专利名称：C2orf18作为癌症治疗和诊断的靶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测和诊断癌症(特别是胰腺癌)的存在或者发生癌症的倾向 (predisposition)的方法。本发明还涉及治疗和预防癌症(特别是胰腺癌)的方法。特别 地，本发明涉及C2orfl8，一种在癌症中被特异上调的基因，以及其作为癌症治疗靶标和 诊断标志的用途。
背景技术：
癌症是主要的死亡原因，全世界每年有数百万人死于癌症。特别地，胰腺癌是 恶性肿瘤中致死率最高的癌症之一，患者的5年存活率为4%。每年有大约28000名患 者被诊断患有胰腺癌，并且几乎所有患者均因病死亡(Greenlee，R.T.，etal.，(2001)CA Cancer J Clin, 51: 15-36)。这种恶性肿瘤的不良预后是由于其难以早期诊断和对现在 的治疗方法响应差所导致的(Greenlee，R.T.，et al. (2001) CA Cancer J Clin, Ji: 15-36， Klinkenbijl, J.H., et al. (1999) Ann Surg，230 776-82; discussion 782-4.)。胰腺导管腺癌(PDAC)是西方国家中位列第四的癌症致死原因，也是普通恶 性肿瘤中具有最高致死率的癌症之一，患者的5年存活率仅为5% (DiMagno EP，et al.Gastroenterology. 1999 Dec ； 117(6) 1464-84.1, WrayCJ, etal.Gastroenterology.2005 May； 128(6) 1626-41.2)。2007年，美国预计有大约37,170名新患者被诊断患有胰 腺癌，并且接近 33,370 名将死于胰腺癌(JemalA，et al.CA Cancer J Clin.2007 Jan-Feb ； 57(1) : 43-66.3)。目前，PDAC唯一可治愈的方法是手术切除。然而，因为大多 数PDAC是在很晚期的阶段才被诊断出来，所有在诊断出时只有15% -20%的患者可 进行手术切除。在接受了有治愈可能的手术的患者中，大多数患者最终会复发并死于 该疾病(WrayCJ，et al.Gastroenterology.2005 May ； 128 (6) 1626-41.2)。某些方法 结合手术和化疗(包括吉西他汀或5-FU)，进行或不进行放射，能改善患者的生活质 量(DiMagno EP，et al.Gastroenterology.1999 Dec ； 117 (6) 1464-84.1，Wray CJ, etal. Gastroenterology.2005 May ； 128(6) 1626-41.2)。然而，这些治疗对 PDAC 患者长期生 存的效果非常有限，因为PDAC的侵袭性极高，并且对化疗有抵抗性。为了应对这种严峻的状况，通过鉴定分子靶标开发PDAC的新型分子治疗方 法是现在亟待解决的问题。前人已经使用了基因组范围的cDNA阵列，结合使用激光 显微解剖，获得了用于检测的纯化癌细胞群体，生成了精细的PDAC细胞表达谱(见 Nakamura T，et al.0ncogene.2004 Mar25 ； 23(13) 2385-400，本文引用作为参考)。线粒体对于细胞生物能学至关重要，在决定细胞凋亡过程中发挥核心作用 (Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1) 105-12.)。癌相关的细胞代谢变化会影响线粒体功能(Warburg effect, Galluzzi L, et al.Oncogene.2006Aug 7 ； 25 (34) 4812-30.)，并可能参与癌的存活能力，特别是在低毒性条件下。而且，细胞凋亡失效已 经与线粒体外膜透化(permeabilization) (MOMP)被抑制联系起来。在理论上，开发靶 定线粒体蛋白的特异治疗干预方法是吸引人的(Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1) 105-12.)。许多实验性的治疗剂能够直接靶定线粒体，从而诱导细胞凋亡。这 些试剂的实例包括被设计成模拟Bcl-2样蛋白Bcl-2同源域3的试剂(Walensky LD, et al.Science.2004 Sep 3 ； 305(5689) 1466-70.),外周型苯并二氮卓受体配体(Decaudin D, etal.CancerRes.2002 Mar 1 ； 62(5) 1388-93.),和两性阳离子(Ellerby HM，et al.Nat Med. 1999 Sep ； 5(9) 1032-8.)。这些MOMP诱导剂或促进剂能够自身诱导细胞凋亡， 或者在联合治疗中促进细胞凋亡的诱发，从而克服任何针对DNA损伤剂的化疗耐受性 (Taniuchi K, et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1) 105-12.)。本发明通过发现一种新的在胰腺癌细胞中特异上调的基因靶标，C2orfl8(染色 体2开放阅读框18)，解决了本领域对改进胰腺癌诊断和治疗的需求。发明的公开
发明概要 鉴于前述，本发明的一个目的是提供用于检测、诊断、预后评估和/或治疗癌 症(特别是胰腺癌)的新方法。在完成本发明的过程中，通过微阵列分析鉴定了一个新基 因C2orfl8，其在胰腺癌细胞(特别地，PDAC细胞)中特异过表达，并且其在癌细胞中 的过表达被RT-PCR和免疫组织化学分析所证实。因为C2orfl8在成年正常器官中局限性 地表达，所以它可能是具有极小副作用的新型治疗方法的合适而有前景的分子靶标。功 能上，通过SiRNA敲低胰腺癌细胞系中的内源C2orfl8可急剧抑制胰腺癌细胞的生长，表 明它在保持胰腺癌细胞生存能力中方面起着至关重要的作用。免疫细胞化学分析和细胞 分级分离(cell fractionation)随后进行western印迹分析的结果显示C2orfl8位于线粒体， 提示C2orfl8在癌细胞中可能参与细胞凋亡或能量内稳平衡。因此，本发明的一个目的是通过确定受试者来源生物样品(例如活组织检查)中 C2orfl8的表达水平来提供检测或诊断对象体内癌症、确定发生癌症的倾向、和/或监视 癌症(特别是胰腺癌)的治疗过程的方法。C2orfl8的表达水平与正常对照水平相比增 力口，表明对象罹患或者具有发生癌症(特别是PDAC)的危险。在本发明的方法中，可以 利用合适的探针检测C2orfl8基因，或者可以利用抗_C2orfl8抗体检测C2orfl8蛋白。