专利名称：双糖链蛋白聚糖在心力衰竭评估中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于评估个体中的心力衰竭的方法，其包含以下步骤a)测量得自个体的样品中标记双糖链蛋白聚糖(biglycan)的浓度，b)任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将步骤(a)中测定的浓度和任选地步骤(b)中测定的浓度与如在对照样品中确定的这种标记或这些标记的浓度比较来评估心力衰竭。还公开的是双糖链蛋白聚糖作为心力衰竭评估中的标记蛋白质的用途，包含双糖链蛋白聚糖的标记组合， 和用于测量双糖链蛋白聚糖的试剂盒。
背景技术：
心力衰竭(HF)是主要的且处于增长中的公共健康问题。在美国例如约5百万个患者患有HF，并且超过550000个患者每年首次诊断患有HF (见American Heart Association, Heart Disease and Stroke Statistics :2008 Update, Dallas, Texas, American Heart Association (2008))。类似地，美国统计学显示HF是每年一千两百万-一千五百万次诊室就医和六百五十万住院天数的主因。从1990年到1999年，对于作为初步诊断为HF的每年住院治疗数目已从约810 000增加到超过一百万，并且对于作为初步或次要诊断为HF的每年住院治疗数目从两百四十万增加到三百六十万。在2001年，近53000 个患者死于作为主因的HF。心力衰竭主要是老人中的病状，并且因此广泛公认的“人口老龄化”也促成增加的HF发病率。HF发病率在65岁以后的人口中接近每1000人中有10人。 仅在美国，在2005年关于HF总体估计的直接和间接花费是约$279亿，并且每年约四亿美元花费在用于治疗HF的药物上(参照上文引用的AHA统计学)。
心力衰竭心力衰竭的特征在于心脏泵抽与机体需要一样多的血液的能力中的丧失。衰竭不意味着心脏已停止泵抽，而是它未能如它应该那样有效地泵抽血液。
NYHA[纽约心脏学会(New York Heart Association)]和 ACC/AHA[美国心脏病学会(American Association of Cardiology) / 美国心脏学会(American Heart Association)]都已确定了 HF的功能类别以估计疾病的发展。NYHA分类方案具有疾病状态的4个类别类别1是在任何劳顿感水平下无症状。类别2是重劳顿感下有症状，并且类别III和IV分别是在轻和无劳顿感下有症状。
在4阶段ACC/AHA方案中，阶段A是无症状的但处于发生HF的危险中。阶段B存在无症状的心功能障碍证据。在阶段C中存在具有症状的心功能障碍证据。在阶段D中， 尽管最大限度治疗，受试者仍具有HF症状。
HF的病因学在医学上，心力衰竭必须被理解为复杂疾病。它可能由触发事件例如心肌梗塞(心脏病发作)的发生引起，或可能是其他原因例如高血压、糖尿病或心畸形例如心瓣膜病继发的。 心肌梗塞或HF的其他原因导致心脏泵抽能力中的最初减退，例如通过损害心肌。由于一种或多种代偿机制的激活，泵抽能力中的这种减退可能不是立即引人注意的。然而，已发现HF的发展不依赖于患者的血液动力学状态。因此，即使当患者保持无症状时，由疾病引起的损害改变也存在且正在进行。事实上，在HF早期阶段过程中维持正常心血管功能的代偿机制可能实际上促成最后疾病的发展，例如通过对心脏施加有害作用，及其维持循环中的足够水平血流的能力。
在HF中发生的某些更重要的病理生理性改变是(i)下丘脑-垂体-肾上腺轴激活，(i i )全身性内皮功能障碍和(i i i )心肌重塑。
(i)特异性针对抵抗下丘脑-垂体-肾上腺轴激活的治疗包括β肾上腺素能阻滞剂(B-阻滞剂)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、特定钙通道阻滞剂、硝酸盐和内皮缩血管肽-1阻滞试剂。钙通道阻滞剂和稀释剂虽然产生临床改善，但仍未明确显示延长存活，而 B-阻滞剂和ACE抑制剂已显示显著延长生命，如醛固酮拮抗剂一样。使用内皮缩血管肽-1 阻滞试剂的实验性研究已显示有利效应。
(ii)全身性内皮功能障碍是充分公认的HF特点，并且明确呈现左心室功能障碍的时间征兆。内皮功能障碍就暗示心肌微循环与心肌细胞的关系而言是重要的。证据暗示微血管功能障碍显著促成肌细胞功能障碍和导致进行性心力衰竭的形态学改变。
就潜在病理生理学而言，证据暗示内皮功能障碍可能由NO的相对缺乏引起，这可能通过NADH依赖性氧化酶促成血管&形成中的增加和NO的后续过量清除。&生产增加的潜在促成因素包括增加的交感紧张、去甲肾上腺素、血管紧张素II、内皮缩血管肽-1和 TNF-α。此外，关键抗炎细胞因子IL-10的水平相对于TNF-α水平不适当地低。目前认为通过引起心肌收缩力减少、两心室扩张和低血压，升高水平的TNF-α连同相关的促炎细胞因子包括IL-6和可溶性TNF-α受体在HF进化中起重要作用，并且可能涉及内皮激活和功能障碍。还认为TNF-α可能在严重HF患者中发生的迄今未解释的肌肉消瘦中起作用。在用可溶性TNF受体治疗的少数患者中的初步研究已指出NYHA功能分类和患者健康中的改善，如通过生活质量指数测量的。
(iii)心肌重塑是伴随从无症状到有症状心力衰竭的过渡的复杂过程，并且可以描述为在心肌内的一系列适应性改变，如心室形状、质量和容量中的变化(Piano，M.R.等人，J. Cardiovasc. Nurs. 14 (2000) 1-23 ；Molkentin, J. D. , Ann. Rev. Physiol. 63 (2001) 391-426)。心肌重塑的主要组分是肌细胞生物学中的变化，如肌细胞肥大、通过坏死或凋亡的肌细胞丧失、细胞外基质中的变化和左心室腔几何学中的变化。不了解心肌重塑仅仅是暴露于长期神经激素刺激的毒性作用数年后发生的终末器官应答，还是心肌重塑独立地促成心力衰竭的发展。迄今为止的证据暗示合适疗法可以减慢或停止心肌重塑的发展。
标记和疾病状态如上所述，肌细胞肥大可能代表朝向HF道路的最早步骤之一。肌细胞肥大的特征在于编码收缩蛋白质和某些非收缩蛋白质的某些基因的表达增加、细胞大小增加和细胞骨架变化，所述收缩蛋白质例如P-肌球蛋白重链和肌钙蛋白T (TnT)，所述非收缩蛋白质例如A 型和 B 型利钠肽(Piano，Μ. R.等人，J. Cardiovasc. Nurs. 14 (2000) 1-23 ；Molkentin, J. D. , Ann. Rev. Physiol. 63 (2001) 391-426)。
心力衰竭的人和动物模型研究暗示在心力衰竭的稍后阶段中降低的肌细胞功能。 成为肌细胞功能障碍基础的机制已暗示涉及钙处理网络、肌丝和细胞骨架中的变化(deTombe, P. P. , Cardiovasc. Res. 37 (1998) 367-380)。例如，在心力衰竭的人和动物模型中，肌质网钙-ATP酶酶活性减少，而肌浆Na+/Ca2+交换器的mRNA和蛋白质水平增加。此外，在心力衰竭的人和动物模型中存在TnT的同种型转换，肌钙蛋白I(TnI)的磷酸化减少， 肌纤维肌动球蛋白ATP酶活性减少和微管形成增强。
最初导致心肌重塑的关于心脏的改变意味着补偿心肌的患病部分，以便维持机体对于氧和营养素的需求。然而，心力衰竭的代偿期是有限的，并且最终失败的心脏无法维持满足机体需要足够的心输出量。因此，存在从代偿期到失代偿期的过渡。在失代偿期中，心脏中的改变级联继续，但不再是有利的，使患者从心力衰竭的发展朝向慢性状态和最后死亡移动。
|[|ig"ACC/AHA 2005 Guideline Update for the Diagnosis and Management of Chronic Heart Failure in the Adult，，(S. Hunt 等人，www, acc. orR = ACC/AHA 实践指导)，在心力衰竭领域中的疾病连续体目前分组为如上所述的4个阶段。在阶段A和B中， 发现处于发生心力衰竭的危险中的个体，而阶段C和D代表显示心力衰竭体征和症状的患者群。如上文参考文献中给出的关于限定不同阶段A到D的细节在此包括作为参考。
心力衰竭中的诊断方法具有HF的患者评估中的单个最有用的诊断测试是与多普勒流动研究偶联的综合二维超声心动图，以测定是否存在心肌、心脏瓣膜或心包异常，并且涉及哪个室。必须解决3个基本问题1) LVEF是被保存还是减少，2) LV结构是正常还是异常，和3)是否存在可以解释临床表现的其他结构异常，例如瓣膜、心包或右心室异常？这个信息应该用下述进行定量EF的数字估计值、心室尺度和/或容量测量、壁厚度测量、以及室几何学和局部壁活动评估。应评估右心室大小和心脏收缩性能。还应半定量测定房大�。⑶也饬孔蠓砍叨群� /或容量。
