专利名称：用作毛细管凝胶电泳筛分介质的准互穿聚合物网络和其制备方法以及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于毛细管凝胶电泳的筛分介质，以及制备和使用该筛分介质的方法。更具体地，本发明提供一种用作毛细管凝胶电泳筛分介质的准互穿聚合物网络，以及该准互穿聚合物网络的制备方法及用途。
背景技术：
毛细管电泳是一种快速高效分离手段。带电物质在电场的作用下，从毛细管的一端移动到另一端。毛细管凝胶电泳是分离大分子物质最有效方法之一，如生物大分子蛋白质，多肽， RNA和DNA等。毛细管凝胶电泳通常使用石英毛细管，内径范围在50微米至200微米，长度从IOcm到100cm。为保护被分析物不被吸附，同时消除毛细管的电渗流，毛细管内壁通常涂有一保护层。最常用的涂层是聚丙烯酰胺涂层。毛细管凝胶电泳分离介质性质决定大分子物质的分离度。例如，聚丙烯酰胺凝胶对DNA片段的分离效果较好。高分子量聚丙烯酰胺是目前所有聚合物中DNA分离度最好的介质。可以分离DNA 片段达1200碱基数。但聚丙烯酰胺不具有自涂敷能力。必须在毛细管内壁上加涂层，消除毛细管内壁对DNA的吸附和电渗流，才能有效的分离DNA片段。利用聚丙烯酰胺作为筛分介质的主要优点是重复性好，分离能力强，化学性质稳定。但是聚丙烯酰胺也有很多不足之处。例如它没有自涂敷能力，使用的毛细管必须有涂层保护。另外，由高分子量聚丙烯酰胺制备的凝胶粘度较高，需要高压才能将凝胶灌入毛细管中。聚(N，N_二甲基丙烯酰胺)也有很强的分离DNA片段的能力，并且使用聚(N，N_二甲基丙烯酰胺)时毛细管内壁不需要涂涂层保护。聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)对DNA片段的分离效果略低于聚丙烯酰胺。但是聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)凝胶具有很强的自涂敷能力，可消除DNA的吸附和降低电渗流。聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)凝胶的粘度远远低于聚丙烯酰胺凝胶。若把这两种聚合物有机地结合起来，就可得到理想的DNA分离介质。但由于聚丙烯酰胺和聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)两者的极性不同，这两种聚合物通过简单的机械混合不能得到均勻混合体，而会呈现出微观两相不互溶现象。Barbier V等，Electrophoresis 2002,23 :1441-1449,公开了有机地把这两种性质不同的聚合物结合到一起。以聚丙烯酰胺为主链，以聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)为支链合成梳形聚合物。这种梳形聚合物能够有效地抑制电渗流，不需要在毛细管内壁加任何涂层，就能有效的分离DNA片段。但是此合成方法比较复杂。理想的筛分介质需要很强的亲水性、适度的粘度，还要具有自涂敷功能。目前合成的均聚物无法同时满足上述条件。无规共聚物是把两种或者两种以上的聚合物有机结合到一起的常用办法。共聚物同时具备了两种聚合物的特征。因此，把有筛分能力的聚合物和有自涂敷功能的聚合物合成为共聚物，就可成为满足以上条件的一种新型的毛细管电泳分离筛分介质，尤其是用于DNA的分离。当丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺共聚形成无规共聚物时，就同时对DNA具有良好的分离能力和具有毛细管内壁自涂敷能力。Song L 等，Electrophoresis, 2001, 22 :729_736，公开了利用聚丙烯酰胺优秀的筛分能力和聚(N， N- 二甲基丙烯酰胺)良好的自涂敷功能，通过自由基聚合方法，把丙烯酰胺和N，N- 二甲基丙烯酰胺以不同比率3 1、2 1和1 1合成得到无规共聚物。可以在没有额外保护层的条件下分离DNA片段。但当两者比例大小不同时，无规共聚物对DNA片段分离效果也不尽相同。实验发现，对于丙烯酰胺和N，N- 二甲基丙烯酰胺的共聚物而言，当丙烯酰胺的含量较高时，该共聚物对DNA的分离效果较好。但当该共聚物中的N，N-二甲基丙烯酰胺含量减少到一定程度时，N，N-二甲基丙烯酰胺的比例太低，无规共聚物的自涂敷功能会受到影响，分离效果也随之降低。无规共聚物的形成过程中N，N- 二甲基丙烯酰胺被随机分布到丙烯酰胺聚合链上。这种随机性分布会造成每次合成的共聚物不完全相同。造成不同批次合成的共聚物在毛细管自涂敷能力方面有所不同，从而影响DNA片段分离效果的重复性。互穿网络结构是把两种或者两种以上的聚合物有机结合到一起的常用办法。例如，Song L 等，Electrophoresis，2001，22 :3688-3698 公开了由 LPA (线性聚丙烯酰胺)和 PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)形成的准互穿网络结构对dsDNA进行分离，把DMA(N，N-二甲基丙烯酰胺)溶解在PVP溶液内，于氮气保护下自由基引发聚合，得到LPA与PVP互穿的网络结构，就可用于dsDNA的分离。“互穿聚合物网络 anterpenetrating Polymer Networks，IPN) ”定义为两种或更多种聚合物以网络形式结合，其中至少一种聚合物是在另外一种聚合物直接存在下进行合成或交联的。若构成IPN的两种聚合物组分都是交联的，则称为“全互穿聚合物网络”，即， “全-IPN” (Full-IPN)；若仅有一种聚合物交联，另一种聚合物是线型的，则称为“半互穿聚合物网络”，即，“半-IPN” (Semi-IPN)。“准互穿聚合物网络”的英文是Quasi-IPN。准互穿聚合物网络的两种(或更多种)聚合物都是线型的，相互构成准互穿网络式结构。如在制备过程中没有添加交联试剂(cross-linking agent)，则为准互穿聚合物网络。如在制备过程中添加交联试剂，则为互穿聚合物网络。相同分子量下，准互穿聚合物网络的流动性比线性分子的流动性�。�、半互穿聚合物网络的流动性比准互穿聚合物网络的流动性差。形成互穿网络结构的两种或两种以上的交联聚合物相互贯穿而形成聚合物网络。 交联可以是物理交联也可以是化学交联，但相互贯穿的聚合物之间没有共价键交联作用。 聚合物形成的交联网络能够减少宏观相分离，因此形成的网络结构比聚合物共混方法形成的网络更为稳定。当两种聚合物通过互穿网络结构形成交联聚合物，其稳定性取决于两种聚合物的相容性和分子间的相互吸引力。当两种聚合物的极性相差较大时，相容性降低，互穿网络结构的稳定性就会降低。
