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专利名称：利用了Dao1^-/-小鼠的D-氨基酸相关疾病的评价筛选方法
技术领域：
本发明涉及试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞造成 的影响的评价方法、用于实施该评价筛选方法的评价系统、和使用该评价系统的医药品和/ 或化妆品候补物质。
背景技术：
除甘氨酸以外的全部氨基酸均存在D型和L型这2种光学异构体。L-氨基酸用于 生物的蛋白质合成，蛋白质中所含的氨基酸大部分是L-氨基酸。与此相对，D-氨基酸存在 于部分低等生物的生理活性肽中，很多都是经由翻译后修饰的过程而被生物合成。因此，构 成蛋白质或肽的氨基酸主要是L-氨基酸，D-氨基酸是例外的存在。D-氨基酸是细菌的细胞壁的肽聚糖的构成成分。此外，关于不构成肽的游离的 D-氨基酸，一直以来报道存在于水栖动物、昆虫等低等动物中。但是，有一段时期相信存在 于高等动物中的氨基酸为L型、D型仅微量存在(非专利文献1)。非专利文献1 =Corrigan J. J. ,Science 164 :142-149(1969)但是，关于包括人在内的哺乳动物类中的D-氨基酸的存在和其作用，由于近年来 的以光学拆分法为首的分析方法的进步而终于得到阐明(非专利文献幻。通过使用了抗 D-天门冬氨酸抗体的双重染色法等，从而阐明了 D-天门冬氨酸在大鼠脑垂体中局部存在 于产生催乳素的细胞中。此外，通过对大鼠脑垂体来源的细胞株中合成、分泌催乳素的细胞 给予D-天门冬氨酸，从而催乳素分泌出现用量依赖性增加。根据以上事实可以认为，在产 生催乳素的细胞中D-天门冬氨酸控制着催乳素的分泌(非专利文献3)。非专禾Ij文献 2 :Hamase K, Morikawa A, and Zaitsu K.、J Chromatogr B 781 73-91 (2002)非专利文献3:D' Aniello A 等、FA SEB J 14 :699-714(2000)另一方面，据报道，在大鼠精巢的静脉中总是检测到比其他静脉血更高浓度的 D-天门冬氨酸，而且通过对从大鼠精巢分离、纯化得到的Leydig细胞给予D-天门冬氨酸， 睾酮的合成及分泌得到用量依赖性促进(非专利文献4)。非专利文献4 =Nagata Y 等、^BS Lett. 444 160-164 (1999)据报道，D-丝氨酸选择性地刺激推测与精神分裂症有关的NMDA受体的甘氨酸结 合位点，通过增强介由谷氨酸的该受体发挥的作用，从而促进神经传导(非专利文献幻。实 际上报道了通过投与D-丝氨酸来改善精神分裂症，以及精神分裂症患者血清中的D-丝氨 酸浓度低于健康人。非专利文献5 :Nishikawa T.Biol. Pharm. Bull. 28 :1561-1565(2005)作为与皮肤科学相关的认识，有报道称D-天门冬氨酸存在于像晶状体那样的不 易发生蛋白质代谢的组织中(非专利文献6)。此外，有报道称D-天门冬氨酸在皮肤中存 在于老年受试者的受日晒的皮肤的弹性纤维中，但不存在于没有受日晒的皮肤的弹性纤维 中，所以暗示了 UV暴露与皮肤的弹性纤维中的D-天门冬氨酸形成是强烈相关的(非专利文献7)。非专利文献6:Fujii N.Biol. Pharm. Bull. 28 :1585-1589(2005)非专禾Ij文献 7:Fujii N.等、Biochem. Biophys. Res. Commun. 294， 1047-1051(2002)然而，在探索包括人在内的哺乳类中的D-氨基酸的存在及作用的过程中，较大障 碍是D-氨基酸快速分解。在D-氨基酸的分解中，首先，D-氨基酸通过D-氨基酸氧化酶(EC 1.4. 3. 3，以下称为“DA0酶”。)而发生氧化脱氨基化，转变成对应的α-酮酸。然后α -酮 酸通过转氨酶而转变成对应的L-氨基酸。DAO酶是仅特异性地氧化D-氨基酸的酶，在肾脏 及其他脏器中表达(非专利文献8)。非专禾丨J文献 8 :Hamase K. , Konno R. , Morikawa A. and Zaitsu K.、Biol. Pharm. Bull. 28 :1578-1584(2005)DAO酶在小鼠中由第5染色体上的Daol基因编码，已报道了 ddY小鼠中的该基因 的错义突变体(非专利文献9)。