器1110位于第二贮存器1120上方。在一些实施例中，整体式取样设备1100可以与基部或夹具一起使用，该基部或夹具用于将整体式取样设备1100支撑和/或定位在竖立位置。在一些实施例中，基部和/或夹具可以用来将整体式取样设备1100保持在固定位置。相似地，可以将基部或夹具从整体式取样设备1100除去以便携带。图12示出了整体式取样设备1200。整体式取样设备1200包括第一贮存器1210、 第二贮存器1220和柱塞1230。具有密封件1260的柱塞1230可以被移动以置换第二贮存器1220的第二体积1225。柱塞1230的远端1255可以延伸在第二贮存器1220和第二外部开口 1240下方。示于本发明的图2-12的取样设备可由多种材料形成。可用于形成取样设备的材料可包括，例如，玻璃、聚合物材料、复合材料等。这些设备也可由超过一种材料构造而成。 聚合物材料的一些例子包括聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸类树脂、聚苯乙烯、聚烯烃、高密度聚乙烯、高密度聚丙烯等。在一些实施例中，设备可由一种或多种制造方法(包括例如注模、 吹模)和通过其他制造技术形成。描述了适于与包含微生物的样品混合以提供结合有微生物的组合物的浓集剂。浓集剂通常为颗粒状或可分散于样品中，并浓集存在于大体积样品中的微生物。已发现这种浓集剂能有效捕集微生物。术语“浓集剂”通常指用于浓集存在于样品中的微生物总群体的材料。浓集剂的例子已描述于美国专利申请号60/912,711 ；60/977180 ；60/977, 171 ； 60/977，188 ；和美国专利申请公布号2007/(^69341中，其每一个以全文引用方式并入本文。在一些实施例中，可将使用浓集剂(例如捕集剂)进行的浓集或捕集选择为对微生物的任何特定株、种或型是非特异性的或特异性的，因此提供对样品中的微生物总群体的浓集。在一些实施例中，可使用任何已知检测方法，用株特异性探针或用株选择性培养基在经捕集的微生物群体中检测微生物的特定株。因此，浓集剂可用于，例如，检测临床样品、 食品样品、环境样品或其他样品中的微生物污染物或病原体(特别是水源性和食源性病原体，如细菌)。在进行本发明的方法时，浓集剂可以以任何适于样品接触和微生物捕集的方式使用(例如，以颗粒形式或施用至载体，所述载体如微流体设备的量油计(dipstick)、薄膜、 过滤器、管、孔(well)、板、小珠、膜或槽等)。优选地，浓集剂以颗粒形式使用，更优选地包括微粒(优选地，微粒的粒径为约1微米(更优选地，约2微米)至约100微米(更优选地， 约50微米；甚至更优选地，约25微米；最优选地，约15微米；其中范围的任何下限可与任何上限配对)。可用于进行本发明的方法的浓集剂包括颗粒浓集剂，其包括金属、金属氧化物微粒、金属硅酸盐、硅藻土、经表面改性的硅藻土、具有官能团的颗粒、生物分子、生物分子的片段、纳米粒子、及它们的组合。浓集剂的一些例子包括铁、二氧化硅、二氧化钛、氧化锆和其他可用于收集和浓集样品的浓集剂。在一些实施例中，Y-FeO(OH)(也称为纤铁矿)可用作浓集剂。已发现这种浓集剂比其他含铁浓集剂更有效地捕集革兰氏阴性细菌(革兰氏阴性细菌是在食源性和水源性疾病以及人类细菌感染方面最受关注的微生物)。浓集剂还可包括(除了Y-FeO(OH)之外)其他组分(例如，勃姆石(a-AW(OH))、粘土、氧化铁以及氧化硅)， 但优选地，当进行本发明的方法时，这类其他组分不显著干扰样品和浓集剂的紧密接触。 Y -FeO(OH)还可商购获得(例如，自 Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company, Ward Hill, MA，禾口自 Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, M0)。在进行本发明的方法时，浓集剂可以以颗粒形式使用，更优选地包括微粒(优选地，微粒的粒径(最大尺寸)为约3微米(更优选地，约5微米；最优选地，约10微米)至约100微米(更优选地，约80微米；甚至更优选地，约50微米；最优选地，约35微米；其中范围的任何下限可与任何上限配对)。优选地，所述颗粒是较小颗粒的附聚物。所述颗粒优选包括尺寸小于约1微米(优�。