本发明进一步提供了鉴定可抑制C2orfl8基因表达或其基因产物活性的作用剂的 方法。如在本文中将更详细讨论地，本发明涉及下述发现C2orfl8与ANT2之间的相互 作用，及该作用参与线粒体膜电位保持以及细胞凋亡。因此，本发明的一个目的是提供 鉴定可抑制C2orfl8与ANT2之间相互作用的作用剂的方法。本发明的一个进一步的目的 是提供鉴定用于治疗或预防C2orfl8相关疾�。绨┲⑷缫认侔乇鸬厥荘DAC， 的候选作用剂的方法，或者鉴定用于在这些疾病状态下抑制细胞生长的候选作用剂的方 法。本发明的方法可以在体外或体内实施。C2orfl8基因的表达水平和/或其基因产物 的生物活性在存在测试剂时比不存在测试剂时降低，表明该测试剂是C2orfl8的抑制剂， 并可能用于抑制过表达C2orfl8的细胞(例如癌细胞如胰腺癌细胞，更特别地是PDAC)的生长。可以利用候选作用剂通过抑制癌症生长来降低胰腺癌，特别是PDAC的症状。本发明的另外一个目的是提供通过施加可抑制C2orfl8基因表达和其基因产物即 C2orfl8蛋白的功能的作用剂来抑制过表达C2orfl8的癌性细胞生长的方法。优选地，该 作用剂是抑制性核酸(例如反义分子、核酶、双链分子)。该作用剂还可以是用于提供 双链分子的核酸分子或载体。通过向靶细胞内引入足以抑制C2orfl8基因表达的量的双 链分子可以抑制该基因的表达。本发明还提供了用于抑制受试者体内过表达C2orfl8的 癌性细胞生长的方法，以及用于罹患癌症(特别是胰腺癌)的受试者的治疗或预防方法。 在另一个方面中，本发明涉及用于治疗或预防癌症(特别是胰腺癌)的药物组合物，其包 括作为活性成分的双链分子或编码该双链分子的载体，以及合适的可药用载体。本发明 的双链分子在引入细胞内时可抑制C2orfl8基因的表达，并抑制过表达C2orfl8的癌性细 胞的生长。例如，这些分子可以被设计成靶定与SEQIDNO 11的核苷酸残基196-214 或核苷酸残基574-592部分相应的序列。本发明的双链分子包括有义链和反义链，其中 有义链包括含有靶序列的序列，并且其中反义链包括与有义链 互补的序列。分子的有义 链和反义链彼此杂交形成本发明的双链分子。本发明进一步的目的是提供针对C2orfl8的抗体。该抗体用具有氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)和 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)的多肽作为抗原产生。这些抗体可用于诊断癌症(特别是胰腺癌)的免疫 染色测定。在另一个方面中，本发明提供了用于检测、诊断或预后癌症(特别是胰腺 癌)的检测试剂或试剂盒，其包括抗_C2orfl8抗体。在本发明中，具有氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)的肽特别适用于制备抗-C2orfl8抗体。因此，本发明的一个目的是提供这些肽 以及制备抗_C20rfl8抗体的方法。本领域的技术人员会理解，本发明的一个或多个方面可以满足某些目的，而其 它一个或多个方面可以满足某些其它的目的。每一个目的可能不在全部方面均同等地 适用于本发明的每一个方面。例如，前述的各个目的可以择一地适用于本发明的每个方面。在联系附图和实施例阅读下面的详细说明时，本发明的这些和其它的目的和特 征将变得更加显而易见。然而，应当理解，前面的本发明概要和后面的详细说明仅仅提 出了优选的实施方案，并不对本发明或者本发明的可替换实施方案构成限制。特别地， 尽管本文中通过参考多个具体实施方案描述了本发明的，但是应当意识到，这些描述是 本发明的举例说明，不应认为对本发明具有限制。本领域的技术人员可以进行各种修改 和应用，而不背离如附加权利要求所述的本发明的精神和范围。类似地，本发明的其它 目的、特征、益处和优点可以从本概要和下面所述的某些实施方案变得显而易见，并且 对本领域的技术人员而言也更容易显见。通过上文并联系附加实施例、数据、附图和由 其获得的所有合理推论，或者同时考虑本文引用的参考文献，这些目的、特征、益处和 优点将变得显而易见。
在考虑下文的附图简述和本发明的详细说明及其优选实施方案时，技术人员将对本发明的各个方面和应用显而 易见[图1]“C2orfl8在PDAC细胞中的过表达”部分(A)显示了在显微解剖的PDAC 细胞(1-9)中C2orfl8和TUBA的mRNA表达的RT-PCR结果，并与同样被显微解剖的 正常胰腺导管上皮细胞(NPD)和成人生命器官(vitalorgans)相比较。Pane 正常胰腺， BM骨髓。部分(B)显示了 Northern印迹分析的结果，其显示C2orfl8在前列腺、甲状 腺、肾上腺组织中微弱表达，在几乎所有胰腺癌细胞系中高表达，但在生命器官中的表 达非常有限。部分(C)显示了 Western印迹分析的结果，其使用从两只家兔血清纯化出 的抗_C2orfl8抗体(批号192和批号193)检测PDAC细胞系中的内源C2orfl8。PDAC 细胞系中PAPM的表达高于正常细胞系(NIH3T3，HEK-293,和C0S7)。beta-肌动蛋 白作为上样对照。部分(D)显示了使用抗-C2orfl8抗体的免疫组织化学研究结果，其中 在PDAC细胞中观察到了强烈染色(Clx200，C2x400, C3x400)。在PDAC细胞的细胞 质内观察到了 C2orfl8的强阳性染色。在正常胰腺组织中，腺泡细胞和正常导管上皮细 胞没有显示染色(N，x400)。[图2]“ C2orfl8-siRNA对PDAC细胞生长的影响”部分(A)显示了 siRNA 对PDAC细胞系MIA_PaCa2 (左)禾Π Panc-I (右)内C2orfl8的敲低效果。对用每种针 对C2orfl8的siRNA-表达载体(#196，#574，和#3254)和作为阴性对照载体的siEGFP 进行半定量RT-PCR，结果#196和#574确认了敲低效果，而siEGFP和#3254则没有。 beta2-MG用于定量RNA。部分(B)显示了分别用标示的针对C2orfl8的siRNA-表 达载体(#196，#574，和#3254)和阴性对照载体(siEGFP)转染的MIA-PaCa2 (左)和 Panc-I (右)细胞的集落形成测定。细胞与遗传霉素温育14天然后用0.1%结晶紫染色以 显现。部分(C)显示了分别用标示的针对C2orfl8的siRNA-表达载体(#196，#574，和 #3254)和阴性对照载体(siEGFP)转染的MIA_PaCa2 (左)禾Π Panc-I (右)细胞的MTT 测定结果。