在该突变基因(Daoe或Da,8，中，第181位的Gly残基 被置换成Arg残基，产生丧失了酶活性的蛋白质。因此，失去DAO酶活性的表型进行隐性遗 传。在隐性纯合体的个体(以下称为“DA0酶缺损小鼠”。)中D-丙氨酸及D-丝氨酸的血 中浓度上升至5 8倍，表现出共济失调(ataxia)及定型行为(stereotypic behavior) (非专利文献10)。关于DAO酶缺损小鼠与其他疾病模型小鼠的交配实验未有报道。非专利文献 9 =Konno R. and Yasumura Y.、Genetics 103 :277-285(1983)# # ^lJ i K 10 :Hashimoto Α. ， Yoshikawa Μ. ， Niwa A. and Konno R. 、Brain Res.1033 :210-215(2005)

发明内容
发明要解决的问题需要从DAO酶缺损小鼠与其他疾病模型小鼠的交配实验中生产的多个动物中迅 速筛选Day/DaJ—的纯合体。此外，由于有时D-氨基酸的存在量只有L-氨基酸的存 在量的约以下，所以需要从大量的L-氨基酸中分离并检测出微量的D-氨基酸。进而， 需要迅速地对多个小鼠个体来源的样品、多个不同组织来源的样品、多个暴露于试验条件 下的样品中所含的D-氨基酸进行定量测定。用于解决问题的方案本发明提供试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞造成 的影响的评价方法。前述评价筛选方法包括以下步骤(1)准备具有Dao 的基因型的小 鼠、和具有Daol+的基因型的小鼠的步骤；(2)将前述具有Daol+/+的基因型的小鼠、和前述 具有Daol+的基因型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞暴露于前述试 验条件下的步骤；和(3)对将前述具有Daol+/+的基因型的小鼠、和前述具有Daol+的基因 型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞暴露于前述试验条件下所造成的 影响进行分析的步骤。本发明的评价方法中，前述步骤⑴有时通过Da0lV+、V_*/或+的基因型的判 定方法筛选前述具有Daol+/+的基因型的小鼠、和前述具有Daol+的基因型的小鼠。前述判 定方法有时包括以下步骤对Daol+/+,和/或+的基因型的小鼠进行个体识别的步骤；从前述经个体识别的小鼠个体中分别提取染色体DNA的步骤；对前述提取的染色体DNA中包 含第7外显子的区域进行扩增从而获得扩增DNA片段的步骤；将前述扩增DNA片段用HpaII 限制酶进行消化的步骤；以及，对前述扩增DNA片段的限制酶消化产物进行分析的步骤。本发明的评价方法中获得前述扩增DNA片段的步骤有时包括使用由序列号1及 2中列举的核苷酸序列构成的寡核苷酸引物进行扩增。本发明的评价方法中，前述具有Daol+/+的基因型的小鼠与具有Daol+的基因型 的小鼠，对于其他基因中的至少1个而言，有时等位基因的组合是相同的。本发明的评价方法中，前述其他基因的等位基因的组合有时包括Hr+。前述步骤(3)有时包括在前述步骤(2)之前，测定前述具有Daol+/+的基因型的 小鼠、和前述具有Daol+的基因型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞中 的D-氨基酸含量；在前述步骤( 之后，在暴露于前述试验条件下后，测定前述具有DaoIv+ 的基因型的小鼠、和前述具有Daol+的基因型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养 组织细胞中的D-氨基酸含量；以及，对前述步骤( 之前测定的D-氨基酸含量、和前述步 骤( 之后测定的D-氨基酸含量进行比较。本发明的评价方法中，前述D-氨基酸含量有时通过使用光学拆分柱的柱色谱法 进行测定。本发明的评价方法中，前述D-氨基酸含量有时通过使用识别光学异构体的单克 隆抗体的免疫学方法进行测定。通过本发明的评价方法来评价试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的 培养组织细胞造成的影响的D-氨基酸有时为D-脯氨酸。