在超声心动图时获得的非侵袭性血液动力学数据是关于患者具有保存或减少EF 的重要附加联系。二尖瓣流入模式、肺静脉流入模式和二尖瓣环速度的组合定量提供了关于LV充填和左心房压力的特征的数据。与下腔静脉尺度及其在呼吸过程中的应答测量偶联的三尖瓣回流梯度评估提供了心脏收缩肺动脉压和中心静脉压的估计值。
每搏输出量可能用在LV流出道中的组合尺度测量和脉冲多普勒进行测定。然而， 异�？赡茉诓淮嬖贖F的情况下在这些参数中的任何中出现。这些必然无一与HF特异性关联；然而，总体正常充填模式反对临床HF。
从临床观点来看，该疾病在代偿和早期失代偿期中是临床上无症状的(阶段A中的完全无症状和阶段B中患有结构心脏病但无HF体征和症状，参照ACC/AHA实践指导)。该疾病的外部体征(例如呼吸短促)直到充分进入失代偿期后才出现(即，根据ACC/AHA实践指导的阶段C和D)。目前诊断基于患者在阶段C和D中的外部症状。
一般地具有心力衰竭的患者接受用药物的标准治疗，所述药物与涉及心力衰竭的特定机制相互作用。不存在反映这些特定机制可靠且帮助医生选择正确药物(和剂量)用于正确患者(例如ACE抑制剂、AT II、β -阻滞剂等)的诊断测试。
HF用标记的先前诊断处于心力衰竭的危险中的患者早期评估看起来仅可能通过生物化学标记，因为在那个阶段处于发生心力衰竭的危险中的个体仍缺乏临床HF症状。不存在目前可用于该疾病的可靠症状前评估的确定生物化学标记。在目前确定的HF诊断时，该疾病已在充分进行中。
利钠肽家族特别是心房利钠肽家族和脑利钠肽家族近年来已证明在HF评估中具有重要价值。
HF预后和需要至少部分由于后期诊断，50%具有HF的患者在诊断2年内死亡。5年存活率小于30%。 存在帮助早期诊断心力衰竭的新生物化学标记的明显需要。
处于心力衰竭的危险中的个体，即对于心力衰竭临床上无症状的个体早期评估中的改善是有正当理由的。
近年来已确定B性利钠肽标记代表监控具有HF患者中的疾病发展，且评估其心血管并发症如心脏病发作危险的极佳工具。
然而，如对于许多其他诊断领域，单个标记是不足够的。
虽然低NT-proBNP值对于排除HF或LVD具有极高的负面预测价值，但在上述和其他研究中对于心力衰竭的正面预测价值(参照iTri印els R. H.等人，Clin. Chem. 49， Supp 1. A(2003)37-38)已发现在50-60%范围内。因此，其自身例如具有高，或与NT-proBNP 组合，并且与单独的NT-proBNP比较，具有改善的HF正面预测价值的，在评估处于心力衰竭的危险中的个体中有用的标记具有高临床/实践重要性。
帮助具有心力衰竭患者评估的标记也具有高重要性，以达到这个临床上非常重要且苛求的诊断领域中的进一步技术发展。
发明概述目前已发现且确定标记双糖链蛋白聚糖可以帮助评估心力衰竭。在一个实施方案中， 它可以帮助评估个体是否处于发生心力衰竭的危险中。在一个进一步的方面，它可以帮助评估疾病发展。在另一个实施方案中，它可以帮助预测心力衰竭的发作。在另一个实施方案中，它可以帮助评估且选择合适的治疗方案，以预防或治疗心力衰竭。
本文公开的是用于评估个体中的心力衰竭的方法，其包括以下步骤测量得自个体的样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将双糖链蛋白聚糖浓度和任选地一种或多种其他标记的浓度与如在对照样品中确定的这种标记或这些标记的浓度比较来评估心力衰竭。
本发明还涉及蛋白质双糖链蛋白聚糖作为心力衰竭评估中的标记分子的用途。
进一步公开的是包含双糖链蛋白聚糖和一种或多种其他心力衰竭标记的标记组合在心力衰竭评估中的用途。
还提供的是用于进行用于在体外评估心力衰竭的方法的试剂盒，所述方法包括以下步骤测量样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将双糖链蛋白聚糖浓度和任选地一种或多种其他标记的浓度与如在参考群体中确定的这种标记或这些标记的浓度比较来评估心力衰竭，所述试剂盒包含特异性测量双糖链蛋白聚糖和任选地一种或多种其他心力衰竭标记所需的试剂。
本发明的另外方面和优点从以下描述中将是显而易见的。然而，应当理解详述和具体实施例虽然指出本发明的优选实施方案，但仅通过示例性方式给出，因为根据这种详述，在本发明精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。
发明内容
在第一个实施方案中，本发明涉及用于评估个体中的心力衰竭的方法，其包括以下步骤a)测量得自个体的样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，b)任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和c)通过将步骤(a)中测定的浓度和任选地步骤(b)中测定的浓度与如在对照样品中确定的这种标记或这些标记的浓度比较来评估心力衰竭。
如本文使用的，下述术语各自具有在这个部分中与之相关的含义。
冠词“一”(“a”和“an”)在本文中用于指一个或超过一个(即，至少一个)冠词的语法目标。例如，“一种抗体”意指一种抗体或超过一种抗体。
表达“一个或多个”指示1 - 50，优选 1 - 20，还优选 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12
或15。
如本文使用的，术语“标记”或“生物化学标记”指用作靶的分子，所述靶用于分析患者的测试样品。在一个实施方案中，此类分子靶的实例是蛋白质或多肽。在本发明中用作标记的蛋白质或多肽被认为包括所述蛋白质天然存在的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选包含所述标记肽的至少6、7、8、10、12、15或20个邻接氨基酸。本领域技术人员应当理解由细胞释放的或存在于细胞外基质中的蛋白质可能例如在炎症过程中被损坏，并且可能变得被降解或切割成此类片段。某些标记以无活性形式合成， 这可以随后通过蛋白酶解进行活化。如技术人员应当理解的，蛋白质或其片段还可以作为复合物的部分存在。此类复合物也可以用作本发明含义中的标记。此外或可替代地，标记多肽可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的实例尤其是糖基化、酰化和/或磷酸化。
术语“评估心力衰竭”用于指示根据本发明的方法将帮助医生评估个体是否处于发生心力衰竭的危险中，或帮助医生在HF诊断相关性的一个或多个其他领域中评估HF患者。评估患有HF个体的诊断相关性的优选领域是心力衰竭的分期，急性和慢性心力衰竭的鉴别诊断，判断疾病发展的危险，用于选择合适药物的指导，监控对于治疗的应答和HF患者的随访。
“心力衰竭的标记”在本发明的含义中是这样的标记，其如果与标记双糖链蛋白聚糖组合，则增加HF评估中对于研究中的诊断问题的相关信息。信息被视为相关的或具有附加价值，如果在给定特异性下，用于HF评估的灵敏度，或分别地如果在给定灵敏度下，用于 HF评估的特异性，可以通过将所述标记包括到已包含标记双糖链蛋白聚糖的标记组合内得到改善。优选地，分别地灵敏度或特异性中的改善在P = 0.05、0.02、0.01或更低的显著性水平下是统计上显著的。优选地，一种或多种其他心力衰竭标记选自利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。
如本文使用的，术语“样品”指为了在体外评估而获得的生物学样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选可以包含任何体液。优选测试样品包括血液、血清、血浆、尿、 唾液和滑液。优选样品是全血、血清、血浆或滑液，其中血浆或血清代表最方便类型的样品。 如技术人员应当理解的，任何此类评估都在体外进行。患者样品之后被弃去。患者样品单独用于本发明的体外方法中，并且患者样品的材料不转移回患者体内。一般地，样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。