与遗传霉素温育14天后，将每个平均值与指示SD (标准偏差)的误差线一 起绘图。Y轴上的ABS表示490nm的吸光度，630nm吸光度作为参比，吸光度用酶标仪 (microplate reader)测量。这些实验重复实施三次。**表示P值< 0.01 (Students' t_检 验)。[图3]“C2orfl8在PDAC细胞内的定位”部分(A)显示了使用抗_C2orfl8的免疫 细胞化学分析的结果，其中阳性信号(绿色)在PDAC细胞细胞质中呈囊泡模式(vesicular pattern)(左上图)被检测到。这些抗_C2orfl8抗体信号(绿色)与MitoTracker信号(红 色右上图)部分重合。这些抗-C2orfl8抗体信号在用siRNA敲低C2orfl8后消失(右 下图)，而它们在用对照siRNA(siEGFP)处理的细胞质内仍保持呈囊泡模式(左下图)。 部分(B)显示了用抗-C2orfl8抗体的Western印迹分析结果，其证明C2orfl8定位于细胞 质，并且仅存在于线粒体组分中。使用抗线粒体内膜蛋白(mitofilin)抗体检测线粒体组 分。部分(C)显示了免疫沉淀测定及随后的质谱结果，其中ANT2被鉴定为与C2orfl8 相互作用的蛋白的候选物。用C2orfl8-HA表达载体和/或ANT2-Flag表达载体共转染 COS7细胞。含有C2orfl8-HA或ANT2_Flag的蛋白复合体分别被抗-HA抗体(左图) 或抗-Flag抗体(右图)从细胞提取物中免疫沉淀下来。使用抗-Flag抗体进行Western 印迹表明，当两种表达载体共转染时，ANT2-Flag与C2orfl8-HA免疫共沉淀(左图箭头 所示)。使用抗-HA抗体的Western印迹表明，当两种表达载体共转染时，C2orfl8_HA与ANT2-Flag免疫共沉淀(右图箭头所示)。[图4]“C2orfl8/ANT2BP参与线粒体膜电位(Apsim)和细胞凋亡”部分(A) 显示了转染研究的结果，其中PDAC细胞KLM-I用ANT2 siRNA、C2orfl8/ANT2BP siRNA、或siEGFP (作为对照)转染，并在转染48h后收集。使用抗_C2orfl8/ANT2BP 抗体的Western印迹分析确认了 C2orfl8/ANT2BPsiRNA对KLM-1细胞的敲低效果。部 分 (B)显示了荧光测定的结果，其中细胞用若丹明123和PI温育，通过FACS分析测量荧 光。X-轴上的若丹明123 (Rhl23)强度反映了 Apsi m，X轴上的PI (碘化丙锭)渗透性 反映了死细胞细胞膜的破坏。低水平的RM23强度和阴性PI渗透性指示早期凋亡细胞， 其中线粒体Apsim降低但细胞凋亡没有完全完成，而低水平的Rhl23强度和阳性PI渗 透性指示死细胞。与对照相比(siEGFP，19% ),当ANTBP2 (25 % )或ANT2 (26 % )被 敲低时，低Apsim和阴性PI渗透性的细胞数目显示增加。部分(C)显示了 TUNEL测 定的结果，证明与siEGFP转染的细胞相比，敲低Panc-I细胞中的C2orfl8可增加凋亡细 胞的数目(TUNEL阳性细胞用绿色指示)。制备用DNase I处理的透化细胞作为TUNEL 测定的阳性对照。图(D)显示了通过流式细胞仪计数的TUNEL阳性细胞的数目。在柱 状图中，X-轴反映了 TUNEL-阳性细胞的绿色信号的强度。在柱状图上向右偏移表明 与SiRGFP转染的细胞相比，敲低C2orfl8可增加TUNEL阳性细胞的数目。发明的公开尽管与这里所介绍的相似或等价的方法和材料也可用于实施或检测本发明的实 施方案，但是现在介绍的是优选的方法和材料。然而，应当理解，本发明并不仅限于这 里所介绍的特定的方法学和实验方案，因为这些可以根据常规的实验和优化加以改变。 还应当理解，说明书中使用的术语只是出于介绍特定的版本或实施方案的目的，并不意 图限制本发明的范围。除非特别定义，否则这里使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域 普通技术人员所共同理解的相同的意思。然而，在出现矛盾时，以本说明书包括定义为 准。因此，在本发明的内容中，适用如下的定义。其他的定义视情况散在于下文中。^X除非特别指出，否则这里使用的词语“一”、“一个”和“该”的意思是“至 少一个”。如这里所使用的，术语“生物体”是指任何由至少一个细胞构成的活的实体。 活的生物体可以简单到例如单个真核细胞，或者复杂到哺乳动物，例如人类。如这里所使用的，术语“生物样品”是指整个生物体或其组织、细胞或组成部 分(例如体液，包括但不仅限于，血液、黏液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、 脐带血(amniotic cord blood)、尿液、阴道分泌物和精液)的子集(subset)。术语“生物 样品”进一步指从整个生物体或其细胞、组织或组成部分的子集制备的勻浆、裂解物、 提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物样品”指含有细胞 组分(例如蛋白质或多核苷酸)的介质，例如生物体已在其中繁殖的营养汤或凝胶。在本发明的内容中，受试者来源的样品可以是从测试受试者，例如已知或怀疑 患有癌症(更具体地说，胰腺癌)的受试者获得的任何组织。更具体地，组织可以是来 自胰腺癌或PDAC的上皮细胞。
术语“分离的”和“ 纯化的”在本文中关于某种物质(例如多肽、抗体、多核 苷酸等)使用时，是指该物质基本上不含至少一种在其天然来源中本来会有的物质。因 此，“分离的”或“纯化的”抗体是指这样的抗体，其基本上不含(freeof)来自该蛋白 质(抗体)所来源的细胞或组织的细胞材料，例如碳水化合物、脂质或其它污染蛋白质， 或者当其为化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学剂。术语“基本上不含细胞材 料”包括这样的多肽制备物，其中该多肽是从细胞分离或在细胞中重组产生的，而与该 细胞的其它细胞组分是分开的。因此，基本上不含细胞材料的多肽包括如下的多肽制备 物，其具有少于大约30%，20%, 10%, 5%, 2%或(重量比)的异源蛋白质(在这 里也称作“污染蛋白质”)。当多肽为重组产生时，还优选基本上不含培养介质，其包括 如下的多肽制备物，其含有的培养介质少于蛋白制备物体积的大约20%，10%或5%。 当多肽为化学合成产生时，优选其基本上不含化学前体或其它化学剂，包括这样的多肽 制备物其具有的参与该蛋白质合成的化学前体或其它化学剂少于蛋白质制备物量的大 约30%，20%, 10%, 5%, 2%或(干重)。