前述测定D-氨基酸含量的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞有时为选 自由真皮、表皮、肾脏、胰腺、精巢、肾上腺、小脑、脑垂体及血清组成的组中的1种或2种以 上的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞。通过本发明的评价方法来评价试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的 培养组织细胞造成的影响的D-氨基酸为D-脯氨酸，该D-脯氨酸有时通过使用光学拆分柱 的柱色谱法而测定，前述活体组织为真皮或表皮。本发明提供用于实施本发明的评价方法的评价系统。前述评价系统包括具有 Daol+/+及Hr+的基因型的小鼠、具有Daol+及Hr+的基因型的小鼠、由序列号1及2中列 举的核苷酸序列构成的寡核苷酸引物、和识别脯氨酸的光学异构体的光学拆分柱。本发明提供一种医药品和/或化妆品的候补物质的筛选方法，其特征在于，通过 本发明的评价系统来评价医药品和/或化妆品的候补物质。本说明书中记载为Daol的基因是称为D-氨基酸氧化酶1的小鼠的基因，美国 Jackson石if究所的Mouse Genome Informatics Project 的主页(http://www. informatics. jax.org/javawi2/servlet/WIFetch ？ page = markerDetail&key = 7803)中公幵了 详细说明。作为 Daol 基因的突变，已知有 DaolG181R(http://www. informatics, jax. org/ searches/allele—report, cgi ？ _Marker_key = 7803&int :_Set_key = 847160)。本发明 中的Daol_的基因型包括Daof，但并不限定于此，是指任一 D-氨基酸氧化酶1的酶活性 缺失突变等位基因的基因型。本发明中的Daol+的基因型是指如下等位基因的基因型，所述 等位基因对于D-氨基酸氧化酶1酶而言，与野生型、即Daol基因所编码的蛋白质的第181位的氨基酸残基为甘氨酸的酶相同、或者实质上相同，D-氨基酸的分解以与野生型相同或 者实质上相同的程度进行。本发明中的具有Daol+及-的基因型的小鼠有时具有其他任一基因的等位基因。前 述其他基因有时纯合体具有特异性表型，有时杂合体具有特异性表型。因此，本发明中，有 时在对于前述其他基因中至少1个基因而言等位基因的组合相同的条件下，对具有Daolv+ 的基因型的小鼠和具有Daol+的基因型的小鼠，进行试验条件对小鼠的活体组织或该活 体组织来源的培养组织细胞中的D-氨基酸含量造成的影响的评价。前述试验条件造成的 影响有时是指前述试验条件对Daol基因型的作用的差异造成的影响，所述作用的差异是 Daol基因型对前述其他基因中至少1个基因的等位基因的第1组合的表型性状和该等位基 因的第2组合的表型性状的作用的差异。前述其他基因除了表示疾病模型的表型的情况以外，也可以是参与D-氨基酸的 合成或分解的代谢途径的基因、或与老化、免疫、应激反应、营养、运动、感觉、记忆、行动、 血液循环、消化、排泄、生殖及其他小鼠的各脏器或全身的健康有关的任意基因。前述其 他基因有时是包括但不仅限于下述疾病模型小鼠的原因基因(causal gene)例如肥胖小 鼠(I^p°b/I^p°b)、胸腺依赖性免疫缺陷小鼠(F0xnlnu/F0xnlnu)、快速老化小鼠Genescence Accelerated Mouse、SAMPl/TaSlc, SAMP6/TaSlc、SAMP8/TaSlc 和 / 或 SAMPlO/TaSlc)关 节炎自然发病小鼠(LaqlMK7Laql·)及无毛小鼠(Hr1VHrto)。根据约翰斯·霍普金斯大 学的Online Inheritance of Man的主页，认为Hr基因的产物是参与体毛形成的转录因 子(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi ？ id = 602302)。前述 Mouse Genome Informatics Project的主页报道了，在小鼠中，除了 Hrta^P样的因MLV原病毒 的插入导致的自发突变体以外，还有因转基因的插入及其他偶然性制成的突变体和基因 敲除小鼠等若干等位基因(http //www. informatics, jax. org/imsr/fetch ？ page = imsrSummary&op :gsymname = % 3D&gsymname = Hr&gsymnameBreadth = C)。本发明中的 Hr-的基因型包括Hrto，但并不限定于此，是指任意的由于Hr基因产物的功能缺损而导致的 Hrhr的纯合体的成体中没有体毛的基因型。本发明中，在前述其他基因中至少1个基因的等位基因的组合相同的条件下，进 行试验条件对D-氨基酸含量造成的影响的评价时，在本发明的评价方法中的步骤(1)中， 除了 Da0lv+、+/和/或+基因型的判定方法以外，有时还包括对于前述其他基因中至少1 个基因的基因型进行判定。在本发明的评价方法中的步骤(1)通过Da0lv+、+/_和/或+基因型的判定方法 进行筛选的情况下，小鼠的个体识别通过对小鼠的饲养笼和/或小鼠的身体进行标记来实 施。小鼠的身体的标记可以采用耳朵的打孔、高频及其他标记用芯片在体内的植入及其他 本领域技术人员公知的任意方法进行。本发明的评价方法的步骤(1)中的Da0l+A、+/-和/或+基因型的判定可以按照 任意步骤进行。Daol基因型的判定通过从各小鼠个体中回收少量的活体组织及其他生物 学材料，并对其中所含的Daol基因或其基因产物进行分析来进行。优选的Daol基因型 的判定方法是能够辨别编码Daol基因产物的第181位的氨基酸残基的Daol基因序列的 方法。从小鼠个体回收染色体DNA、和Daol基因型的分析可以采用本领域技术人员公知 的任意方法。Daol基因型的分析有时采用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链
7反应)法、SMAP (Smart Amplification Process)法、LAMP (Loop-mediated isothermal amplification，环介导恒温扩增)法等基因扩增法。Daol基因的不同基因型的辨别有时通 过特定的限制酶对染色体DNA或扩增的DNA有无切断、以及寡核苷酸引物的不同有无引起 扩增来进行。前述特定的限制酶的切断的有无和/或扩增的有无可以如下进行分离扩增 的DNA、或者分离限制酶消化后的染色体DNA后，使用能够检测前述特定的限制酶的切断位 点有无切断的探针并通过southern印迹法获得与该探针反应的电泳带图案。优选的Daol 基因的不同基因型的辨别是以下说明的基因扩增法。本发明的评价方法中利用基因扩增法来辨别Daol基因的不同基因型时，利用了 限制酶HpaII识别Daol基因的突变位点的特点。图1是本发明的Daol基因型的判定方法 相关的核苷酸序列的比对图。图1表示Daol基因的染色体DNA序列(Daol_gen0mic)中从 Daol基因的转录起始点起第15111位碱基与第15460位碱基之间的野生型序列(序列表的 序列号4)、包括Daof突变体中的点突变(从转录起始点起第15223位的鸟嘌呤置换成 腺嘌呤。)的第7外显子部分的cDNA的野生型序列(序列表的序列号3的第625位 7 位的碱基)、本发明的实施例中使用的基因扩增用引物(正向引物(序列号1)及反向引物 (序列号2))、和限制酶HpaII的识别序列的比对结果。另外，序列表中序列号5列举了反 向引物序列的反向互补序列(反向引物*)。图2是本发明的Daol基因型的判定方法中采 用的DNA区域的HpaII限制酶图谱(restriction map)。野生型染色体DNA的第7外显子 中存在3处HpaII切断位点(向下的箭头)。其中5’最末端侧的HpaII识别序列(CCGG) 在Daof突变型小鼠染色体DNA中变成CCAG，HpaII无法识别(*)。第7外显子区域通 过位于第6内含子中的正向引物(i^rward)和位于第7内含子中的反向引物(Reverse)而 扩增。用HpaII消化野生型小鼠基因组DNA来源的扩增产物(野生型)和前述突变型小鼠 基因组DNA来源的扩增产物(DaolG181K)时，分别在三处及两处被切断。本发明的评价方法中的D-氨基酸含量的测定可以采用本领域技术人员公知的任 意方法来实施。例如，预先用邻苯二甲醛(ΟΡΑ)、N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸(Boc-L-Cys) 及其他修饰试剂将D-及L-氨基酸立体异构特异性地衍生，然后，用0DS-80TsQA那样的分 析柱用IOOmM的醋酸盐缓冲液(ρΗ6. 