表达“将浓度……与如对照样品中确定的浓度比较”仅用于进一步举例说明无论如何对于技术人员显而易见的那种。对照样品可以是内部或外部对照样品。在一个实施方案中，使用内部对照样品，即在测试样品中以及在得自相同受试者的一种或多种其他样品中评估标记水平，以测定在所述标记的水平中是否存在任何改变。在另一个实施方案中，使用外部对照样品。对于外部对照样品，源自个体的样品中标记的存在或量与其在已知患有给定病状或已知处于给定病状的危险中的个体；或已知无给定病状的个体，即“正常个体” 中的存在或量比较。例如，患者样品中的标记水平可以与已知与HF中的特定病程相关的水平比较。通常样品的标记水平与诊断直接或间接相关，并且标记水平例如用于测定个体是否处于HF的危险中。可替代地，患者的标记水平可以例如与已知与下述相关的标记水平比较HF患者中对于治疗的应答，急性和慢性心力衰竭的鉴别诊断，用于选择合适药物以治疗HF的指导，判断疾病发展的危险或HF患者的随访中。依赖于预期诊断用途，选择合适的对照样品并且在其中确定用于标记的对照或参考值。本领域技术人员应当理解此类对照样品在一个实施方案中得自年龄匹配且没有混杂疾病的参考群体。如同样对于技术人员清楚的，对照样品中确定的绝对标记值将依赖于所使用的测定。优选地来自合适参考群体的100 个充分表征的个体的样品用于确定对照(参考)值。还优选的是参考群体可以选自20、30、 50,200,500或1000个个体。健康个体代表用于确定对照值的优选参考群体。
双糖链蛋白聚糖双糖链蛋白聚糖是由具有约40 kD分子量的核心蛋白质组成的小分泌蛋白聚糖，其由 2条糖胺聚糖链取代。双糖链蛋白聚糖的其他名称是BGN、DSPG1、PG-I、PG-S1、蛋白聚糖-I、 SLRP1A、双聚糖蛋白聚糖(biglycan proteoglycan)、骨/软骨蛋白聚糖-I、硫酸皮肤素蛋白聚糖I、富含亮氨酸的小蛋白质1A。人双糖链蛋白聚糖多肽作为368个氨基酸(参照SEQ ID N0:1)的前原肽(pre-prop印tide)(=前体多肽)形成。氨基酸1 _ 19代表信号肽。 成熟双糖链蛋白聚糖蛋白质由SEQ ID NO: 1的氨基酸38-368组成，因为氨基酸1_37在前原肽的加工过程中被切割掉。
双糖链蛋白聚糖是富含亮氨酸的小蛋白聚糖(SLRP)家族成员，其特征在于重复的富含亮氨酸的氨基酸基序的存在(Fisher，L. W.等人，J. Biol. Chem. 264 (1989) 4571-4576)。双糖链蛋白聚糖和饰胶蛋白聚糖(decorin)被认为是基因复制的结果。饰胶蛋白聚糖含有一条附着的糖胺聚糖链，而双糖链蛋白聚糖含有两条链。为此，后一种蛋白质被称为双糖链蛋白聚糖。
双糖链蛋白聚糖已在几乎每一种人组织中发现，但在器官内不是均勻分布的。它的表达模式在不同病理学条件下改变。尽管关于双糖链蛋白聚糖的生物学作用的数据量越来越多，但它的许多生物学功能大多数可能仍是不清楚的。
双糖链蛋白聚糖是细胞外基质的多功能组分。它与多种其他蛋白质包括生长因子 (TGF-β、TNF-α )和细胞外基质蛋白质(胶原-I和V、纤连蛋白、营养不良聚糖和II型的磷脂酶Α2)结合。这些不同结合活性可以解释双糖链蛋白聚糖在许多组织中发挥不同功能的能力。它通过与胶原纤维结合且转移生长因子参与结缔组织代谢。双糖链蛋白聚糖还被描述为在神经元存活中起作用。双糖链蛋白聚糖还在骨骼骨生长/重塑中起作用。双糖链蛋白聚糖缺陷小鼠显示发生成骨质疏松症样表型(Xu，T.等人，Nat. Genet. 20 (1998) 78 - 82)。双糖链蛋白聚糖是关于Happle综合征的候选基因。双糖链蛋白聚糖显示在先兆子痫中是上调的(Gogiel, T.等人，European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology 134 (2007)51—56)。
双糖链蛋白聚糖还已被描述为在肿瘤学中具有作用/功能。几个申请通过双糖链蛋白聚糖mRNA或双糖链蛋白聚糖在蛋白质水平上的差异表达进行肿瘤诊断。JP 2008072952通过几种候选标记基因的肝内胆管上皮癌(ICC)进行鉴别诊断，所述候选标记基因其中之一编码双糖链蛋白聚糖。US 2006/0210975描述了众多基因应对于新血管发生诊断有用，所述众多基因其中之一是双糖链蛋白聚糖。WO 2001/036674涉及通过检测在前列腺癌中具有异常表达水平的26种基因中的一种或多种来检测人前列腺病症例如癌症， 所述26种基因其中之一是双糖链蛋白聚糖。
双糖链蛋白聚糖可能在动脉粥样硬化中起作用(Fedarko，N. S.等人，J. Biol. Chem. 265(1990)12200-12209 ；Klezovitch,0.禾口 Scanu，Α· Μ·，Trends Cardiovasc. Med. 11 (2001)沈3力68)。在动脉血管中，平滑肌细胞合成双糖链蛋白聚糖。血管中动脉粥样斑块的形成与双糖链蛋白聚糖表达的增加相关(Riessen，R.等人，Am. J. Pathol. 144 (1994) 962 -974)。与动脉粥样斑块相关的因子也已显示引起双糖链蛋白聚糖表达的增加 (Chang, Μ. Y.等人，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23 (2003) 809-815)。
还显示双糖链蛋白聚糖的表达通过炎性介质一氧化氮(NO)下调(Schaefer，L. 等人，J. Biol. Chem. 278 (2003) 26227-26237)。
在实验性诱导的大鼠心力衰竭中报道了数百种基因的上调，其中有是双糖链蛋白聚糖 mRNA (Ahmed,M. S.等人，Cardiovascular Research 60 (2003)557-568)。人双糖链蛋白聚糖蛋白质在转基因小鼠中的过表达导致通过蛋白组学分析的心脏基因表达中的几个改变(Bereczki，E.等人，J. Proteome Research 6 (2007) 854-861)。
WO 2008/084268涉及双糖链蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖活性增强剂的治疗用途 (抗动脉粥样硬化和抗缺血效应)及其在用于预防和治疗动脉粥样硬化和缺血性(例如心脏) 疾病中的用途。US 2003/0032591提供了通过使用双糖链蛋白聚糖作为药物中的活性成分， 用于预防或减少�：坌纬傻姆椒�。EP 0 686 397请求保护双糖链蛋白聚糖在神经细胞再生中的治疗效应。
应当理解在现有技术中蛋白质双糖链蛋白聚糖在体液中的存在或水平并未已知也未暗示在心力衰竭评估中具有诊断效用。
本发明的发明人目前已发现且可以确定如从源自个体的体液样品中测量的关于双糖链蛋白聚糖的增加值是关于心力衰竭的指示。
如在对照组或对照群体中测量的关于双糖链蛋白聚糖的值用于例如确定截断值或参考范围。超过此类截断值或在参考范围及其较高末端外的值被视为升高的。
在一个实施方案中，确定固定的截断值。选择此类截断值以匹配目的诊断问题。
在一个实施方案中，如在对照组或对照群体中测量的关于双糖链蛋白聚糖的值用于确定参考范围。在一个优选实施方案中，如果测量的值超过参考范围的90 %百分位数，双糖链蛋白聚糖浓度被视为升高的。在进一步优选的实施方案中，如果测量的值超过参考范围的95%百分位数、96%百分位数、97%百分位数或97. 5%百分位数，双糖链蛋白聚糖浓度被视为升高的。
在一个实施方案中，对照样品将是内部对照样品。在这个实施方案中，从研究中的个体中获得系列样品，并且比较标记水平。这可以例如用于评估治疗功效。
根据本发明的方法是基于得自个体的液体样品和此类样品中双糖链蛋白聚糖的测量。如本文使用的，“个体”指单个人或非人生物。因此，本文描述的方法和组合物可应用于人和兽医学疾病。优选地个体是人类。
优选地标记双糖链蛋白聚糖通过使用特异性结合剂从液体样品中特异性测量。
特异性结合剂是例如双糖链蛋白聚糖的受体、与双糖链蛋白聚糖结合的凝集素或针对双糖链蛋白聚糖的抗体。特异性结合剂对于其相应靶分子具有IO7 1/mol的亲和力。特异性结合剂对于其相应靶分子优选地具有IO8 1/mol或更加优选IO9 1/mol的亲和力。如技术人员应当理解的，术语特异性用于指出样品中存在的其他生物分子不与对双糖链蛋白聚糖具有特异性的结合剂显著结合。优选地，与除靶分子外的生物分子的结合水平导致这样的结合亲和力，其仅为与靶分子的亲和力的10%或更少、更优选仅5%或更少。优选的特异性结合剂将满足关于亲和力以及关于特异性的上述最低限度标准。
特异性结合剂优选地是与双糖链蛋白聚糖具有反应性的抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体的结合结构域的遗传构建体。
可以使用保留特异性结合剂的上述标准的任何抗体片段。抗体通过现有技术操作生成，例如，如 Tijssen 中所述的(Ti jssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays, Elsevier Science Publishers B. V. , Amsterdam (1990)，全书，特别是第 43-78页)。此外，技术人员充分了解基于免疫吸附剂的方法，所述免疫吸附剂可以用于抗体的特异性分离。通过这些方法，可以增强多克隆抗体的品质且从而增强其在免疫测定中的性能(Ti jssen，P.，同上，第 108-115 页)。