发明内容
为解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种具有稳定性高、分辨率高、测序效果好，使用寿命长的作为毛细管凝胶电泳筛分介质的聚合物链的准互穿聚合物网络。
本发明的发明人出乎意料地发现在合成丙烯酰胺和N，N- 二甲基丙烯酰胺的无规共聚物时，适当地加入分子量大小不同的线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)，使所述无规共聚物和聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)形成准互穿聚合物网络结构，从而保证整体凝胶的互溶性、稳定性和重现性；同时，所述准互穿聚合物网络结构用作毛细管凝胶电泳筛分介质时能够实现高的分辨率和优异的测序效果。根据本发明的一个方面，本发明提供一种聚合物链的准互穿聚合物网络，所述聚合物链包括(a)长链线性聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)链，其粘均分子量在800kDa 1200kDa 的范围；(b)短链线性聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)链，其粘均分子量在20kDa 60kDa的范围；和(c)丙烯酰胺和N，N- 二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链，所述无规共聚物在所述长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(a)和所述短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(b)的存在下通过将丙烯酰胺单体和N，N- 二甲基丙烯酰胺单体进行氧化还原自由基聚合制备，所述无规共聚物的分子量大小在IMDa IOMDa的范围，其中，所述长链、短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链和所述丙烯酰胺和N， N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链彼此缠结、互穿，形成聚合物链的准互穿聚合物网络，并且其中，所述聚合物链的准互穿聚合物网络无化学交联。所述长链线性聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)的粘均分子量优选为lOOOkDa。所述短链线性聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)的粘均分子量优选为36kDa。在所述丙烯酰胺和N，N- 二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链中，所述单体丙烯酰胺和所述单体N，N-二甲基丙烯酰胺的重量比为90 10 99. 9 0.1，优选为90 10 99 1，更优选为95 5。本发明的无规共聚(丙烯酰胺-N，N- 二甲基丙烯酰胺)的分子量优选为6MDa。本发明的无规共聚(丙烯酰胺-N，N- 二甲基丙烯酰胺)与长链聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)和短链聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)两者之和的比例是50 50 99 1，优选为 80 20 95 5，最优选为10 1(重量比)。本发明的长链聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)和短链聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)的比例是从5 1 1 1，优选为3 2(重量比)。本发明所述的准互穿聚合物网络，相比聚丙烯酰胺，其中的无规共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺)更容易和线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA)形成较稳定的准互穿聚合物网络。本发明将两种不同分子量大小的线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)与丙烯酰胺和N，N- 二甲基丙烯酰胺的无规共聚物形成准互穿聚合物网络时，长链线性聚(N， N-二甲基丙烯酰胺)可以增加对于毛细管的自涂敷能力，短链线性的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)可以增加聚合物间的混合能力，使准互穿聚合物网状结构更稳定，也保证了整体凝胶的互溶性和重现性。