0)和乙腈的混合液进行梯度洗脱并分离的方法，该方 法可以用于同时测定天门冬氨酸、丝氨酸及丙氨酸的D型及L型。此外，预先用4-氟-7-硝 基-2，1，3_苯并氧杂噁二唑(NBD-F)那样的荧光试剂将D-及L-氨基酸衍生，然后，用 0DS-80TsQA、MightysilRP-ISGP等那样的分析柱立体异构非特异性地分离各氨基酸后，用 Pirkle型手性固定相柱(例如Sumichiral 0A-2500S或R)进行光学拆分而进行立体异构 特异性分离的方法，该方法可以用于脯氨酸、亮氨酸及其他氨基酸的微量测定(浜濑健司 及财津洁、分析化学、53卷、677-69(K2004))。本说明书中的光学拆分柱系统是指至少使 用了光学拆分柱的分离分析系统，有时也包括利用光学拆分柱以外的分析柱的分离分析。 作为其替代，可以通过使用了识别氨基酸的光学异构体的单克隆抗体、例如与D-亮氨酸、 D-天门冬氨酸等特异性结合的单克隆抗体的免疫学方法对D-氨基酸进行定量(日本特愿 2008-27650 说明书)。本发明中的试验条件是指对待测动物全身或局部进行的物理、化学和/或生物学 处理条件。前述物理处理包括包含紫外线及红外线的光线或电磁波、声音、振动及包括失 重的加速度、温度、利用温水或冷水的水浴、干燥或湿润等，但并不限定于这些。化学处理包括氢离子、无机物质和/或有机物质的适用，但并不限定于这些。生物学处理包括食饵、水 等的摄取、明暗周期、笼面积、笼的种类、同一笼中饲养的动物个体数量及其他饲养环境、药 物的投与等，但并不限定于这些。本发明中的试验条件有时为前述任一处理或其组合，有时 连续和/或间断地实施各处理。本发明的评价方法中的D-氨基酸含量的测定中，“在前述步骤(2)之后，在暴露于 前述试验条件下后，测定前述具有Daol+/+的基因型的小鼠和前述具有Daol+的基因型的 小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞中的D-氨基酸含量”包括在前述试验 条件下的暴露结束后测定D-氨基酸含量的情况；和在前述试验条件下暴露的过程中测定 D-氨基酸含量的情况。根据本发明的评价方法，可以评价前述试验条件对来源于具有Daol+/+的基因型的 小鼠和具有Daol+的基因型的小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞的各种 特性造成的影响。可以评价前述试验条件对下述特性造成的影响D_氨基酸含量的变动； 代谢途径中与D-氨基酸相关的其他物质、例如L-氨基酸、α酮酸等的含量的变动；与这些 物质的代谢、消化吸收、分解排泄相关的消化器官、肝脏、肾脏、循环器官等的生理和/或病 理特性，以及与包括对花粉、室内尘埃及其他的过敏、特应性皮炎、皮肤及其他脏器的移植 免疫在内但并不限定于这些的免疫相关的特性的变动；与感染微生物或与微生物的共存相 关的特性的变动；行动、记忆、感觉及其他神经生物学特性的变动；与癌和/或细胞增殖的 亢进和/或抑制相关的特性的变动；与皮肤及其他脏器的老化相关的特性，例如与皱纹、脱 毛等相关的特性；与保湿性、屏障特性、及其他皮肤的健康和/或美容相关的特性。


图1是与本发明的Daol基因型的判定方法相关的核苷酸序列的比对图。图2是本发明的Daol基因型的判定方法中采用的DNA区域的HpaII限制酶图谱。图3-1是由已根据Daol酶活性确认了的Daolv+纯合体小鼠(第1泳道)、Dao Igisw G181E纯合体小鼠(第4泳道)及Daol—Fl代杂合体小鼠(第2及3泳道)的染色体DNA 来源的扩增产物的HpaII分解片段的电泳图案。图3-2 是无毛小鼠(Hrh7Hrto、Da0r")与 Daol 酶缺损小鼠(Hr+A、Da0lG181KA;i81K)交 配的F2代中具有无毛表型的12只F2代小鼠个体的染色体DNA来源的扩增产物的HpaII 分解片段的电泳图案。图4-1是脯氨酸及4-羟基脯氨酸的光学异构体。图4-2是同时分析脯氨酸及4-羟基脯氨酸的光学异构体的系统的柱流路图。图5是同时分析脯氨酸及4-羟基脯氨酸的光学异构体的系统的第1及第2柱的 洗脱图谱的波形图(Dl及D2)。图6-1是Daol基因的野生型纯合体小鼠(Daolv+)血清中的L-型及D-型脯氨酸 的光学拆分柱的洗脱图谱。图6-2是Daol酶活性缺损型纯合体小鼠(Dao 1G18WG181K)血清中的L-型及D-型脯 氨酸的光学拆分柱的洗脱图谱。图7-1是表示基因型被判定为Daol+/+及Daol—w的个体的各种脏器中的D-脯 氨酸存在量的柱形图。