叽缧∮谠�0.5微米)的微晶。所述微晶可作为针状微晶存在，作为包含针状微晶的筏状结构存在，或作为针状微晶和筏状结构的组合存在。如通过BET (Brunauer-Emmett-Teller)方法(通过氮气分子的物理吸附来计算固体的表面积) 所测量，浓集剂优选具有大于约25平方米/克(m2/g)、更优选大于约50m2/g、且最优选大于约75m2/g的表面积。这种颗粒的优选附聚形式可提供微细颗粒体系的吸附能力，而又没有通常与微细颗粒相关的操作上的�：推渌：�。另外，这种附聚物颗�？扇菀自诹魈逯谐两担⒁虼丝墒刮⑸镉肓魈逑嗫焖俜掷�(如果用于过滤应用中的话还容许低反压)。在一些实施例中，金属硅酸盐可用作浓集剂。特别有用的金属硅酸盐的表面组成为金属原子与硅原子之比小于或等于约0.5，这由X-射线光电子谱(XPS)所测定。优选地， 表面组成也包含至少平均约10原子％的碳，这由X-射线光电子谱(XPS)所测定。XPS为这样的技术，其可测定样品表面最外侧大约3至10纳米(nm)的元素组成，并对元素周期表中除了氢和氦以外的所有元素敏感。XPS为定量技术，其对大多数元素的检测极限为0. 1至1 原子％浓度范围。优选的XPS表面组成评估条件可包括相对于接受立体角为士 10度的样品表面测得的90度的飞离角。当分散于或悬浮于水体系中时，金属硅酸盐可显示出材料和水体系pH所特有的表面电荷。材料-水界面上的电势称为电势”，其可由电泳迁移率(即材料颗粒在置于水体系中的带电电极之间移动的速率)计算得到。在进行本发明的方法时所用的浓集剂具有比例如常用金属硅酸盐(如普通滑石)更负的ζ电势。然而浓集剂比滑石更有效地浓集表面通常趋于带负电的微生物(诸如细菌)。优选地，浓集剂在约为7的pH下具有负的 ζ电势(更优选地，在约为7的pH下约-9mV至约-25mV范围内的Smoluchowski ζ电势； 甚至更优选地，在约为7的pH下约-IOmV至约-20mV范围内的Smoluchowski ζ电势；最优选地,在约为7的pH下约-IlmV至约-15mV范围内的Smoluchowski ζ电势)。可用的金属硅酸盐的例子包括金属的无定形硅酸盐，金属例如镁、钙、锌、铝、铁、 钛等(优选地，镁、锌、铁和钛；更优选地，镁)、及它们的组合。优选的是为至少部分熔融的颗粒形式的无定形金属硅酸盐(更优选地，无定形球化金属硅酸盐；最优选地，无定形球化硅酸镁)。金属硅酸盐是已知的，并可通过已知方法化学合成或通过天然存在的原矿的开采和加工获得。无定形的至少部分熔融的颗粒形式的金属硅酸盐，可通过熔化或软化相对较小的原料颗粒(例如，平均粒径至多约25微米)的任何已知方法，在用于制备通常椭圆形或球形颗粒(即，放大的二维图像通常为圆形且不具有锐角或边(包括真正或基本上圆形和椭圆形状和任何其他圆形或弯曲形状)的颗粒)的受控条件下制得。这种方法包括原子化、火焰抛光、直接熔融等。优选的方法为焰熔法，其中至少部分熔融的基本上玻璃态的颗粒是通过固体原料颗粒的直接熔融或火焰抛光而形成(例如，按美国专利号6，045，913 (Castle) 中所述的方法，其该专利的描述内容以引用方式并入本文)。最优选地，这种方法可用于通过将大部分不规则形状的原料颗粒(例如，约15至约99体积％ ；优选地，约50至约99体积％ ；更优选地，约75至约99体积％ ；最优选地，约90至约99体积％ )转化为通常椭球形或球形颗粒来制备无定形球化金属硅酸盐。一些无定形金属硅酸盐可商购。例如，无定形的球化硅酸镁可商购以用于化妆品配方(例如作为 3M Cosmetic Microspheres CM-Ill 得自 3M Company, St. Paul, MN)。在一些实施例中，无定形金属硅酸盐还可包含其他材料，包括金属(例如铁或钛) 的氧化物、结晶金属硅酸盐、其他结晶材料等，条件是浓集剂具有上述表面组成。然而，浓集剂优选基本上不含结晶二氧化硅。在一些实施例中，在其表面的至少一部分上具有表面处理剂的硅藻土用作浓集剂，该表面处理剂包含包括二氧化钛、微细纳米级金或钼或它们的组合的表面改性剂。因此，相比于未处理的硅藻土，包含某些类型的经表面处理或经表面改性的硅藻土(即，具有包含表面改性剂的表面处理剂，该表面改性剂包括二氧化钛、微细纳米级金或钼或它们的组合)的浓集剂能更有效地浓集微生物。