特定蛋白制备物含有分离或纯化多肽可 以例如这样来证明对该蛋白制备物进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳并 对凝胶进行考马斯亮蓝染色等后显示单条条带。在优选实施方案中，本发明的抗体是分 离的或纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子，例如CDNA分子，可以是基本上不含其它 细胞材料的，或者当其为通过重组技术产生时，基本上不含培养介质，或者当其为化学 合成时，基本上不含化学前体或其它化学剂。在优选实施方案中，编码本发明抗体的核 酸分子是分离的或纯化的。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在这里可以互换使用，用于指示氨基酸残 基的聚合体。该术语适用于如下氨基酸聚合体，其中一个或多个氨基酸残基是被修饰的 残基，或者非天然存在的残基，例如相应的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚 合体的人工化学模拟物。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸具 有相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码子编码的 氨基酸，以及在细胞内翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和ο-磷 酸丝氨酸)。词组“氨基酸类似物”是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(α 碳与一个氢、一个羧基、一个氨基和一个R基团连接)，但具有经过修饰的R基团或经过 修饰的骨架的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。词 组“氨基酸模拟物”是指这样的化合物，其具有与一般氨基酸不同的结构，但发挥与一 般氨基酸相似的功能。在这里，氨基酸可以用它们公知的三字母符号表示，或者用IUPAC-IUB生物化 学命名委员会推荐的单字母符号表示。在本发明的内容中，术语“数个”，例如用于氨基酸添加、删除和/或替换 时，意思是3-7个、优选地3-5个，更优选地3-4个，甚至更优选地3个氨基酸残基。除非另外具体指出，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸” 和“核酸分子”可以互换使用，并且与氨基酸相似，可以用它们普遍接受的单字母编码 表示。与氨基酸相似，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸或核酸分子可以由DNA、RNA或其组合构成。在本发明的内容中，词组“对照水平”是指在对照样品中检测到的基因或蛋白 质表达水平，并且可以包括(a)正常对照水平或(b)癌症特异性对照水平，更具体地说， 胰腺癌特异性对照水平。对照水平可以是来自单个参考群体的单一表达模式，或者由多 个表达模式构成。词组“正常对照水平”是指在正常、健康个体中或者在已知没有罹患 癌症(例如胰腺癌如PDAC)的个体群体中检测到的基因表达水平。正常个体是没有癌 症(例如胰腺癌如PDAC)的临床症状的个体。另一方面，“胰腺癌(PC)对照水平”或
“PDAC对照水平”分别是指在罹患胰腺癌(PC)和胰腺导管腺癌(PDAC)的群体中发现 的基因表达水平。测试样品与PC或PDAC对照之间C2orfl8表达水平相似分别表示对象(获得测 试样品的对象)罹患或者具有发生PC或PDAC的危险。根据本发明，当基因的表达水 平比对照水平增加到至少1.1倍，优选地超过1.5倍，优选地超过2.0倍，优选地超过5.0 倍，优选地超过10.0倍或者更多倍时，认为特定基因的表达水平“增加”。类似地，当 基因的表达水平比对照水平降低至少1.1倍，优选地超过1.5倍，优选地超过2.0倍，优 选地超过5.0倍，优选地超过10.0倍或者更多倍时，认为特定基因的表达水平“降低”。 C2orfl8基因表达可以通过例如RT-PCR或Northern印迹分析确定受试者组织样品的 C2orfl8 mRNA,或者通过例如对受试者组织样品进行免疫组织化学分析检测由C2orfl8 编码的蛋白质，来加以确定。C2orfl8 基因和 C2orfl8 蛋白本发明部分地基于如下的发现，即与非癌组织相比，编码C2orfl8的基因在 PDAC中过表达。C2orfl8在这里还被称作PAMP(胰腺癌线粒体蛋白)。本发明涉及 C2orfl8基因和由其编码的C2orfl8蛋白，以及它们在胰腺癌诊断和治疗中的用途。鉴定的C2orfl8的cDNA长度为3912个核苷酸。C2orfl8的核酸和多肽序列分别 如SEQ ID NO: 11和12所示。这些序列数据还可以通过如下的登录号获得。C20RF18/ C2orfl8/ANT2BP ΝΜ_017877在本发明的内容中，功能等价物也被看作是“C2orfl8多肽”。这里，蛋白 的“功能等价物”是指具有与蛋白相同生物活性的多肽。也就是，任何保留C2orfl8 蛋白生物能力的多肽在本发明中均可用作这种功能等价物。在本发明的内容中，优选 地，C2orfl8功能等价物所保留的生物能力是与天然C2orfl8蛋白相关的促进细胞增 殖活性。生物样品的促细胞增殖活性可以通过检测增殖速度或者通过测量细胞周期 或集落形成能力来加以确定。这些活性可以用传统技术和标准测定方法常规地进行 测定，例如可以使用能够从ATCC (Manassas，VA)获得的MTT细胞增殖测定或来自 Lonza(BaselSwitzerland)的 ViaLight Assay。同样感兴趣的是天然 C2orfl8 蛋白结合 ANT2的能力。功能等价物的实例包括在天然存在的C2orfl8蛋白氨基酸序列中替换、删除、添 加或插入了一个或多个氨基酸的多肽。或者，所述多肽可以包括如下的氨基酸序列，其 与各自蛋白的序列具有至少大约80%同源性(也称作序列同一性)，更优选地至少大约 90%-95%同源性，甚至更优选地99%同源性。在其它实施方案中，多肽可以由这样的 多核苷酸编码，其在严格条件下可以和天然存在的C2orfl8基因核苷酸序列杂交。