对于如本发明中公开的成果，可以使用在山羊中产生的多克隆抗体。然而，明显地还可以使用来自不同物种例如大鼠、兔或豚鼠的多克隆抗体，以及单克隆抗体。因为单克隆抗体可以以具有恒定性质的所需任何量产生，所以它们代表在用于临床常规的测定开发中的理想工具。
在根据本发明的方法中针对双糖链蛋白聚糖的单克隆抗体的生成和使用分别地代表另外其他优选的实施方案。
从天然来源中纯化双糖链蛋白聚糖并不容易。双糖链蛋白聚糖的重组生产是获得更高量的双糖链蛋白聚糖的选择方法。在一个优选实施方案中，双糖链蛋白聚糖使用真核表达系统通过重组表达产生。真核表达系统的实例是杆状病毒表达、在酵母中表达和在哺乳动物表达系统中表达。在一个优选实施方案中，双糖链蛋白聚糖的表达将在哺乳动物表达系统中进行。哺乳动物表达系统的实例是CHO细胞、HEK细胞、骨髓瘤细胞等。在一个进一步优选的实施方案中，重组生产的双糖链蛋白聚糖用作针对双糖链蛋白聚糖的多或单克隆抗体生产中的抗原。还可以优选通过在双糖链蛋白聚糖免疫吸附剂上的免疫吸附来纯化多克隆抗体，利用如本文上述的重组生产的双糖链蛋白聚糖。
如技术人员目前应当理解的，双糖链蛋白聚糖已鉴定为在HF评估中有用的标记， 可替代方法可以用于达到与本发明的成果可比较的结果。例如，可以使用生成抗体的可替代策略。此类策略尤其包含使用合成或重组肽，其代表用于免疫接种的临床上相关的双糖链蛋白聚糖表位。可替代地，可以使用也称为DNA疫苗接种的DNA免疫接种。
为了测量，将得自个体的液体样品与双糖链蛋白聚糖的特异性结合剂在适合于形成结合剂双糖链蛋白聚糖复合物的条件下进行温育。此类条件无需指定，因为技术人员无需任何创造性努力即可容易地鉴定此类合适的温育条件。测量结合剂双糖链蛋白聚糖复合物的量且用于HF评估。如技术人员应当理解的，存在测量特异性结合剂双糖链蛋白聚糖复合物的量的众多方法，其全部在相关教科书中详细描述(参照例如Tijssen P.，同上， 或 Diamandis, E. P.和 Christopoulos, T. K.(编)，Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))。
优选地，双糖链蛋白聚糖在夹心型测定形式中进行检测。在此类测定中，第一种特异性结合剂在一侧上用于捕获双糖链蛋白聚糖，并且第二种特异性结合剂在另一侧上使用，所述第二种特异性结合剂被标记以使其可被直接或间接检测。优选地，针对双糖链蛋白聚糖的抗体用于定性(双糖链蛋白聚糖存在或不存在)或定量(测定双糖链蛋白聚糖的量) 免疫测定中。
如实施例部分中详细描述的，两种小鼠模型已用于通过先进的微阵列和蛋白组学方法鉴定在实验动物的心脏组织中发现的mRNA和多肽。然而，这些模型的确获得至少部分矛盾的数据，并且当然关于mRNA或分别的多肽的组织数据不代表这些多肽在循环中的存在或不存在。发现在一种模型中差异表达的标记可能在第二种模型中并非差异表达，或甚至在再进一步的模型中显示矛盾数据。差异表达的mRNA可能发现与循环中分别多肽的增强水平无关。即使蛋白质可能在组织中差异表达，但在大多数情况下如果从体液中测量，那么这种蛋白质没有任何诊断相关性，因为它可能不被释放到循环中，可能例如在从细胞或组织释放后变成被片段化或被修饰，在循环中可能不稳定，在循环中可能无法测量，可能对于给定疾病不是特异性的等等。
本发明的发明人令人惊讶地能够检测体液样品中的蛋白质双糖链蛋白聚糖。更加令人惊讶的是，他们能够证实双糖链蛋白聚糖在得自个体的此类样品中的存在可以与HF 相关。不需要组织和活组织检查样品，以在HF评估中利用标记双糖链蛋白聚糖。测量蛋白质双糖链蛋白聚糖的水平在HF领域中被视为非常有利的。
在一个优选实施方案中，根据本发明的方法用血清作为液体样品材料进行实践。 在一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的方法用血浆作为液体样品材料进行实践。 在一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的方法用全血作为液体样品材料进行实践。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及蛋白质双糖链蛋白聚糖作为标记分子在对得自个体的液体样品进行心力衰竭评估中的的用途。
用于诊断的理想情况将是这样的情形，其中单个事件或过程将引起分别的疾病， 如例如在传染病中。在所有其他情况下，正确诊断可以是非常困难的，特别是当疾病的病因学并未充分了解时，如在HF的情况下。如技术人员应当理解的，在HF领域中没有生物化学标记对于特定诊断问题具有100%特异性和同时100%灵敏度的诊断性。相反，生物化学标记以特定可能性或预测值用于评估潜在诊断问题。技术人员完全熟悉常规用于计算关于待评估诊断问题的相关危险度或可能性的数学/统计方法。在常规临床实践中，各种临床症状和生物学标记在潜在疾病的诊断、治疗和处置中一般由医生综合考虑。
优选地在本发明的一个进一步优选的实施方案，用于HF评估的方法通过在HF评估中测量双糖链蛋白聚糖和一种或多种其他标记的浓度并且通过使用双糖链蛋白聚糖和一种或多种其他标记的浓度进行。
在HF评估中，标记双糖链蛋白聚糖将在下述中的一个或多个方面帮助医生评估个体关于心力衰竭的危险或评估患有心力衰竭的患者，例如目的是鉴定心力衰竭的阶段、 区分急性和慢性心力衰竭、判断疾病发展的危险、在选择合适治疗中提供指导、监控患者对于治疗的应答和监控病程即HF患者的随访。
筛选(评估个体是否处于发生心力衰竭的危险中)
在一个优选实施方案中，本发明涉及用于评估个体是否处于发生心力衰竭的危险中的体外方法，其包括以下步骤测量样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将双糖链蛋白聚糖的浓度和任选地对于任选地一种或多种其他标记测定的浓度与这种标记或这些标记的浓度的参考值比较来评估所述患者发生心力衰竭的危险。
在本发明含义中的筛选涉及对个体关于其发生心力衰竭的危险的无偏评估。虽然此类筛选在理论上可以对任何样品进行，但在临床实践中此类筛选选择将通常给予由于某种原因处于发生心力衰竭的危险中的个体。如上所述，此类个体可以在临床上是无症状的， 即他们没有HF体征或症状。在一个优选实施方案中，关于HF的筛选将给予处于发生心力衰竭的危险中的个体，例如归入如由ACC/AHA实践指导确定的阶段A或B。
如上所述，心力衰竭是发达国家中最普遍、费用最高且最能威胁生命的疾病之一。 因为其高普遍性及其长的无症状期，对处于发生HF的危险的个体的鉴定对于干预和可能时中断病程将至关重要。如果没有非常早期的危险性评估，那么预防从HF的无症状状态到有症状期的疾病发展看起来是不可能的。
关于心力衰竭的危险通过技术人员充分已知且了解的数学/统计方法进行评估。 优选地，个体关于心力衰竭的危险以相关术语表达且作为所谓的相对危险度(=RR)给出。为了计算关于心力衰竭的此类RR，将个体关于双糖链蛋白聚糖的值与在参考群体中确定的双糖链蛋白聚糖的值比较，所述参考群体优选未发生心力衰竭的健康个体。还优选的是关于心力衰竭的此类RR评估基于在研究期间内优选在1年内或还优选在2年内已发生心力衰竭的个体组，和在相同研究期间未发生心力衰竭的个体组。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及标记双糖链蛋白聚糖在筛选心力衰竭中的用途。如技术人员已知的，术语“用作标记”意指标记分子的浓度通过合适方法进行定量， 并且对于此类标记测量的值随后用于指示即标记疾病或临床病状的存在或不存在。用于定量的合适方法例如是特异性结合剂如抗体。
优选地，关于HF的筛选将在疑似处于未来心力衰竭的危险中的个体中进行。在这个含义中处于未来心力衰竭的危险中的患者是诊断患有高血压、动脉粥样硬化疾病、糖尿病、肥胖和代谢综合征的患者。优选地，对于患有高血压、动脉粥样硬化疾病、糖尿病和/或代谢综合征的个体评估关于未来心力衰竭的危险。
还优选的是标记双糖链蛋白聚糖在评估关于根据ACC/AHA实践指导在阶段B中的个体的未来心力衰竭危险中的用途，即显示出心脏结构改变但未显示心力衰竭症状的个体。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及双糖链蛋白聚糖作为HF标记组合中的一种标记用于HF筛选目的的用途。
在筛选设置中，升高水平的双糖链蛋白聚糖是关于个体发生心力衰竭的危险增加的阳性指示剂。
患者的分期在一个优选实施方案中，本发明涉及帮助心力衰竭患者分期的体外方法，其包括以下步骤a)测量样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，b)任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将步骤(a)中测定的浓度和任选地步骤(b)中测定的浓度与这种标记或这些标记的浓度的参考值比较来分级心力衰竭。优选地，标记双糖链蛋白聚糖的水平用于帮助将研究个体分类为临床上“正常的”个体组(即，根据ACA/ACC分类法在阶段 A中的个体)，患有结构心脏病的无症状患者(根据ACA/ACC分类法的阶段B)和患有心力衰竭的患者组(即，根据ACA/ACC分类法在阶段C或阶段D中的患者)。