所述表面处理剂优选还包含选自氧化铁、氧化锌、氧化铝等和它们的组合的金属氧化物(更优选地，氧化铁)。尽管已知贵金属如金显示抗微生物特性，但在本发明的方法中所用的含金浓集剂出乎意料地不仅有效地浓集微生物，还有效地让微生物保持为活的，以用于检测或测定的目的。有用的表面改性剂包括微细纳米级金；微细纳米级钼；与至少一种金属氧化物 (优选地，二氧化钛、氧化铁或它们的组合)组合的微细纳米级金；二氧化钛；与至少一种其他(即除了二氧化钛之外)的金属氧化物组合的二氧化钛；等，以及它们的组合。优选的表面改性剂包括微细纳米级金；微细纳米级钼；与至少氧化铁或二氧化钛组合的微细纳米级金；二氧化钛；与至少氧化铁组合的二氧化钛；以及它们的组合。更优选的表面改性剂包括微细纳米级金；微细纳米级钼；与氧化铁或二氧化钛组合的微细纳米级金；二氧化钛；与氧化铁组合的二氧化钛；及它们的组合(甚至更优选地， 微细纳米级金；与氧化铁或二氧化钛组合的微细纳米级金；与氧化铁组合的二氧化钛；以及它们的组合)。最优选的是微细纳米级金、与氧化铁或二氧化钛组合的微细纳米级金、及它们的组合。在一些实施例中，可用的浓集剂(例如可分散颗粒)可具有结合至这种颗粒的结合基团。颗粒的结合(例如官能)基团可具有对存在于样品中的特定微生物的特异性亲和力。在一些实施例中，结合基团具有可供连接存在于样品中的多个微生物的位点。在一些实施例中，颗粒具有磁性。颗�？衫缇哂写判孕�。含有这种浓集剂的结合有微生物的组合物可通过施加磁场(例如)以将组合物从取样设备的第一贮存器转移至第二贮存器来进行收集。在一些实施例中，生物分子(例如抗体)可通过用于形成浓集剂的多种方法中的任一种来共价结合至颗粒。例如，戊二醛、醛-席夫碱、η-羟基琥珀酰亚胺、吖内酯、溴化氰、 马来酸酐等可用作合适的连接化学剂。
生物分子结合基团可用各种容许结合至生物分子的化学基团进行官能化。这种基团通常由式A-L-B表示的生物分子结合化合物提供。生物分子结合基团B可为任何能够与任何所关注的生物分子反应并形成共价键(优选不可逆共价键)的有用官能团。许多这类基团是已知的且可用的。通常基团B将不同于基团A(表面键合基团)。在该表示式中，L 可为键或多种有机连接基中的任一种。有机连接基L可为直链的或带支链的亚烷基、亚芳基或亚烷基和亚芳基的组合，任选包含杂原子。对于某些实施例，L基团不包括含有二价环氧烷的低聚基团或聚合基团。对于某些实施例，若L基团的确包括能为纳米粒子提供屏蔽和/或水分散特性的含有二价环氧烷的低聚基团或聚合基团，则它们不是存在于纳米粒子上的唯一的屏蔽和/或水分散性基团。这种反应性基团B的非限制性例子包括选自如下的那些胺(特别是伯胺，尽管也可使用仲胺，其可为芳族的和/或脂族的)、胼、羟基(-0H)、砜、醛、醇(-0R)、环氧化物(如环氧乙烷)、卤化物(Cl，Br，I，F)、N-氧基琥珀酰亚胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、具有吸电子基团的α，β-烯键式不饱和或炔属不饱和基团(例如α，β-不饱和酮)、羧酸酯、酯、酐、碳酸酯、草酸酯、氮丙啶、环氧基团、N-取代的马来酰亚胺、吖内酯及它们的组合。这些连接有L连接基的B基团中的某些的例子示出如下，其中B基团包括醛基和羟基、卤化物、酯、胼(脂族或芳族)和N-氧基琥珀酰亚胺
权利要求
1.一种用于浓集微生物的方法，包括以下步骤提供整体式取样设备，所述整体式取样设备包括第一贮存器、第二贮存器和通道，所述通道具有与所述第一贮存器连通的第一开口和与所述第二贮存器连通的第二开口，其中流体能通过所述通道在所述两个贮存器之间流动，其中当所述设备处于竖立位置时，所述第一贮存器的整个体积空间都在所述第一开口上方，其中当所述设备处于任何位置时，并非所述第二贮存器的整个体积空间都在所述第二开口上方，并且其中至少所述第二贮存器具有至少一个可重新密封的外部开口；在所述整体式取样设备中混合浓集剂与含有微生物的样品，从而得到结合有微生物的组合物；和使所述整体式取样设备倒置，使得所述第二贮存器基本上被定位在所述第一贮存器上方，以从所述第二贮存器收集所述结合有微生物的组合物的大部分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤包括所述第一贮存器的整个体积与所述第二贮存器的整个体积之比在约10 1至约1000 1的范围。