本发明结合了聚丙烯酰胺优秀的筛分能力和聚N，N- 二甲基丙烯酰胺良好的自涂敷功能，通过在聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)存在的溶液中合成无规共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲丙基烯酰胺)，形成一种新型准互穿聚合物网络。这种新型准互穿聚合物网络可作为凝胶毛细管电泳分离的筛分介质用于分离生物大分子，尤其是分离DNA、RNA片段。这种无规共聚准互穿聚合物网络具有稳定性高，DNA、RNA分辨率高等特点。根据本发明的另一个方面，本发明提供制备本发明的聚合物链的准互穿聚合物网络的方法在长链线性聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)链和短链线性聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺) 链的存在下将丙烯酰胺单体和N，N- 二甲基丙烯酰胺单体进行氧化还原自由基聚合以得到所述长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链、所述短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链和无规共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺)的准互穿聚合物网络，其中，所述长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的粘均分子量在800kDa 1200kDa范围，优选IOOOkDa,所述短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的粘均分子量在20kDa 60kDa范围，优选36kDa，所述无规共聚(丙烯酰胺-N，N- 二甲基丙烯酰胺)的分子量大小在IMDa lOMDa，优选6MDa ；其中，所述长链、短链线性聚(N，N_ 二甲基丙烯酰胺)链和所述无规共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺)链彼此缠结、互穿，形成聚合物链的准互穿聚合物网络，并且其中，所述聚合物链的准互穿聚合物网络无化学交联。其中，本发明的分子量大小不同的长链线性聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)和短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)都可以采用本领域的常规方法制备，只要符合所述分子量要求即可。例如，分子量大小在20kDa 60kDa范围，优选为36kDa的短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)是在含有异丙醇的水溶液中通过过硫酸铵(APQ/四甲基乙二胺(TEMED)引发N，N- 二甲基丙烯酰胺(DMA)聚合得到PDMA。分子量大小在800kDa 1200kDa范围，优选为IOOOkDa的长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)是在含有甲醇的水溶液中通过过硫酸铵(APS)/四甲基乙二胺(TEMED)引发N，N-二甲基丙烯酰胺聚合而成的。本发明的无规共聚(丙烯酰胺-N，N- 二甲基丙烯酰胺)是在所述长链、短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)存在下、在含有7M尿素的TTE缓冲溶液中通过过硫酸铵(APS)/ 四甲基乙二胺(TEMED)在氮气保护下引发氧化还原自由基聚合得到的，从而获得丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物与线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的准互穿聚合物网络结构。其中也可以使用除过硫酸铵/四甲基乙二胺以外的本领域已知可用于聚合丙烯酰胺和N，N- 二甲基丙烯酰胺的其它氧化还原自由基聚合催化剂。本发明的聚合物链的准互穿聚合物网络合成方法简单，实验重复性好，通过氧化还原自由基聚合方法制备而成。反应后不需进一步分离纯化，可直接用于生物大分子物质， 例如DNA、RNA片段的分离，本发明上下文中所述的分子量均为粘均分子量。所述粘均分子量的测量方法如下所述聚合物的特性粘数(η)在NaCl溶液中用“乌式粘度计”测量，测量温度为30°C。 聚合物的粘均分子量(Mv)用Mark-Howink公式进行计算[1’2]。[ n] =9. 33X IO-3Mv0-75表1中举例说明了本发明中可以使用的短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)、长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和无规共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲丙基烯酰胺)的特性粘数(cP)和粘均分子量Mv(kDa)。
表 权利要求
