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专利名称：乙肝多位点基因检测试剂盒及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种体外诊断类医疗器械，具体是一种适用于乙肝病毒多位点耐药基因检测的试剂盒。
背景技术：
乙肝是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg携带者)超过2.8亿，我国约占1.3亿。据统计，目前我国有乙肝患者3000万。 目前治疗乙肝的重要抗病毒药物是核苷酸类似物，临床常用药有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。这类药物的使用可以有效延缓乙肝病情进展，为慢性乙肝的治疗带来了突破性的进展。但是这类药物用药期长，容易引起乙肝病毒变异，产生耐药性，影响疗效的稳定性。针对市场上缺乏乙肝多位点耐药性检测的相关产品，本发明提供的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，不仅操作简单，检测质量好，而且价格便宜，有利于医生在治疗病患时及时改变用药计划。

发明内容
乙肝多位点基因检测试剂盒包括DNA抽提试剂、PCR试剂、LDR试剂和标准品。DNA抽提试剂包括浓缩液和裂解缓冲液，只需准备IOOyL含乙型肝炎病毒血清，加入浓缩液100 μ L，12000rpm离心IOmin ；弃上清；加入25 μ L裂解缓冲液混勻， IOO0C IOmin裂解；最后12000rpm离心lOmin，上清即为所用的乙肝DNA样本。PCR试剂包括两对PCR正向引物和反向引物、Taq聚合酶、聚合酶缓冲液、 dNTP和MgCl2。PCR引物序列如下，正向引物1 :CTACCAGCACGGGACCATGC ；反向引物 1CAAGATGTTGTACAGACTTGG ；正向弓丨物 2 GTCCCTTTTTACCTCTATTACCA ；反向弓丨物 2 TACATGCATATAAAGGCATTGAGG。PCR 扩增体系为10 X PCR Buffer 2μ L ； 50mM MgCl22. 4 μ L ； IOmM dNTP Mix 2μ L ；2U/y L DNA 聚合酶 0. 5 μ L ； IO3-IO7 滴度的 DNA template 2μ L ；2mM 的引物2 μ L ；ddH20 9. 1 μ L。PCR扩增的反应条件95°C 15min变性和酶激活；94°C 15s变性，50-60°C 0. 5-1. 5min 退火，72°C 0. 5-1. 5min 延伸，循环 35 次；最后 72°C 5min 延伸。LDR试剂包括相关位点的探针、Taq连接酶和连接酶缓冲液。LDR探针设计时引入了通用荧光标记探针方案，降低了试剂盒的制造成本。LDR探针包括通用荧光标记探针、通用模板、标记探针和检测探针，其中通用荧光标记探针和通用模板具有极高的特异性，通用荧光标记探针序列为GCATCACTCAGAGGG;通用模板序列为 CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG。通用荧光标记探针已经具有5‘磷酸化和3'荧光标记，利用通用模板分别与通用荧光标记探针、标记探针互补配对，实现通用荧光标记探针对标记探针的荧光标记。标记探针包含三个部分，一部分为和模板配对部分，另一部分为随机序列用于调整探针的长度，最后一部分则为和通用模板配对部分。检测探针包括两部分，一部分为和模板配对部分，另一部分则为随机序列用于调整LDR产物长度。标记探针和检测探针的序列见表1。LDR扩增反应体系为10X连接酶配套缓冲液1 μ L ；2mM探针1 μ L ；2U/μ LTaq连接酶 0. 2 μ L ；PCR 产物 1 μ L ；CldH2O 7 μ L。LDR 反应条件为94°C 2min 充分变性；94°C 15s 变性，55°C 2min连接，循环15次。表1 LDR探针序列
权利要求
1.一种乙肝多位点基因检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括DNA抽提试剂、PCR试剂、LDR试剂和标准品；DNA抽提试剂为DNA浓缩裂解试剂，包括浓缩液和裂解缓冲液；PCR 试剂包括两对PCR正向引物和反向引物、Taq聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTP和MgCl2 ；LDR试剂包括相关位点的探针、Taq连接酶和连接酶缓冲液，相关位点为rtL180M，YMDD/YIDD, YVDD, rtA181V/T, rtN236T, rtT184G, rtS202I 和 rtM250V ；标准品为野生型 HBV DNA。
2.根据权利要求1所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，其特征在于PCR扩增位点包括拉米夫定、替米夫定、阿德福韦和恩替卡韦的耐药位点，所用引物序列为正向引物 1 CTACCAGCACGGGACCATGC,反向引物 1 CAAGATGTTGTACAGACTTGG,正向引物 2 GTCCCTTTTTACCTCTATTACCA，反向引物 2 TACATGCATATAAAGGCATTGAGG