急性心脏事件和慢性心脏病之间的区分在一个优选实施方案中，本发明涉及帮助急性心脏事件和慢性心脏病之间的鉴别诊断的体外方法，其包括以下步骤测量样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将步骤(a)中测定的浓度和任选地步骤(b) 中测定的浓度与这种标记或这些标记的浓度的参考值比较来确定急性心脏事件和慢性心脏病之间的鉴别诊断。
本领域技术人员熟悉“急性心脏事件”和“慢性心脏病”的含义。
优选地，“急性心脏事件”指心脏的急性病状、疾病或功能失常，特别是急性心力衰竭，例如心肌梗塞(MI)或心律失常。根据MI的程度，它可以随后为LVD和CHF。
优选地，“慢性心脏病”是心功能的减弱，例如由于心脏的缺血、冠状动脉疾病或先前特别是小的心肌梗塞(可能随后为进行性LVD)。它还可以是由于炎性疾病、心脏瓣膜缺损 (例如，二尖瓣缺损)、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、心节律缺陷(心律失常)和慢性阻塞性肺疾病而引起的减弱。因此，很明显慢性心脏病还可以包括这样的患者，其已患有急性冠状动脉综合征例如MI，但目前未遭受急性心脏事件。
区分急性心脏事件和慢性心脏病是重要的，因为急性心脏事件和慢性心脏病可能需要完全不同的治疗方案。例如，对于出现急性心肌梗塞的患者，对于再灌注的早期治疗可能至关重要。然而，对患有慢性心力衰竭的患者进行再灌注处理充其量对这个患者无害或仅具有小伤害。
在根据本发明的一个进一步优选的实施方案中，标记双糖链蛋白聚糖用于急性和慢性心力衰竭的鉴别诊断。
评估疾病发展的危险在一个优选实施方案中，本发明涉及用于评估HF患者关于疾病发展的危险的体外方法，其包括以下步骤测量样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将双糖链蛋白聚糖的浓度和任选地对于任选地一种或多种其他标记测定的浓度与这种标记或这些标记的浓度的参考值比较来确定所述个体关于疾病发展的危险。
目前非常难的是以合理可能性评估或甚至预测诊断有HF的患者是否具有更稳定或更不稳定的状态，或疾病是否发展以及患者的健康状态是否因而可能恶化。心力衰竭的严重度和发展在临床上通常通过评估临床症状或通过使用成像技术例如超声心动图鉴定不利改变来确定。在一个实施方案中，心力衰竭的恶化通过监控左心室射血分数(LVEF)来确定。LVEF中5%或更多的恶化被视为疾病发展。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明因此涉及标记双糖链蛋白聚糖在评估关于患有HF患者的疾病发展危险中的用途。在关于患有HF患者的疾病发展评估中，升高水平的双糖链蛋白聚糖是关于疾病发展的危险增加的指示剂。
选择合适的HF治疗的指导在一个优选实施方案中，本发明涉及帮助选择合适HF治疗的体外方法，其包括以下步骤测量样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将双糖链蛋白聚糖的浓度和任选地对于任选地一种或多种其他标记测定的浓度与这种标记或这些标记的浓度的参考值比较来选择合适的治疗。
预期标记双糖链蛋白聚糖将帮助医生从心力衰竭领域中在手边(at hand)的各种治疗方案中选择最合适的治疗方案。因此，在一个进一步优选的实施方案中涉及标记双糖链蛋白聚糖在选择用于患有HF患者的治疗方案中的用途。
监控患者对于治疗的应答在一个优选实施方案中，本发明涉及用于监控患者对于HF治疗的应答的体外方法，其包括以下步骤a)测量样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，b)任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和通过将步骤(a)中测定的浓度和任选地步骤(b)中测定的浓度与这种标记或这些标记的浓度的参考值比较来监控患者对于HF治疗的应答。
可替代地用于监控患者对于治疗的应答的上述方法可以通过确定关于双糖链蛋白聚糖和任选地一种或多种其他标记的治疗前和治疗后的标记水平且比较治疗前和治疗后的标记水平进行实践。
在临床上确定心力衰竭的诊断。根据本发明，如果患者符合如由ACC/AHA实践指导确定的阶段C或D的标准，则HF被视为临床上确定。根据这些指导，阶段C指患有结构心脏病且具有心力衰竭的先前或目前症状的患者。在阶段D中的患者是患有需要专门干预的难治性心力衰竭的那些患者。
如上文进一步指出的，对于NT-proBNP测量的值与心力衰竭的严重度高度相关。然而，BNP和NT-proBNP看起来在监控患者对于治疗的应答中都不理想，参照例如 Beck-da-Silva, L.等人，Congest. Heart Fail. 11 (2005) 248-253，quiz 254-255。
标记双糖链蛋白聚糖看起来适合于监控患者对于治疗的应答。本发明因此还涉及双糖链蛋白聚糖在监控患者对于治疗的应答中的用途。在那个诊断领域中，标记双糖链蛋白聚糖还可以用于确定治疗前的基线值且测量在治疗后的一个时间点或几个时间点时的双糖链蛋白聚糖。在HF患者随访中，减少水平的双糖链蛋白聚糖是关于HF的有效治疗的阳性指示剂。
标记组合生物化学标记可以个别进行测定，或在本发明的一个优选实施方案中，它们可以使用基于芯片或珠的阵列技术中同时进行测量。生物标记的浓度随后使用关于每种标记的个别截止独立地进行说明，或它们组合用于说明，即它们形成标记组合。
如技术人员应当理解的，可以进行将标记水平与特定可能性或危险相关的步骤且以不同方式达到。优选地，对于标记双糖链蛋白聚糖和一种或多种其他标记测量的值在数学上进行组合，并且使组合值与潜在诊断问题相关。标记值可以通过任何合适的数学方法的现有技术与双糖链蛋白聚糖的测量进行组合。
优选地，在标记组合中应用的数学算法是逻辑函数。应用此类数学算法或此类逻辑函数的结果优选是单个值。根据潜在诊断问题，此类值可以容易地与例如个体关于心力衰竭的危险或在患有HF患者的评估中有帮助的其他预期诊断用途相关联。在优选方法中， 此类逻辑函数通过下述获得a)将个体分类为组，例如正常、处于心力衰竭的危险中的个体，患有急性或慢性心力衰竭的患者等等，b)通过单变量分析鉴定在这些组之间显著不同的标记，c)逻辑回归分析以评估在评估这些不同组中有用的独立区别标记值，和d)构建逻辑函数以使独立区别值组合。在这类分析中，标记不再是独立的而代表标记组合。
在一个优选实施方案中，用于使关于双糖链蛋白聚糖的值和至少一种进一步标记的值组合的逻辑函数通过下述获得a)将个体分别分类为正�：痛τ谛牧λソ叩奈Ｏ罩械母鎏宓淖椋琤)确定关于双糖链蛋白聚糖的值和至少一种进一步标记的值，c)进行逻辑回归分析，和d)构建逻辑函数以使关于双糖链蛋白聚糖的标记值和至少一种进一步标记的值组
I=I ο 用于使标记组合与疾病关联的逻辑函数优选采用通过应用统计方法开发且获得的算法。合适的统计方法例如是判别分析(DA) (S卩，线性、二次、正则化DA)、Kernel法 (即，SVM)、非参数法(即，k-最近邻分类器)、PLS (偏最小二乘法)、基于树的方法(即，逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting/Bagging法)、广义线性模型(S卩，逻辑回归)、基于主组分的方法(即，SIMCA)、广义相加模型、基于模拟逻辑学的方法、神经网络和基于遗传算法的方法。技术人员在选择合适统计方法以评估本发明的标记组合且从而获得合适的数学算法方面没有问题。优选地，用于获得在心力衰竭评估中使用的数学算法的统计方法选自DA (即，线性、二次、正则化判别分析)、Kernel法(即，SVM)、非参数法(即，k_最近邻分类器)、PLS (偏最小二乘法)、基于树的方法(即，逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting Methods)、或广义线性模型(S卩，逻辑回归)。关于这些统计方法的细节见于下述参考文献 Ruczinski, I.等人，J· of Computational and Graphical Statistics 12(2003)475-511 ； Friedman，J. H.，J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175 ； Hastie，T.等人，The Elements of Statistical Learning，Springer Verlag (2001)； Breiman，L 等人，Classification and regression trees，Wadsworth International Group，California (1984)；Breiman, L. , Machine Learning 45 (2001) 5-32 ；Pepe, Μ. S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction， Oxford Statistical Science Series,28, Oxford University Press (2003)；禾口 Duda， R. 0.等人，Pattern Classification, John Wiley & Sons，Inc.，第二片反(2001)。