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤还包括所述第一贮存器具有可重新密封的外部开口。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤包括所述通道具有锥形几何形状。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤包括所述第二开口居中于从所述第一贮存器的中心延伸至所述第二贮存器的轴线上。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤包括所述第二开口不居中于从所述第一贮存器的中心延伸至所述第二贮存器的轴线上。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤还包括所述可重新密封的外部开口具有封闭件，所述封闭件包括凸起，所述凸起部分地封闭所述通道的第二开口。
8.—种整体式取样设备，包括第一贮存器，具有第一开口 ；第二贮存器，具有第二开口和至少一个可重新密封的外部开口 ；和通道，连接所述第一贮存器与所述第二贮存器，所述通道具有与所述第一贮存器连通的所述第一开口和与所述第二贮存器连通的所述第二开口，其中当所述整体式取样设备处于竖立位置时，所述第一贮存器的整个体积空间都在所述第一开口上方，其中当所述整体式取样设备处于任何位置时，并非所述第二贮存器的整个体积空间都在所述第二开口上方。
9.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述第一贮存器的整个体积与所述第二贮存器的整个体积之比等于或大于10 1。
10.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述第一贮存器的整个体积与所述第二贮存器的整个体积之比等于或大于100 1。
11.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述第一贮存器的整个体积与所述第二贮存器的整个体积之比等于或大于1000 1。
12.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述第一贮存器还包括可重新密封的外部开口。
13.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述通道具有锥形几何形状。
14.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述第二开口居中于从所述第一贮存器的中心延伸至所述第二贮存器的轴线上。
15.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述第二开口不居中于从所述第一贮存器的中心延伸至所述第二贮存器的轴线上。
16.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述可重新密封的外部开口还具有封闭件，所述封闭件包括凸起，所述凸起部分地封闭所述通道的第二开口。
17.根据权利要求8所述的整体式取样设备，还包括浓集剂，所述浓集剂选自具有亲和性配体的颗粒、不具有亲和性配体的颗粒、抗体或抗原结合片段、受体、及它们的组合。
18.根据权利要求8所述的整体式取样设备，还包括检测剂和生长培养基。
19.根据权利要求18所述的整体式取样设备，其中所述检测剂和所述生长培养基位于所述第二贮存器中。
20.根据权利要求8所述的整体式取样设备，还包括位于所述第二贮存器中的裂解剂。
21.根据权利要求8所述的整体式取样设备，其中所述第一开口还包括预过滤器。