3.根据权利要求1所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，其特征在于PCR扩增体系为10 XPCR Buffer2y L ；50mM MgCl22. 4 μ L ；IOmM dNTP Mix 2 μ L ;2U/μ LDNA 聚合酶 0. 5μ L ;103-107 滴度的 DNA template2 μ L ;2mM 的引物 2 μ L ;ddH20 9. 1 μ L。
4.根据权利要求1所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，其特征在于PCR扩增的反应条件:95°C 15min变性和酶激活；94 °C 1 变性，50_60°C 0. 5_1.5min退火， 72 °C 0. 5-1. 5min延伸，循环35次；最后72 °C 5min延伸。
5.根据权利要求1所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，其特征在于 LDR探针的设计引入通用荧光标记探针方案，其中通用荧光标记探针和通用模板都具有极高的特异性，序列为通用荧光标记探针GCATCACTCAGAGGG ；通用模板 CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG。
6.根据权利要求1所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，其特征在于标记探针包含三个部分，一部分为和模板配对部分，另一部分为随机序列用于调整探针的长度，最后一部分则为和通用模板配对部分；检测探针包括两部分，一部分为和模板配对部分，另一部分则为随机序列用于调整LDR产物长度；序列如下
7.根据权利要求1所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，其特征在于LDR扩增的反应体系为10X连接酶配套缓冲液1 μ L ；2mM探针1 μ L ;2U/y L Taq连接酶0. 2 μ L ；PCR产物 1 μ L ；ddH20 7 μ L。
8.根据权利要求1所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，其特征在于LDR反应条件为:94°C 2min充分变性；94°C 15s变性，55°C 2min连接，循环15次。
9.制备权利要求1-11任一项所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，包括以下步骤 制备乙肝DNA提取试剂E1试剂为浓缩液，25人份，共2. 5ml ；E2试剂为裂解缓冲液，25人份，共625yL ；制备 PCR 试剂=PI 试剂包括 10XPCR Buffer、dNTP、MgCl2、引物、ddH20, 25 人份，一共 486 μ L ；PE试剂包括G酶、UNG酶，25人份，一共27 μ L ；制备LDR试剂L1、L2试剂包括IOX连接酶配套缓冲液、探针、ddH20，25人份，各 216 μ L ；LE试剂包括Taq连接酶，25人份，一共5. 4 μ L ；制备标准品标准品为野生型HBV DNA, 25人份，共50 μ L。
10.使用权利要求1-11所述的一种乙肝多位点基因检测试剂盒，包括以下步骤 乙肝DNA提取准备100 μ L含乙型肝炎病毒血清，加入浓缩液EllOO μ L，12000rpm离心IOmin ；弃上清；加入25 μ L裂解缓冲液Ε2混勻，100°C IOmin裂解；最后12000rpm离心 lOmin，上清即为所用的乙肝DNA样本；PCR扩增在200μ 1的PCR薄壁管中，加入17μ 1试剂ΡΙ，1μ 1试剂ΡΕ，2μ 1样本DNA， 充分混勻后短暂离心，最后加入20 μ 1石蜡油进行PCR扩增；LDR扩增取2个200 μ 1 PCR薄壁管，在管1中加入9 μ 1试剂Ll和0. 2 μ 1试剂LE，， 在管2中加入9 μ 1试剂L2和0. 2 μ 1试剂LE，最后在管1和管2中分别加入1 μ IPCR产物，充分混勻后短暂离心，最后加入10 μ 1石蜡油进行LDR扩增；毛细管电泳在每个上样孔中加入10 μ ILoading Buffer, 0. 25 μ 1内参标EMandard R0X，最后加入0. 5 μ 1的Ll产物和0. 5 μ 1的L2产物，充分混勻后上样，进行测序胶电泳。
全文摘要
本发明公开了一种乙肝多位点基因检测试剂盒及其制备和使用方法，该试剂盒包括DNA抽提试剂、PCR试剂、LDR试剂和标准品；DNA抽提试剂为DNA浓缩裂解试剂，包括浓缩液和裂解缓冲液；PCR试剂包括两对PCR正向引物和反向引物、Taq聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTP和MgCl2；LDR试剂包括相关位点的探针、Taq连接酶和连接酶缓冲液，相关位点为rtL180M，YMDD/YIDD，YVDD，rtA181V/T，rtN236T，rtT184G，rtS202I和rtM250V；标准品为野生型HBV DNA。
文档编号G01N21/64GK102409108SQ20101028865
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者陆炯 申请人:上海松茸生物科技有限公司