本发明的一个优选实施方案是使用最优化的多变量截止用于生物学标记的潜在组合，且使状态A与状态B区分，例如分别地，为正�：痛τ谛牧λソ叩奈Ｏ罩械母鎏濉⑾煊χ瘟坪椭瘟剖О艿腍F患者、患有急性心力衰竭的患者和患有慢性心力衰竭的HF患者、显示疾病发展的HF患者和未显示疾病发展的HF患者。
接受者操作曲线下面积(=AUC)是诊断程序的性能或准确度的指示。诊断方法的准确度通过其接受者操作特征(ROC)被最佳描述(特别参见Zweig，Μ. H.和Campbell，G.， Clin. Chem. 39 (1993) 561-577)。ROC曲线是起因于在观察数据的整个范围上连续改变决策阈(decision thresh-hold)的所有灵敏度/特异性对的曲线图。
实验室测试的临床性能依赖于其诊断准确度，或使受试者正确分类为临床上相关亚组的能力。诊断准确度测量测试正确区分被研究的受试者的2个不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或疾病发展相对于无疾病发展。
在每种情况下，ROC曲线图通过绘制灵敏度相对于1 -关于决策阈的全范围的特异性的图来描述两种分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度，或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果数目)/ (真阳性数目+假阳性测试结果数目)]。这在疾病或状况的存在下也被称为确定性(positivity)。它由受影响亚组单独计算。在X轴上是假阳性分数，或1 -特异性[定义为(假阳性测试结果数目)/ (真阳性数目+假阳性测试结果数目)]。它是特异性指数且完全由未受影响亚组计算。因为真和假阳性分数通过使用来自2个不同亚组的测试结果完全分开计算，所以ROC曲线图不依赖于疾病在样品中的普遍性。ROC曲线图上的每个点代表与特定决策阈对应的灵敏度/1-特异性对。具有最佳区分的测试(在2个分布结果中无重叠)具有经过左上角的ROC曲线，而真阳性分数为1.0，或100% (最佳灵敏度)， 并且假阳性分数是0 (最佳特异性)。关于无区分测试(关于2个组的结果的相同分布)的理论曲线图是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线图介于这2个极端之间。(如果 ROC曲线图完全降到45°对角线之下，那么这通过使关于“确定性”的标准从“大于”倒转为 “小于”容易地进行纠正，或反之亦然。)定性地，曲线图与左上角越接近，测试的总准确度越尚ο 定量实验室测试的诊断准确度的一个方便目的是通过单个数目表达其性能。最常见的总体测量是ROC曲线下面积(AUC)。常规来说，这个面积总是2 0.5(如果它不是，那么可以将决策规则倒转以使得其如此)。值范围在1. 0 (2个组的测试值的最佳分离)和0. 5 (在2个测试值组之间没有明显分布差异)之间。该面积不是仅依赖于曲线图的特定部分， 例如最接近于对角线的点或在90%特异性下的灵敏度，而是依赖于整个曲线图。这是ROC 曲线图如何接近于完美曲线图(面积=1.0)的定量、描述性表达。
总测定灵敏度将依赖于实践本文公开方法所需的特异性。在特定优选设置中， 75%的特异性可以是足够的，并且统计方法和所得到的算法可以基于这个特异性需求。在一个优选实施方案中，用于评估处于心力衰竭的危险中的个体的方法基于80%、85%或还优选90%或95%的特异性。
如上所述，标记双糖链蛋白聚糖帮助评估个体发生心力衰竭的危险以及患有心力衰竭患者的进一步体外诊断评估。优选实施方案因此是双糖链蛋白聚糖作为标记分子在心力衰竭评估中的用途。
包含双糖链蛋白聚糖和一种或多种其他HF标记的标记组合在HF患者评估或处于 HF危险的个体评估中的用途代表本发明的一个进一步优选的实施方案。在此类标记组合中，一种或多种其他标记优选选自利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。
双糖链蛋白聚糖的测量可以与之组合的一种或多种优选选择的其他HF标记优选选自利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。其测量优选与双糖链蛋白聚糖测量组合或形成包含双糖链蛋白聚糖的HF标记组合的一部分的这些优选其他标记分别在下文中更详细地讨论。
利钠肽标记在本发明的含义中的利钠肽标记是选自心房利钠肽(ANP)家族的标记或选自脑利钠肽 (BNP)家族的标记。
在心房利钠肽家族或脑利钠肽家族中的多肽标记源自相应活性激素的前原形式。
根据本发明优选的利钠肽标记是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP及其免疫学上可检测的生理学片段。如技术人员容易理解的，免疫学上可检测的片段必须包含允许特异性检测此类生理学片段的至少一个表位。生理学片段是如天然存在于个体循环中的片段。
2种利钠肽家族中的标记代表相应激素原的片段，即分别为proANP和proBNP。因为相似考虑应用于2个家族，所以仅BNP标记家族将相当详细地进行描述。BNP家族的激素原，即proBNP由108个氨基酸组成。proBNP被切割成代表生物学活性激素BNP的32个 C末端氨基酸(77-108)和称为N末端proBNP (或NT-proBNP)的N末端氨基酸1_76。BNP、 N 末端 proBNP (1-76)以及进一步的分解产物(Hunt，P. J.等人，Biochem. Biophys. Res. Com. 214 (1995) 1175-1183)在血液中循环。完全前体分子(proBNP 1_108)是否也存在于血浆中并未完全解决。然而，描述了(Hunt，P. J.等人，P印tides 18 (1997) 1475-1481) proBNP (1-108)在血浆中的低释放是可检测的，但由于在N末端非�？焖俚牟糠址纸猓恍┌被岵淮嬖�。今天一般公认例如对于NT-proBNP，位于氨基酸10 - 50之间的分子中心部分代表生理学上相当稳定的部分。包含NT-proBNP的这个中心部分的NT-proBNP分子可以从体液中可靠地进行测量。关于基于NT-proBNP分子的这个中心部分的免疫学检测方法的详细公开内容在WO 00/45176中给出，并且对于细节读者可在那里进行参考。仅测量 NT-proBNP特定亚部分(subfraction)可能具有进一步的优点，对于所述NT-proBNP特定亚部分已提出术语天然NT-proBNP。关于NT-proBNP的这个亚部分的详细公开内容见于WO 2004/099253。技术人员将在那里找到所有必需指导。优选地，测量的NT-proBNP是如用来自 Roche Diagnostics, Germany 的 Elecsys NT-proBNP 测定测量的 NT-proBNP,或与如用
Roche Diagnostics, Germany 的 Elecsys NT-proBNP IlJ^llJfiW NT-proBNP )(寸/S。
预分析(Preanalytics)对于NT-proBNP是强有力的，这允许样品容易转运至中心实验室(Mueller，T.等人，Clin. Chem. Lab. Med. 42 (2004) 942-944)。血样可以在室温下贮存数天或可以邮寄或运输而无回收损失。相反，BNP在室温下或在4摄氏度下贮存 48小时导致至少20%的浓度损失(Mueller，T.等人，同上；Wu，Α. H.等人，Clin. Chem. 50 (2004)867-873)。