22.一种用于浓集微生物的方法，包括以下步骤提供双组件取样设备，所述双组件取样设备包括第一贮存器，所述第一贮存器具有主体、可重新密封的外部开口和第一端部，所述第一端部成形为使得其在距离所述主体最远的部分处较窄，所述最远的部分具有第一连接器，所述第一连接器连接至具有第二连接器的可拆卸的抽吸式第二贮存器，所述第一贮存器基本上被定位在所述可拆卸的抽吸式第二贮存器上方，所述第一连接器能够附接至所述第二连接器，使得流体能在这两个贮存器之间流动；在所述取样设备中混合浓集剂与含有微生物的样品，从而得到结合有微生物的组合物；和将所述结合有微生物的组合物从所述第一贮存器的所述第一端部引导进入到所述可拆卸的抽吸式第二贮存器中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述提供步骤包括所述第一贮存器还具有第一体积，并且所述可拆卸的抽吸式第二贮存器还具有第二体积，其中所述第一体积与所述第二体积之比在约10 1至约1000 1的范围。
24.一种双组件取样设备，包括第一贮存器，具有主体、可重新密封的外部开口和第一端部，所述第一端部成形为使得其在距离所述主体最远的部分处最窄，所述最远的部分具有第一连接器；和可拆卸的抽吸式第二贮存器，具有第二连接器，其中所述第一连接器附接至所述第二连接器，使得流体能在所述第一贮存器和所述可拆卸的抽吸式第二贮存器之间流动。
25.根据权利要求M所述的双组件取样设备，其中所述第一贮存器还具有第一体积， 并且所述可拆卸的抽吸式第二贮存器还具有第二体积，其中所述第一体积与所述第二体积之比在约10 1至约1000 1的范围。
26.根据权利要求M所述的双组件取样设备，还包括浓集剂，所述浓集剂选自具有亲和性配体的颗粒、不具有亲和性配体的颗粒、抗体或抗原结合片段、受体、及它们的组合。
27.根据权利要求沈所述的双组件取样设备，其中所述浓集剂包括可分散性浓集剂。
28.根据权利要求沈所述的双组件取样设备，其中所述浓集剂包括Y-FeO(OH)。
29.根据权利要求沈所述的双组件取样设备，其中所述浓集剂包括金属硅酸盐。
30.根据权利要求沈所述的双组件取样设备，其中所述浓集剂包括硅藻土。
31.根据权利要求沈所述的双组件取样设备，其中所述浓集剂包括经表面处理的硅藻土，表面处理剂选自二氧化钛、纳米级金、纳米级钼及它们的组合。
32.根据权利要求M所述的双组件取样设备，其中所述取样设备还包括检测剂和生长培养基。
33.根据权利要求32所述的双组件取样设备，其中所述检测剂和所述生长培养基位于所述第二贮存器中。
34.根据权利要求M所述的双组件取样设备，还包括位于可拆卸的抽吸式第二贮存器中的裂解剂。
35.一种用于浓集微生物的方法，包括以下步骤提供整体式取样设备，所述整体式取样设备包括具有第一开口和至少一个可重新密封的外部开口的第一贮存器，具有第二开口的第二贮存器，包括壳体和位于所述壳体内的可动部件的元件，和第二外部开口，所述可动部件具有至少第一位置和第二位置，所述第二贮存器的内部位于所述可动部件内，并且所述第二开口位于所述可动部件的一部分的外部上，其中当所述整体式取样设备处于竖立位置时，所述第一贮存器位于所述元件上方，当所述整体式取样设备处于竖立位置时，所述第二外部开口位于所述元件下方，其中在所述第一位置处，第一通道连接所述第一贮存器与所述第二贮存器，使得所述第一开口与所述第二开口成流体连通，其中在所述第二位置处，第二通道连接所述第二贮存器与所述第二外部开口，使得所述第二开口与所述第二外部开口成流体连通；在所述整体式取样设备中混合浓集剂与含有微生物的样品，从而得到结合有微生物的组合物；和从第一位置到第二位置转移所述结合有微生物的组合物，使得所述第二外部开口与所述第二外部开口成流体连通。
36.一种整体式取样设备，包括第一贮存器，具有第一开口和至少一个可重新密封的外部开口 ；第二贮存器，具有第二开口 ；元件，包括i)壳体；和 )位于所述壳体内的可动部件，所述可动部件具有至少第一位置和第二位置，其中所述第二贮存器的内部位于所述可动部件内，并且所述第二开口位于所述可动部件的一部分的外部上，当所述整体式取样设备处于竖立位置时，所述第一贮存器位于所述元件上方；第二外部开口，当所述整体式取样设备处于竖立位置时，所述第二外部开口位于所述元件下方，其中在所述第一位置处，第一通道连接所述第一贮存器与所述第二贮存器，使得所述第一开口与所述第二开口成流体连通，其中在所述第二位置处，第二通道连接所述第二贮存器与所述第二外部开口，使得所述第二开口与所述第二外部开口成流体连通。
37.根据权利要求36所述的整体式取样设备，其中所述第一贮存器还具有第一体积， 并且所述第二贮存器还具有第二体积，其中所述第一体积与所述第二体积之比在约10 1至约1000 1的范围。