本发明的多肽可以在氨基酸序列、分子量、等电点、是否存在糖链、或者形式上有差异，这取决于用于产生它的细胞或宿主或者所用的纯化方法。然而，只要它与本 发明的人类C2orfl8蛋白具有等价的功能，它就处于本发明的范围内。词组“严格(杂交)条件”是指如下的条件，在该条件下核酸分子与其靶序 列杂交，典型地在复杂的核酸混合物中，但不会与其它序列发生可检测的杂交。严 格条件是序列依赖的，在不同的环境下会不同。较长的序列在更高的温度下特异杂 交。 在 Tijssen, Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes, " Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中有关于核酸杂交的详尽指导。一般地，严格条件选择为在限定的离子 强度pH下，比特定序列的熔点(Tm)低大约5-10°C。Tm是在平衡状态下有50%的与靶 标互补的探针与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度)(因为靶序列过 量存在，所以在Tm下，平衡时有50%的探针占据)。严格条件还可以通过添加去稳定剂 如甲酰胺加以实现。为了选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，优选地是 背景杂交的10倍。严格杂交条件的实例包括如下50%甲酰胺，5xSSC，和1%SDS， 在42摄氏度温育，或者5xSSC，1% SDS,在65摄氏度温育，用0.& SSC和0.1 % SDS 在50摄氏度清洗。在本发明的内容中，用于分离编码与人类C2orfl8蛋白功能等价的多肽的DNA 的杂交条件可以由本领域技术人员常规地进行选择。例如，杂交可以如下地实施，使 用“Rapid-hyb缓冲液“(Amersham LIFE SCIENCE)在68°C实施预杂交30分钟或者更 长，添加标记探针，并在68°C温育1小时或者更长时间。随后的清洗步骤可以在例如低 严格条件下实施。低严格条件的实例可以包括42摄氏度，&SSC，0.1% SDS,优选地 50摄氏度，&SSC，0.1% SDS0高严格条件经常被优选地使用。高严格条件的实例可 以包括在室温下用2x SSC，0.01% SDS清洗三次，每次20分钟，然后在37摄氏度用Ix SSC, 0.1% SDS清洗三次，每次20分钟，在50摄氏度用Ix SSC，0.1% SDS清洗两次， 每次20分钟。然而，多种因素，例如温度和盐浓度，会影响杂交的严格性，本领域的技 术人员能够适当地选择这些因素以获得所需的严格度。一般地，已知修饰蛋白质中的一个或多个氨基酸不会影响蛋白的功能。实际 上，突变的或经修饰的蛋白质，具有通过对某氨基酸序列进行替换、删除、插入和/或 添加一个或多个氨基酸残基而进行修饰的氨基酸序列的蛋白质，已知可以保留原始的 生物活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81 5662-6 (1984) ； Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 6487-500 (1982) ； Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79 6409-13(1982))。因此，本领域的技术人员会认识到，对氨基酸序列进行的 改变单个氨基酸或少量氨基酸的单独添加、删除、插入或替换，或那些被视为“保守修 饰”的修饰(其中蛋白质改变所产生的蛋白具有相似的功能)，是本发明内容可以接受 的。只要蛋白质保持该活性，则氨基酸突变的数目没有特定限制。然而，一般优选 地改变氨基酸序列的5%或者更少。因此，在一个优选实施方案中，在这样的突变体中被 突变的氨基酸的数目一般是30个氨基酸或者更少，优选地20个氨基酸或者更少，更优选 地10个氨基酸或者更少，更优选地6个氨基酸或者更少，甚至更优选地3个氨基酸或者更少被突变的氨基酸残基优选地被突变成不同的氨基酸，但氨基酸侧链的性质保守 (这个过程称作保守氨基酸替换)。氨基酸侧链的性质的实例是疏水氨基酸(A，I，L， M，F，P, W，Y，V),亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q, G，H, K，S，T)，和共 同具有如下官能团或性质的侧链脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S， T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱基侧链(R， K，H)；和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守替换表是本领域 众所周知的。例如，下面的8组，每一个所含的氨基酸彼此是保守替换的1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(见例如 Creighton，Proteins 1984)。这些保守修饰的多肽包含在在本发明的内容中，只要它们保留天然C2orfl8蛋白 的生物活性，就把它们视为“C2orfl8多肽”。然而，本发明并不仅限于此，C2orfl8多 肽可以包括非保守修饰，只要保留C2orfl8蛋白的至少一种生物活性即可(例如促进细胞 增殖)。而且，被修饰的蛋白质不排除多态性变异体、种间同源物和由这些蛋白的等位基 因编码的蛋白。而且，本发明的C2orfl8基因包括如下的多核苷酸，其编码C2orfl8蛋白的功能 等价物。除了杂交之外，基因扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)方法，也可用于分 离编码与C2orfl8蛋白功能等价的多肽，其使用根据蛋白编码DNA (SEQ ID NO: 11)的 序列信息合成的引物。分别与人类C2orfl8基因和蛋白功能等价的多核苷酸和多肽通常 与原始的核苷酸或其氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”典型地是指同源性为40% 或者更高，优选地60%或者更高，更优选地80%或者更高，甚至更优选地90%-95% 或者更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可以通过如下的算法加以确定“Wilbur andLipman, Proc Natl Acad Sci USA 80 726-30 (1983)“。^^ 本发明还提供了针对C2orfl8的抗体，或这些抗体的免疫活性片段。这些抗体 可用于检测C2orfl8的特异表达。