源自脑的利钠肽家族(特别是BNP和NT-proBNP)已在关于HF的特定群体筛选中充分研究。对于这些标记特别是NT-proBNP的发现是相当鼓舞人心的。即使在无症状“患者” 中升高的NT-proBNP值也明确指示“心脏问题”(Gremmler，B.等人，Exp. Clin. Cardiol. 8 (2003) 91-94)。这些作者显示升高的NT-proBNP指示“心肾痛苦”的存在且应及时转诊 (prompt referral)用于进一步研究。与几个其他研究组一致，Gremmler等人也发现异常 NT-proBNP浓度是关于群体中的HF排除和呼吸困难受试者中排除左心室功能障碍(=LVD) 的准确诊断测试。阴性BNP或NT-proBNP值在排除HF或LVD中的作用通过其他组的研究者进行确证，参照例如 McDonagh，Τ. A.等人，Eur. J. Heart Fail. 6 (2004) 269-273 ；^P Gustafsson，F.等人，J. Card. Fail. 11，Suppl. 5 (2005) S15-20。
BNP在心室中主要地(尽管不是唯一地)产生，并且在壁张力增加后释放。因此，释放的BNP增加主要反映心室功能障碍或源于心房但影响心室的功能障碍，例如通过受损的流入或血容量过度负荷。与BNP相反，ANP主要由心房产生且释放。ANP的水平因此可能主要反映心房功能。
ANP和BNP是活性激素，且具有比其各自的无活性对应物NT-proANP和NT-proBNP 更短的半衰期。BNP在血液中进行代谢，而NT-proBNP在血液中作为完整分子循环并且如此进行肾清除。NT-proBNP的体内半衰期比BNP长120分钟，BNP的体内半衰期是20分钟 (Smith，M. W.等人，J. Endocrinol. 167 (2000) 239-246)。
因此，依赖于目的时间过程或性质，测量利钠肽的活性或无活性形式都可以是有利的。
在处于心力衰竭的危险中的个体评估中，对于双糖链蛋白聚糖测量的值优选与关于NT-proANP和/或NT-proBNP的值组合。优选地，将NT-proBNP的值与双糖链蛋白聚糖的值组合。类似考虑应用于选择合适疗法、判断疾病发展的危险和监控病程。
在双糖链蛋白聚糖用于评估患者对于治疗的应答的情况下，它的测量优选与ANP 或BNP的测量组合。
在双糖链蛋白聚糖用于区分急性和慢性心力衰竭的情况下，优选标记组合包含双糖链蛋白聚糖、ANP或proANP和BNP或proBNP。
心肌肌钙蛋白标记术语心肌肌钙蛋白涉及肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的心脏同种型。如上文已指出的，术语标记还涉及标记分子的生理学变体，如生理学片段或复合物。对于心肌肌钙蛋白标记，它们生理学上存在的复合物已知具有诊断相关性且在此明确包括。
肌钙蛋白T具有约37. 000 Da的分子量。在心脏组织中发现的肌钙蛋白T同种型 (cTnT)与骨骼肌TnT是充分趋异的(divergent)，以允许产生区分这两种TnT同种型的抗体。TnT被视为急性心肌损伤的标记；参照Katus，H. A.等人，J. Mol. Cell. Cardiol. 21 (1989)1349-1353 ;Hamm，C. W.等人，N. Engl. J. Med. 327( 1992)146-150 ;0hman，Ε. Μ.等人，N. Engl. J. Med. 335 (1996) 1333-1341 ;Christenson，R. H.等人，Clin. Chem. 44 (1998) 494-501 ；和 EP 0 394 819。
肌钙蛋白I (TnI)是在肌肉组织中发现的肌钙蛋白复合物的25 kDa抑制元件。 TnI在不存在Ca2+的情况下与肌动蛋白结合，抑制肌动球蛋白的ATP酶活性。在心脏组织中发现的TnI同种型(cTnl)与骨骼肌TnI有40%趋异，允许2种同种型在免疫学上进行区分。cTnl的正常血浆浓度是<0. 1 ng/ml (4 pM)。cTnl在心脏细胞死亡后被释放到血流内；因此，血浆cTnl浓度在患有急性心肌梗塞的患者中是升高的(Benamer，H.等人，Am. J. Cardiol. 82 (1998) 845-850)。
肌钙蛋白I和T的独特心脏同种型允许其与骨骼肌的其他肌钙蛋白在免疫学上进行区分。因此，肌钙蛋白I和T从受损心脏肌肉释放到血液中可以特异性涉及心脏组织的损害。目前技术人员还理解心肌肌钙蛋白可以以其游离形式或作为复合物的部分从循环中检测出(参照例如 US 6，333，397、US 6，376，206 和 US 6，174，686)。
在处于心力衰竭的危险中的个体评估中以及在患有心力衰竭的患者评估中，对于双糖链蛋白聚糖测量的值优选与关于肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I的心脏同种型的值组合。与标记双糖链蛋白聚糖组合使用的优选心肌肌钙蛋白是心肌肌钙蛋白T。
炎症标记技术人员熟悉术语炎症标记。优选炎症标记是白介素-6、C反应蛋白、血清淀粉样蛋白 A和S100蛋白质。
白介素-6 (IL-6)是21 kDa分泌蛋白质，其具众多生物学活性，这可以分成涉及造血作用的活性和涉及先天免疫应答激活的活性。IL-6是急性期反应物，且刺激各种蛋白质包括粘附分子的合成。它的主要功能是介导肝脏蛋白质的急性期生产，并且它的合成由细胞因子IL-I和TNF-α诱导。IL-6通常由巨噬细胞和T淋巴细胞产生。IL-6的正常血清浓度是< 5 pg/ml。
C反应蛋白(CRP)是具有21 kDa亚基的同源五聚体Ca2+结合急性期蛋白质，其涉及宿主防御。CRP合成由IL-6诱导，并且由IL-I间接诱导，因为IL-I可以触发在肝窦状隙中肝巨噬细胞(Kuffer cells)的IL-6合成。CRP的正常血浆浓度在90%的健康群体中是 < 3μδ/πι1 (30 ηΜ)，并且在99%的健康个体中是< 10 Pg/ml (100 nM)。血浆CRP浓度可以例如通过ELISA进行测量。
血清淀粉样蛋白A (=SAA)是具有11. 7 kDa的低分子量的急性期蛋白质。它主要由肝脏响应IL-I、IL-6或TNF-α刺激而合成，且涉及T细胞依赖性免疫应答调节。在急性事件后，SAA的浓度增加至高达1000倍，达到1毫克/毫升。它用于监控疾病中的炎症，所述疾病广泛至囊性纤维化、肾移植物排斥、创伤或感染。在类风湿性关节炎中，它在特定情况下已用作CRP的替代物，但SAA仍未被广泛接受。
SlOO蛋白质形成不断增加的Ca2+结合蛋白家族，其今天包括超过20个成员。 SlOO蛋白质的生理学相关结构是同源二聚体，但某些还可以彼此形成同源二聚体，例如 S100A8和S100A9。细胞内功能范围从调节蛋白质磷酸化、酶活性或细胞骨架动力学到参与细胞增殖和分化。因为某些SlOO蛋白质也从细胞中释放，所以细胞外功能也得到描述， 例如神经元存活、星形胶质细胞增殖、凋亡诱导和炎症性过程调节。S100A8、S100A9、异源二聚体S100A8/A9和S100A12已在炎症中发现，其中S100A8响应慢性炎症，而S100A9、 S100A8/A9 和 S100A12 在急性炎症中增加。S100A8、S100A9、S100A8/A9 和 S100A12 已与具有炎症组分的不同疾病关联，包括某些癌症、肾同种异体移植物排斥、大肠炎和最重要地RA (Burmeister,G.禾口 Gallacchi,G. ,Inflammopharmacology 3 (1995)221-230 ；Foell,D.等人，Rheumathology 42 (2003) 1383-1389)。用于评估处于HF危险中的个体或患有HF的患者最优选SlOO标记(例如用于根据本发明的标记组合中的)是S100A8、S100A9、S100A8/ A9异源二聚体和S100A12。
sE-选择素(可溶性内皮细胞白细胞粘附分子-1，ELAM-I)是仅在内皮细胞上且仅在由炎症性细胞因子(IL-Ιβ、TNF-α )或内毒素活化后表达的115 kDa、I型跨膜糖蛋白。 细胞表面E-选择素是白细胞与内皮的滚动附着(白细胞在炎症部位外渗的基本步骤)介质， 从而在局部炎症应答中起重要作用。可溶性E-选择素在健康个体的血液中发现，可能源于表面表达分子的蛋白酶解切割。在血清中升高水平的sE-选择素已在各种病理学条件下得到报道(Gearing，A.J. ^P Hemingway, I. , Ann. N. Y. Acad. Sci. 667 (1992) 324-331)。
在一个优选实施方案中，本发明涉及双糖链蛋白聚糖作为HF的标记分子与一种或多种其他HF标记分子组合在对得自个体的液体样品中的HF评估中的用途。
如上所述，在根据本发明的优选方法中，对于双糖链蛋白聚糖测量的值至少与选自利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记的至少一种进一步标记的值组合。
在一个优选实施方案中，本发明涉及标记组合双糖链蛋白聚糖和NT-proBNP在心力衰竭评估中的用途。
在一个优选实施方案中，本发明涉及标记组合双糖链蛋白聚糖和肌钙蛋白T在心力衰竭评估中的用途。