图7-2是对真皮中的D-脯氨酸存在量进行比较的柱形图。图8是研究Daol酶缺损小鼠中的肿瘤细胞的增殖的柱形图。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细说明。本发明的技术范围已通过权利要求书进行了限定， 本发明的实施例只是例示。实施例1Daol+/\ +/和/或+基因型的判定方法的开发DaolG181E是序列号3中列举的Daol基因的cDNA的核苷酸序列中第661位的鸟嘌 呤置换成腺嘌呤的突变。因此，在野生型中成为限制酶HpaII的切断序列(C丨CGG)，与此 相对，在Daof突变体中变成CCAG而不被切断。这里，包含突变位点的第625-7 位的 核苷酸包含于第7外显子中(GenBank登记号NM_010018. 2)，所以在染色体DNA中也能够通 过HpaII切断位点的有无来识别野生型或突变型。对断乳后的小鼠进行个体识别后，用市售的哺乳类基因组DNA小量提取试剂盒 (Miniprep Kit) (Sigma、G1N70-1 KT)从各小鼠个体的尾巴中提取染色体DNA并进行纯 化。作为正向引物，使用位于第6内含子中的由序列号1的核苷酸序列构成的寡核苷酸， 作为反向引物，使用位于第7内含子中的由序列号2的核苷酸序列构成的寡核苷酸。用市 售的反应混合液(PromegaKK.、M7122)，在(1) 94°C、4 分钟、1 次、(2) 94°C、30 秒钟、55°C、 30秒钟、72°C、30秒钟、40次、(3) 72°C、10分钟、1次、(4) 4°C、保存的热循环设定下对小鼠 染色体DNA进行扩增。对于PCR反应产物，用市售的试剂盒(QIAGENJ8104)进行纯化，在 HpaII (T0Y0B0.HPA201)存在下，在37°C下孵育3小时，进行限制酶处理。通过70°C、5分钟 的加热使限制酶失活后，通过市售的电泳微芯片(安捷伦、2100 Bioanalyzer)分析DNA片 段的长度。图3-1是由已根据Daol酶活性确认了的Daolv+纯合体小鼠(第1泳道)、Dao Igisw G181E纯合体小鼠(第4泳道)及Daol—Fl代杂合体小鼠(第2及3泳道)的染色体DNA 来源的扩增产物的HpaII分解片段的电泳图案。由图3-1可知，由Daol+基因的染色体DNA 获得95bp的DNA片段，由DaolG181K基因的染色体DNA获得107bp的DNA片段，所以野生型 纯合体、突变型纯合体及杂合体被清楚辨别。图3-2是对无毛小鼠(HrhVHrh1^ Daol+/+)与 Daol酶缺损小鼠(Hr+/+、Da0lG181KA;i81K)交配的F2代中具有无毛表型的12只F2代的小鼠个 体进行Daol基因判定的结果。表1是对具有无毛表型的138只F2代的小鼠个体的Daol 基因型及性别进行整理得到的表。[表 1]F2代无毛小鼠(Hr"-)Daol+/+Daol+z-Daol"-395544FMFMFM182131242222F为雌性，M为雄性。如上所述，根据本判定方法，能够快速判定多个小鼠个体的Daol基因型。实施例2脯氨酸及4-羟基脯氨酸的光学异构体的定量分析方法的开发皮肤胶原中含有很多脯氨酸及4-羟基脯氨酸。因此，开发了对于脯氨酸及4-羟 基脯氨酸这两者能够同时分离全部光学异构体并进行定量分析的方法。图4-1表示脯氨酸及4-羟基脯氨酸的光学异构体。脯氨酸的光学异构体只有 L-型和D-型这2种，但4-羟基脯氨酸的光学异构体除了 L-型和D-型的区别以外，还有反 式和顺式的区别，总计有4种。首先，用荧光试剂NBD-F将氨基酸衍生而进行荧光标记。然 后，如图4-2所示，用第1柱进行反相分离色谱，检测反式-4-羟基脯氨酸、顺式-4-羟基脯 氨酸及脯氨酸的各峰。然后，通过柱转换阀收集前述各峰的级分，并导入到第2柱中进行光 学拆分色谱。图5的ID的波形图是对使用了流速40 μ L/分钟的溶剂的整体(monolithic) ODS 柱的洗脱图谱照射470nm的激发光以530nm的荧光发光进行检测得到的图。