在本发明的内容中，使用特异针对C2orfl8的多克隆 抗体进行免疫组织化学分析确证了其在胰腺癌细胞内的过表达，而在正常成人生命器官 (心脏、肺、肾脏、肝脏和脑)中则没有或者仅有非常有限的表达。因此，本发明的抗 体可用于检测来自受试者的组织活检中的C2orfl8蛋白，诊断C2orfl8相关疾�。� 胰腺癌如PDAC，和治疗这些疾病。而且，本发明的抗体可用作对C2orfl8进行功能分 析的有用的工具。本发明的抗体可以通过使用具有在CRAAGQSDSSVDPQQPF(SEQID NO 5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)中提出的氨基酸序列 的C2orfl8片段加以制备。因此，本发明包括如下的抗体，其可识别由氨基酸序列CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)和 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID
NO 6)构成的表位。更具体地，在优选实施方案中，本发明的抗体可识别或结合包含 氨基酸序列SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的多肽。这里使用的术语“抗体”涵盖天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括例 如单链抗体、嵌合、双功能和人源化抗体，及其抗原结合片段(例如Fab'，F(ab' )2， Fab, Fv 和 rlgG)。另见 Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (PierceChemical Co., Rockford, IL)。 另见例如 Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H.Freeman & Co., NewY0rk(1998)。这些非天然存在抗体可以用固相肽合成法构建，可以重组产生或者可 以通过例如筛选由可变重链和可变轻链构成的重组库加以获得，如Huse et al.，Science 246 1275-81(1989)所述，本文引用其内容作为参考。这些和其它制作例如嵌合、 人源化、CDR-移植(grafted)、单链和双功能抗体是本领域技术人员所熟知的(Winter and Harris, Immunol.Today 14 243-6(1993) ； Wardetal., Nature 341 544-6(1989)； Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988 ； Hilyard et al.， Protein Engineering A practical approach (IRL Press 1992)； Borrebaeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995),本文弓 I用上述每 一篇文献的内容作为参考。术语“抗体”同时包括多克隆和单克隆抗体。该术语还包括遗传工程化的形 式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源缀合物(heteroconjugate)抗体(例如双 特异性抗体)。该术语还指示重组单链Fv片段(scFv)。术语抗体还包括双价或双特异 性分子、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)和四抗体(tetrabodies)。双价和双特异 性分子在例如下列文献中有公开Kostelny et al.(1992)J Immunol 148 1547，Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31 1579，Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA.90 6444，Graber et al.( 1994) JImmunol : 5368，Zhu et al. (1997) Protein Sci 6 : 781，Huet al. (1997) Cancer Res.56 3055，Adams et al. (1993) Cancer Res.53 4026，和 McCartney, et al. (1995) Protein Eng.8 : 301。典型地，抗体具有重链和轻链。每个重链和轻链包含一个恒定区和一个可变区 (这些区域也称作“结构域”)。轻链和重链可变区含有4个“框架”区，这四个区之间 被三个超变区隔断，这些超变区也称作“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR的 范围已被鉴定。不同轻链或重链框架区的序列在同一物种内相对保守。抗体的框架区， 即构成轻链和重链的各框架区的集合，帮助CDR在三维空间中定位和对齐。CDR主要负责对抗原的表位的结合。每条链的CDR典型地称作CDRl，CDR2 和CDR3(从N端开始依次编号)，通常还用特定CDR所在的链来标识。因此，VH CDR3 位于其所在的抗体的重链的可变域中，而VL CDRl是来自其所在的抗体的轻链可变域的 CDRl。所谓“VH”是指抗体免疫球蛋白重链(包括Fv，scFv或Fab的重链)的可变 区。所谓“VL”是指免疫球蛋白轻链(包括Fv，scFv, dsFv或Fab的轻链)的可变 区，。词组“单链Fv”或“scFv”是指如下的抗体，其中传统双链抗体的重链和轻链 的可变域被连接形成一条链。典型地，在两条链之间插入接头肽，以便允许适当地折叠和产生活性结合位点。“嵌合抗体”是这样的免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，从而使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的类型、效应器功能和/或物 种的恒定区连接，或者与可为嵌合抗体提供新的性质的完全不同的分子例如酶、毒素、 激素、生长因子、药物等连接；或(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换，使得可 变区具有不同的或改变的抗原特异性。