在一个优选实施方案中，本发明涉及标记组合双糖链蛋白聚糖和CRP在心力衰竭评估中的用途。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及包含标记双糖链蛋白聚糖、肌钙蛋白T、NT-proBNP和CRP的标记组合。
在另外一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及在用于通过生物化学标记在体外评估HF的方法中使用的标记组(a marker panel)，其包含测量样品中双糖链蛋白聚糖和一种或多种其他HF标记的浓度，并且在HF评估中使用测定的浓度。
根据本发明的标记组优选使用蛋白质阵列技术进行测量。阵列是可寻址单个标记的集合。此类标记可以是可空间寻址的，例如在微量滴定板内含有的或在平面表面上点样的阵列，其中每个标记存在于不同χ和Y坐标上。可替代地，标记可以基于标记、珠、纳米颗粒或物理性质进行寻址。微阵列可以根据普通技术人员已知的方法进行制备(参见例如， US 5, 807, 522 ；Robinson, W. H.等人，Nat. Med. 8 (2002) 295-301 ；Robinson, W. H.等人， Arthritis Rheum. 46 (2002) 885-893)。如本文使用的，阵列指具有多种可寻址标记的任何免疫学测定。在一个实施方案中，可寻址标记是抗原。在另一个实施方案中，可寻址元件是自身抗体。微阵列是小型化形式的阵列。如本文使用的，抗原指可以与抗体特异性结合的任何分子。术语自身抗体是本领域中定义明确的。
在一个优选实施方案中，本发明涉及包含标记双糖链蛋白聚糖和任选地一种或多种其他HF标记的蛋白质阵列。
在一个优选实施方案中，本发明涉及包含标记双糖链蛋白聚糖和NT-proBNP的蛋白质阵列。
在一个优选实施方案中，本发明涉及包含标记双糖链蛋白聚糖和肌钙蛋白T的蛋白质阵列。
在一个优选实施方案中，本发明涉及包含标记双糖链蛋白聚糖和CRP的蛋白质阵列。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及包含标记双糖链蛋白聚糖、肌钙蛋白T、NT-proBNP和CRP的蛋白质阵列。
在另外一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含特异性测量双糖链蛋白聚糖所需的试剂。还优选的是这样的试剂盒，其包含特异性测量双糖链蛋白聚糖所需的试剂和测量一种或多种其他心力衰竭标记所需的试剂，所述双糖链蛋白聚糖和一种或多种其他心力衰竭标记一起用于HF标记组合中。
提供下述实施例、序列表和图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中阐述。应当理解可以在所述操作中进行修改而不背离本发明的范围。
图1野生型和R9C小鼠的表型分析。(々)在对周时期后产生关于野生型小鼠 (n=79)和R9C小鼠(n=44)的存活曲线。(B)通过超声心动图评估的心脏缩短(=缩短分数)。 在R9C转基因动物中的显著功能缺损早在8周龄时开始。
图2野生型和AB小鼠中的超声心动图和血液动力学参数。(A)在手术后2、4和 8周时以mmHg为单位的最大压力的变化。(B)在手术后2、4和8周时在左心室射血分数 (LVEF) %的变化(实心环指示来自假手术小鼠的数据，并且空心环指示来自具有主动脉绑扎(AB)的小鼠的数据)。
图3分别在来自242个HF患者的样品和118个对照样品中测量的双糖链蛋白聚糖。以ng/ml的浓度在y轴上给出。分别地，源自患有心力衰竭患者的样品标记为HF (HF =正方形)和健康对照标记为NHS (正常人血清=NHS =菱形)。
图4分别在来自临床实践(clinical routine)的HF样品和扩展的对照组中检测的双糖链蛋白聚糖值。对于双糖链蛋白聚糖，分别地如在源自患有心力衰竭的患者的样品 (标记(HF))和来自健康对照的样品(标记正常人血清=NHS)中测量，给出计算浓度。箱须图(box-and-whisker-blots)显示上和下四分位数(箱)以及最高和最低值(须)。
实施例 实施例1
心力衰竭的小鼠模型 1. 1 R9C小鼠模型已报道遗传性人扩张型心肌病中起因于人受磷蛋白基因(PLN)基因(PLN-R9C)中的 Arg9 至 Cys 转换(Schmitt，J. P.等人，Science 299 (2003)1410-1413)。在受累患者中扩张型心肌病的发作一般在青春期过程中开始，随后为心脏功能的进行性恶化，导致危象和死亡。这种突变的转基因小鼠模型显示与受累患者相似的心脏表型且呈现扩张型心肌病、 心脏收缩力减少和过早死亡(Schmitt等人，2003，同上)。
我们确定了关于转基因小鼠的存活曲线。PLN-R9C小鼠具有仅 20周的生存中值，其中小于15%持续经过M周(图1A)。在PLN-R9C系中第一例记录的死亡在12周龄时观察到，而仅一个野生型对照小鼠经过M周时期死亡。8周选择为在第一个记录死亡前的 “早”期疾病的代表时间点，而选择16周是因为它是8和M周之间的中点(标准DCM)。分离心脏的病理学详细分析显示即使在PLN-R9C小鼠8周龄时心室和心房扩大的证据。在苏木精和伊红染色后的分离心肌(得自野生型和PLN-R9C小鼠横切片也显示在转基因动物中在8周时开始的左心室扩张或心室壁变薄的证据，其伴随着随年龄的持续扩张发展。
功能心脏测量通过对于8、16和M周大的雄性小鼠的超声心动图进行(在表1中概括)。前和后壁厚度的超声心动图测量显示R9C小鼠在8周时具有显著扩张，这在小鼠寿命自始至终持续恶化。如通过心脏缩短评估的(图1B)，收缩力在8周时也轻微但显著减少，而更明显的降低到16周时非常明显。分析的雌性小鼠显示与雄性相同的发现(数据未显不)。
表1在雄性小鼠中在8、16和M周时在野生型和R9C小鼠中的超声心动图和血液动力学参数。
权利要求
1.一种用于评估个体中的心力衰竭的方法，其包括以下步骤a)测量得自所述个体的样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，b)任选地测量所述样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，和c)通过将步骤(a)中测定的所述浓度和任选地步骤(b)中测定的所述浓度与如在对照样品中确定的这种标记或这些标记的浓度比较来评估心力衰竭。
2.根据权利要求1的方法，其进一步特征在于所述样品选自血清、血浆和全血。
3.根据权利要求1和2中任一项的方法，其进一步特征在于所述一种或多种其他标记选自利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。
4.根据权利要求3的方法，其进一步特征在于所述一种或多种其他标记是NT-proBNP。
5.根据权利要求3的方法，其进一步特征在于所述一种或多种其他标记是肌钙蛋白T。
6.蛋白质双糖链蛋白聚糖作为心力衰竭评估中的标记分子的用途。
7.包含双糖链蛋白聚糖和一种或多种其他心力衰竭标记的标记组合在心力衰竭评估中的用途。
8.根据权利要求7的标记组合的用途，其中所述一种或多种其他标记选自利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。
9.根据权利要求8的标记组合的用途，所述标记组合包含至少双糖链蛋白聚糖和 NT-proBNPo
10.一种用于进行根据权利要求1的方法的试剂盒，其包含特异性测量双糖链蛋白聚糖和任选地一种或多种其他心力衰竭标记所需的试剂。
11.根据权利要求1的方法，其中所述标记双糖链蛋白聚糖在得自处于心力衰竭的危险中的个体的样品中进行测量。
全文摘要
本发明涉及用于在体外评估心力衰竭的方法，其包括以下步骤测量样品中标记双糖链蛋白聚糖的浓度，任选地测量样品中一种或多种其他心力衰竭标记的浓度，以及通过将对于双糖链蛋白聚糖测定的浓度和对于任选地一种或多种其他标记测定的浓度与如在参考群体中确定的这种标记或这些标记的浓度比较来评估心力衰竭。还公开的是双糖链蛋白聚糖作为心力衰竭评估中的标记蛋白质的用途，包含双糖链蛋白聚糖的标记组合，和用于测量双糖链蛋白聚糖的试剂盒。
文档编号G01N33/68GK102187228SQ200980141022
公开日2011年9月14日 申请日期2009年10月15日 优先权日2008年10月17日
发明者U-H·韦恩许斯-特伦, S·阿拉布, D·布洛克, A·埃米利, A·格拉莫利尼, G·赫斯, H·许迪希, P·刘, D·麦克莱南 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司, 多伦多大学董事局
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