2D的波形图是 自动检测ID的洗脱图谱的反式-4-羟基脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸及脯氨酸的各峰并进 行阀切换而仅将各峰的级分导入到QN-2-AX柱中进行光学拆分色谱得到的结果。图6-1的波形图是Daol基因的野生型纯合体小鼠(Daolv+)血清中的L-型及 D-型脯氨酸的光学拆分柱的洗脱图谱，图6-2的波形图是Daol酶活性缺损型纯合体小鼠 (DaolG181E/G181E)血清中的L-型及D-型脯氨酸的光学拆分柱的洗脱图谱。D-脯氨酸在Daol 野生型纯合体小鼠中基本未检测到，但在Daol酶活性缺损型纯合体小鼠中被明显检测到。图7-1是实施例1中辨别的无毛小鼠与Daol酶活性缺损小鼠交配的F2代的无毛 小鼠中基因型被判定为Dao 及DaofW的个体的各种脏器中的D-脯氨酸存在量的 比较结果，图7-2是真皮中的D-脯氨酸存在量的比较结果。关于图7-1的图表的纵轴的单 位，血清为pmol/ μ L，其他组织为pmol/mg。图7-2的图表的纵轴的单位为nmol/ μ gDNA。 均表示各5只小鼠的脏器的测定值的平均和标准误差(SE)。除血清以外，在脑垂体、肾上 腺、胰腺及真皮中，在Daol酶活性缺损小鼠的情况下，也存在比野生型小鼠多数倍以上的 D-脯氨酸。此外，在具有Daol酶活性的野生型小鼠的小脑、肾脏及肝脏中D-脯氨酸几乎未 被检测到，但在Daol酶活性缺损小鼠中D-脯氨酸被明显检测到。Daol酶活性缺损小鼠的 精巢中的D-脯氨酸量与野生型小鼠相比仅多少许，没有明显差别。此次首次阐明了在皮肤 中Daol酶活性缺损小鼠中D-氨基酸含量也多于野生型。从此明确了紫外线照射、老化对 皮肤中的D-氨基酸含量的影响。另外，在这次的分析中，关于D-4-羟基脯氨酸的含量，顺式-异构体及反式-异构体在全部组织中均为检测限以下。实施例3Daol酶缺损小鼠中的肿瘤增殖用添加有10%胎牛血清(Irvine Scientific、批次 #300A80601)的 DMEM(Sigma) 培养基，在5%C02、37°C的加湿条件下培养Swiss Webster Sarcoma 180株的肉瘤细胞。调 制IxlO7个/mL的悬浮液，通过皮内注射各移植0. 05mL到Daol酶缺损小鼠或野生型小鼠 的右后肢足肉垫中。移植后每周用游标卡尺测量肿瘤的长径、短径及厚度，通过以下的式子 计算出肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)=长径(mm) X短径(mm) X (厚度(mm)-3)这里厚度是将原来的足的厚度设为3mm并以与该3mm的差作为肿瘤的厚度。结果如图8所示。图8是对Daol酶缺损小鼠和对照小鼠移植后经过1、2及3周 时的肿瘤体积的变化进行比较的柱形图。对照小鼠中移植后1周肿瘤体积已经为60mm3，3 周增加至2倍，与此相对，在Daol酶缺损小鼠中，移植后1周肿瘤体积仅为约20mm3，2周时 减少至5mm3左右，3周时完全消失。该结果表明，在Daol酶缺损小鼠具有抑制移植后的肿 瘤的增殖并使肿瘤消失的活性。这次建立的无毛小鼠与Daol酶缺损小鼠的交配实验体系，可以期待今后广泛用 于阐明D-氨基酸对红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎、干燥综合征、结节性多动脉炎、白塞氏病、风 湿性关节炎等胶原病或胶原病的近缘性疾病、糖尿病、日光性皮炎、接触性皮炎、褥疮、老人 斑、暗淡、皱纹、松弛等其他皮肤外观问题所发挥的作用。
权利要求
1.一种试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞造成的影响的 评价方法，其特征在于，包括以下步骤(1)准备具有Daol+/+的基因型的小鼠和具有Daol+的基因型的小鼠的步骤、(2)将所述具有Dao的基因型的小鼠和所述具有Daol+的基因型的小鼠的活体组 织或该活体组织来源的培养组织细胞暴露于试验条件下的步骤、和(3)对将所述具有Daol+/+的基因型的小鼠和所述具有Daol+的基因型的小鼠的活体 组织或该活体组织来源的培养组织细胞暴露于所述试验条件下造成的影响进行分析的步 马聚ο