“人源化抗体”是这样的免疫球蛋白分子，其含有极少的来自非人类免疫球 蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区 (CDR)的残基被来自非人类物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或家兔的具有期望特异 性、亲和性和能力的CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基 被相应的非人类残基替换。人源化抗体也可以包括在受体抗体和引入的CDR或框架 序列中均不存在的残基。一般地，人源化抗体包括基本上全部的至少一个，典型地两 个，可变域，其中全部或基本上全部的相应于非类人免疫球蛋白的CDR区以及全部或 者基本上全部的框架(FR)区是人类免疫球蛋白的共有序列。人源化抗体优选地还包括 至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地是人免疫球蛋白(Jones etal.，Nature321 522-5(1986) ； Riechmann et al.，Nature 332 323-7(1988)；和 Presta，Curr.Op.Struct. Biol.2 593-6(1992))。人源化可以基本上按照Winter及其同事的方法实施(Jones et al., Nature 321 522-5(1986) ； Riechmann et al.，Nature332 323-7(1988) ； Verhoeyen etal., Science 239 1534-6(1988))，用啮齿动物的一个或多个CDR序列替换人抗体的相 应序列。因此，这些人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中完整人类可 变域的很少一部分被来自非人类物种的相应序列替换。术语“表位”、“抗原性”和“决定簇”是指抗原上抗体所结合的位点。表 位可以由毗邻的氨基酸形成，也可以由非毗邻的氨基酸通过蛋白质的三级折叠并列在一 起而形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性剂时被保留，而由三级折叠形成 的表位通常在用变性剂处理时丧失。表位典型地包括至少3个，更通常地，至少5个或 8-10个处于独特的空间构型的氨基酸。确定表位空间构型的方法包括例如X-射线晶体 学禾口 2 维核磁共振。见例如 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E.Morris, Ed(1996)。术语“非抗体结合蛋白”或“非抗体配体”或“抗原结合蛋白”可互换使用， 用于表示使用免疫球蛋白骨架的抗体模拟物，包括adnectin、avimer,单链多肽结合分子 和抗体样结合肽模拟物，如下文中将更详细讨论的。已经开发出了其它的以和抗体相似的方式靶定和结合靶标的化合物。这些“抗 体模拟物”中的一些使用非免疫球蛋白骨架作为抗体可变区的替代性蛋白框架。例如，Ladner等(美国专利No.5,260,203)介绍了单多肽链结合分子，其具有与 聚集的而在分子水平上分离的抗体轻链可变区和重链可变区相似的结合特异性。单链结 合分子同时包含抗体重链和轻链可变区的抗原结合位点，二者由肽接头连接，并折叠成 与包含两个肽的抗体相似的结构。单链结合分子与传统的抗体相比具有多种优势，包括 尺寸更小、稳定性更高和更容易修饰。Ku 等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 (14) 6552-6556(1995))公开了 一种基于色素b562的抗体替代物。Ku等(1995)生成了一个文库，其中细胞色素b562的两个环被随机 化，并被选择结合牛血清白蛋白。单独的突变体被发现可以和抗BSA抗体相似地选择性 结合BSAoLipovsek等(美国专利Nos.6,818,418和7,115,396)公开了一种抗体模拟物，其
特征是纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白骨架和至少一个可变环。这些基于纤连蛋白的抗体模拟物名为Adnectin，显示许多与天然或工程化抗体相同的特性，包括对任何靶定配体的 高亲和性和特异性。任何用于发展新的或改良的结合蛋白质的技术均可用于这些抗体模 拟物。这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构域IgG重链可变区的结构相似。因此， 这些模拟物显示的抗原结合性质在本质和亲和力方面与天然抗体相似。而且，这些基于 纤连蛋白的抗体模拟物与抗体或抗体片段相比显示某些优点。例如，这些抗体模拟物的 天然折叠稳定性不依赖于二硫键，因此它们在通常会破坏抗体的条件下保持稳定。此 夕卜，因为这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构域IgG重链相似，所以环随机化和改组 (shuffling)的过程可以在体外进行，这与抗体的体内亲和力成熟过程相似。Beste 等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96 (5) 1898-1903(1999))公开了一种基于脂 笼蛋白骨架的抗体模拟物(Anticalin )。脂笼蛋白由一个β _折叠桶构成，蛋白质末端 具有四个超变环。BeSte(1999)对环进行随机突变并选择其对例如荧光素的结合。这些 变异体对荧光素显示特异的结合，一个变异体与荧光素的结合显示与抗-荧光素抗体相 似。进一步的分析显示，所有的随机位置均可变，表明Anticalin 适合于用作抗体的替 代物。Anticalins 是小的单链肽，典型地为160-180个残基，与抗体相比具有多种优
势，包括生产成本更低、保存稳定性更高和免疫反应更小。Hamilton等(美国专利No.5,770,380)公开了一种合成抗体模拟物，其使用刚性 的杯芳烃(calixarene)非肽有机骨架，与用作结合位点的多个可变肽环连接。所有肽环 相对于彼此均从杯芳烃的同一几何侧面伸出。由于这种几何构型，这有的环均可用于结 合，从而增加了与配体的结合亲和性。然而，与其它抗体模拟物相比，基于杯芳烃的抗 体模拟物并不完全由肽构成，因此它更不容易被蛋白酶攻击。骨架也不是完全由肽、 DNA或RNA构成，意味着这种抗体模拟物在极端环境条件下相对稳定，并具有长的生命 期。而且，因为基于杯芳烃的抗体模拟物相对�。虼瞬庖呦煊Φ目赡苄越档�。Murali 等(Cell.Mol.Biol.49 (2) 209-216(2003))讨论了一种用于将抗体减小成 更小的肽模拟物(peptidomimetics)的方法，他们称作“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)， 其也可以作为抗体的替代物。Silverman 等(Nat.Biotechnol. (2005)，23: 1556-1561)讨论了由具有多个结构域