1.一种聚合物链的准互穿聚合物网络，所述聚合物链包括(a)长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链，其粘均分子量在SOOkDa 1200kDa的范围，优选IOOOkDa ；(b)短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链，其粘均分子量在20kDa 60kDa的范围， 优�。缓�(c)丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链，所述无规共聚物在所述长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链(a)和所述短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链(b)的存在下通过将丙烯酰胺单体和N，N- 二甲基丙烯酰胺单体进行氧化还原自由基聚合制备， 所述无规共聚物的分子量大小在IMDa IOMDa的范围，优选为6MDa ；其中，所述长链、短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和所述丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链彼此缠结、互穿，形成聚合物链的准互穿聚合物网络，并且其中， 所述聚合物链的准互穿聚合物网络无化学交联。
2.权利要求1的聚合物链的准互穿聚合物网络，其中在所述丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链中，所述单体丙烯酰胺和所述单体N，N-二甲基丙烯酰胺的重量比为90 10 99. 9 0.1，优选为90 10 99 1，更优选为95 5。
3.权利要求1-2任一项的聚合物链的准互穿聚合物网络，其中所述无规共聚(丙烯酰胺-N，N- 二甲基丙烯酰胺)与所述长链聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)和所述短链聚(N，N- 二甲基丙烯酰胺)两者之和的重量比是50 50 99 1，优选为80 20 95 5，最优选为10 1。
4.权利要求1-3任一项的聚合物链的准互穿聚合物网络，其中所述长链聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和所述短链聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的重量比是5 1 1 1，优选为
5.制备权利要求1的聚合物链的准互穿聚合物网络的方法在长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链和短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链的存在下将丙烯酰胺单体和N，N- 二甲基丙烯酰胺单体进行氧化还原自由基聚合以得到所述长链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链、所述短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链和无规共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺)的准互穿聚合物网络，其中，所述长链线性聚 (N，N-二甲基丙烯酰胺)的粘均分子量在800kDa 1200kDa范围，优选IOOOkDa,所述短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的粘均分子量在20kDa 60kDa范围，优选36kDa，所述无规共聚(丙烯酰胺-N，N- 二甲基丙烯酰胺)的分子量大小在IMDa lOMDa，优选6MDa ；其中，所述长链、短链线性聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)链和所述无规共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺)链彼此缠结、互穿，形成聚合物链的准互穿聚合物网络，并且其中，所述聚合物链的准互穿聚合物网络无化学交联。
6.权利要求5的方法，其中在所述丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链中，所述单体丙烯酰胺和所述单体N，N-二甲基丙烯酰胺的重量比为90 10 99.9 0.1， 优选为90 10 99 1，更优选为95 5。
7.权利要求5-6任一项的方法，其中所述无规共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺) 与所述长链聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和所述短链聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)两者之和的重量比是50 50 99 1，优选为80 20 95 5，最优选为10 1。
8.权利要求5-7任一项的方法，其中所述长链聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和所述短链聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的重量比是5 1 1 1，优选为3 2。
9.通过前述权利要求5-8任一项的方法制备的聚合物链的准互穿聚合物网络。
10.一种使用毛细管凝胶电泳分离生物大分子物质的方法，其中使用前述权利要求 1-4和9中任一项的聚合物链的准互穿聚合物网络作为筛分介质，优选地，其中所述生物大分子物质是DNA，或者RNA。
全文摘要
本发明涉及用于毛细管凝胶电泳的筛分介质，以及制备和使用该筛分介质的方法。更具体地，本发明提供一种用作毛细管凝胶电泳筛分介质的准互穿聚合物网络，以及该准互穿聚合物网络的制备方法及用途。
文档编号G01N27/447GK102220599SQ20101021506
公开日2011年10月19日 申请日期2010年7月1日 优先权日2010年7月1日
发明者任媛媛, 佟景丽, 李丰, 李海峰, 李黎 申请人:北京六合华大基因科技股份有限公司, 深圳华大基因科技有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