38.根据权利要求36所述的整体式取样设备，还包括浓集剂，所述浓集剂选自具有亲和性配体的颗粒、不具有亲和性配体的颗粒、抗体或抗原结合片段、受体、及它们的组合。
39.根据权利要求36所述的整体式取样设备，还包括检测剂和生长培养基。
40.根据权利要求39所述的整体式取样设备，其中所述检测剂和所述生长培养基位于所述第二贮存器中。
41.根据权利要求36所述的整体式取样设备，还包括位于所述第二贮存器中的裂解剂。
42.一种用于浓集微生物的方法，包括以下步骤提供整体式取样设备，所述整体式取样设备包括第一贮存器，所述第一贮存器具有第一开口、第一可重新密封的外部开口和第一体积空间；第二贮存器，所述第二贮存器具有第二开口、第二外部开口和第二体积空间；以及柱塞，所述柱塞具有密封件，所述密封件位于所述柱塞的邻近柱塞远端的部分上，所述密封件将所述第二贮存器的所述第二体积空间与所述第一贮存器的所述第一体积空间分隔开，所述第二体积空间通过所述第二外部开口移出，其中当所述取样设备处于竖立位置时，所述第一贮存器位于所述第二贮存器上方；在所述整体式取样设备中混合浓集剂与含有微生物的样品，从而得到结合有微生物的组合物；和用所述柱塞通过所述第二外部开口转移位于所述第二贮存器中的所述结合有微生物的组合物。
43.根据权利要求1、22、35或42中任一项所述的方法，其中所述混合步骤包括浓集剂， 所述浓集剂选自具有亲和性配体的颗粒、不具有亲和性配体的颗粒、抗体或抗原结合片段、 受体、及它们的组合。
44.根据权利要求1、22、35或42中任一项所述的方法，其中所述混合步骤还包括缓冲液。
45.根据权利要求1、22、35或42中任一项所述的方法，其中所述混合步骤还包括检测剂和生长培养基。
46.一种整体式取样设备，包括第一贮存器，具有第一开口、第一可重新密封的外部开口和第一体积空间； 第二贮存器，具有第二开口、第二外部开口和第二体积空间；和柱塞，所述柱塞具有密封件，所述密封件位于所述柱塞的邻近柱塞远端的部分上，所述密封件将所述第二贮存器的所述第二体积空间与所述第一贮存器的所述第一体积空间分隔开，所述第二体积空间通过所述第二外部开口移出，其中当所述整体式取样设备处于竖立位置时，所述第一贮存器位于所述第二贮存器上方。
47.根据权利要求46所述的取样设备，其中所述第一体积空间与所述第二体积空间之比在约10 1至约1000 1的范围。
48.根据权利要求46所述的整体式取样设备，还包括浓集剂，所述浓集剂选自具有亲和性配体的颗粒、不具有亲和性配体的颗粒、抗体或抗原结合片段、受体、及它们的组合。
49.根据权利要求17、38或48中任一项所述的整体式取样设备，其中所述浓集剂包括可分散性浓集剂。
50.根据权利要求17、38或48中任一项所述的整体式取样设备，其中所述浓集剂包括 Y -FeO(OH)。
51.根据权利要求17、38或48中任一项所述的整体式取样设备，其中所述浓集剂包括金属硅酸盐。
52.根据权利要求17、38或48中任一项所述的整体式取样设备，其中所述浓集剂包括硅藻土。
53.根据权利要求17、38或48中任一项所述的整体式取样设备，其中所述浓集剂包括经表面处理的硅藻土，表面处理剂选自二氧化钛、纳米级金、纳米级钼及它们的组合。
54.根据权利要求46所述的整体式取样设备，还包括检测剂和生长培养基。
55.根据权利要求M所述的整体式取样设备，其中所述检测剂和所述生长培养基位于所述第二贮存器中。
56.根据权利要求46所述的整体式取样设备，还包括位于所述第二贮存器中的裂解剂。
全文摘要
本发明描述了用取样设备中的浓集剂浓集微生物的方法以及本文所述的取样设备。更具体地讲，用取样设备中的浓集剂从大体积样品浓集微生物的方法在多种条件下可提供快速、低成本、简单(不涉及复杂的装置或程序)和/或有效的过程。
文档编号G01N1/40GK102326067SQ200980157416
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月30日 优先权日2008年12月31日
发明者尼尔·帕西, 库尔特·J·霍尔沃森, 曼基里·T·克希尔萨加尔, 詹姆斯·E·艾斯塔 申请人:3M创新有限公司
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