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述步骤(1)包括通过Daolv+:-和 /或+基因型的判定方法来筛选所述具有Dao 的基因型的小鼠和所述具有Daol+的基 因型的小鼠，所述判定方法包括以下步骤对Daol+/+、+/和/或+的基因型的小鼠进行个 体识别的步骤、从所述经个体识别的各个小鼠个体提取染色体DNA的步骤、对所述提取的 染色体DNA中包含第7外显子的区域进行扩增从而获得扩增DNA片段的步骤、将所述扩增 DNA片段用HpaII限制酶进行消化的步骤、和对所述扩增DNA片段的限制酶消化产物进行分 析的步骤。
3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，所述获得扩增DNA片段的步骤包括使 用由序列号1及2中列举的核苷酸序列构成的寡核苷酸引物进行扩增。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的评价方法，其特征在于，所述具有Daol+/+的基 因型的小鼠和具有Daol+的基因型的小鼠，对于其他基因中至少1个基因而言，等位基因 的组合是相同的。
5.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，所述其他基因的等位基因的组合包 括 Hr+。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的评价方法，所述步骤C3)包括在所述步骤(2) 之前，测定所述具有Daol+/+的基因型的小鼠和所述具有Daol+的基因型的小鼠的活体组 织或该活体组织来源的培养组织细胞中的D-氨基酸含量；在所述步骤( 之后，在暴露于 所述试验条件下后，测定所述具有Daol+/+的基因型的小鼠和所述具有Daol+的基因型的 小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞中的D-氨基酸含量；以及，对在所述步 骤( 之前测定的D-氨基酸含量和所述步骤( 之后测定的D-氨基酸含量进行比较。
7.根据权利要求6所述的评价方法，其特征在于，所述D-氨基酸含量通过使用光学拆 分柱系统的柱色谱法进行测定。
8.根据权利要求6所述的评价方法，其特征在于，所述D-氨基酸含量通过使用识别光 学异构体的单克隆抗体的免疫学方法进行测定。
9.根据权利要求6 8中任一项所述的评价方法，其特征在于，所述D-氨基酸为D-脯 氨酸。
10.根据权利要求6 9中任一项所述的评价方法，其特征在于，所述测定D-氨基酸含 量的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞是选自由真皮、表皮、肾脏、胰腺、精巢、肾 上腺、小脑、脑垂体及血清构成的组中的1种或2种以上活体组织或该活体组织来源的培养 组织细胞。
11.根据权利要求10所述的评价方法，其特征在于，所述D-氨基酸为D-脯氨酸，该D-脯氨酸通过使用光学拆分柱的柱色谱法来测定，所述活体组织为真皮或表皮。
12.一种用于实施权利要求11所述的评价方法的评价系统，其特征在于，其包括具有 Daol+/+及Hr+的基因型的小鼠、具有Daol+及Hr+的基因型的小鼠、由序列号1及2中列 举的核苷酸序列构成的寡核苷酸引物、和识别脯氨酸的光学异构体的光学拆分柱系统。
13.—种医药品和/或化妆品的候补物质的筛选方法，其特征在于，通过权利要求12所 述的评价系统来评价医药品和/或化妆品的候补物质。
全文摘要
本发明开发了能够由DAO酶缺损小鼠与其他疾病模型小鼠的交配实验中生产的多个动物中迅速筛选Dao-/-的纯合体、并对多个样品中所含的D-氨基酸迅速进行定量测定的评价方法。本发明提供一种试验条件对小鼠的活体组织或该活体组织来源的培养组织细胞造成的影响的评价方法，所述评价方法包括以下步骤准备Dao1-/-小鼠等的步骤、将前述Dao1-/-小鼠等的活体组织等暴露于前述试验条件下的步骤、和对将前述Dao1-/-小鼠等的活体组织等暴露于前述试验条件下造成的影响进行分析的步骤。
文档编号G01N33/577GK102124103SQ20098013236
公开日2011年7月13日 申请日期2009年7月31日 优先权日2008年8月26日
发明者三田真史, 东条洋介, 浜濑健司, 芦田丰, 财津洁 申请人:国立大学法人九州大学, 株式会社资生堂