的单链多肽构成的融合蛋白质，称作"avimers"。avimer是通过体外外显子改组和噬 菌体展示从人类细胞外受体结构域发展而来的一类结合蛋白，其对靶分子的亲和性和特 异性与抗体在一定程度上相似。所得的多结构域蛋白可以包括多个独立的结合结构域， 与单表位结合蛋白相比，可表现出提高的亲和性(在某些情况下达到亚纳摩尔)和特异 性。其它关于构建和使用avimer的方法的细节在例如如下美国专利申请公开中有公开 Nos.20040175756, 20050048512， 20050053973， 20050089932 和 20050221384。
出了非免疫球蛋白 蛋白框架之外，还已经用如下化合物模拟了抗体性质，包括 RNA分子和非天然寡聚体(例如蛋白酶抑制剂、苯二氮杂卓、嘌呤衍生物和β-转角模 拟物)，所有这些均适用于本发明。双链分子本发明还涉及令人惊讶的发现，即抑制C2orfl8的表达可有效抑制癌细胞(包括 胰腺癌所涉及的癌细胞)的细胞生长。本申请书中描述的本发明即部分地基于本发现。如这里所使用的，术语“双链分子”是指可抑制靶基因表达的核酸分子，包括 例如短干扰RNA(siRNA ；例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干 扰DNA/RNA (siD/R-NA ；例如双链DNA和RNA嵌合体(dsD/R-NA)或小发夹DNA禾口 RNA嵌合体(shD/R-NA))。如这里所使用的，术语“dsRNA”是指两个彼此具有互补 序列的RNA分子的构建体，它们通过互补序列退火形成双链RNA分子。双链的核苷酸 序列可以不仅包括从靶基因序列蛋白编码序列选出的“有义”或“反义” RNA，还可以 包括具有从靶基因非编码区选出的核苷酸序列的RNA分子。如这里所使用的，术语“shRNA”是指具有茎环结构的siRNA，其具有彼此互 补第一和第二区域，即有义链和反义链。第一和第二区互补程度和取向足以使得两个区 域之间发生碱基配对，第一和第二区通过环区连接，所述环是由于环区内核苷酸(或核 苷酸模拟物)之间缺乏碱基配对而形成的。ShRNA的环区是有义链和反义链之间的单链 区，可以称作“间插单链”。如这里所使用的，术语“siD/R-NA”是指由RNA和DNA 二者构成的双链多核 苷酸分子，包括RNA和DNA的杂交体和嵌合体，可阻止靶mRNA的翻译。这里，杂交 体是指如下的分子，其中由DNA构成的多核苷酸和由RNA构成的多核苷酸彼此杂交形成 双链分子；而嵌合体是指构成该双链分子的一条或两条链可以包含RNA和DNA。使用 将siD/R-NA引入到细胞内的标准技术。siD/R-NA包括有义核酸序列(也称作“有义 链”)、反义核酸序列(也称作“反义链”)或两者。siD/R-NA可以被构建成使得单个 转录本同时具有来自靶基因有义和互补的反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。如这里所使用的，术语“dsD/R-NA”是指彼此具有互补序列的两个分子的构 建体，它们通过互补序列退火在一起形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以 不仅包括从靶基因序列的蛋白编码序列选出的“有义”或“反义”核苷酸序列，还包括 具有从靶基因非编码区域选出的核苷酸序列的多核苷酸。构成dsD/R-NA的两个分子中 的一个或两个由RNA和DNA 二者构成(嵌合分子)，或者，一个分子由RNA构成，另 一个由DNA构成(杂合双链)。如这里所使用的，术语“shD/R-NA”是指具有茎环结构的siD/R-NA，其具 有彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。第一和第二区互补和定位的程度充 分，从而在区域之间发生碱基配对，第一和第二区通过环区连接，环得自于于环区内核 苷酸(或核苷酸模拟物)之间缺乏碱基配对。shD/R-NA的环区是有义链和反义链之间 的单链区，可以称作“间插单链”。本发明的双链分子可以含有一个或多个经过修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯 连接。本领域众所周知的化学修饰均能够增加双链分子的稳定性、可用性和/或细胞摄取。技术人员知道可引入到本发明分子的其他类型的化学修饰(W003/070744 ； W02005/045037)。在一个实施方案中，修饰可用于提供更高的对降解的耐受力或 更高的吸收。这些修饰的实例包括硫代磷酸酯连接、2’ -O-甲基核糖核苷酸(特 别是在双链分子的有义链上)、2’ -脱氧-氟核糖核苷酸、2’ _脱氧核糖核苷 酸、“通用碱基”(universal base)核苷酸、5' -C-甲基核苷酸和倒置脱氧碱基掺入 (US20060122137)。在另一个实施方案中，可以使用修饰提高双链分子的稳定性或增加靶定效率。修饰包括双链分子两条互补链之间的化学交联、双链分子3’或5’端的化学修饰、糖 修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰、2-氟修饰的核糖核苷酸和2’ -脱氧核糖核苷酸 (W02004/029212)。在另一个实施方案中，可以使用修饰来增加或降低对靶mRNA和/ 或互补双链分子链中互补核苷酸的亲和性(W02005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷 酸可以被2-硫、5-炔基、5-炔基或5-丙炔基嘧啶代替。此外，未修饰的嘌呤可以被 7-脱氮(deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤代替。在另一个实施方案中，当双链分子是具有 3’ _突出端(overhang)的双链分子时，3’ -端突出端核苷酸可以被脱氧核糖核苷酸代替 (Elbashir SM et al.，Genes Dev 2001 Jan 15，15 (2) 188-200)。关于进一步的细节，可 见出版文献例如US20060234970。本发明并不仅限于这些实施例，任何已知的化学修饰 均可用于本发明的双链分子，只要所得的分子保留抑制靶基因表达的能力即可。而且，本发明的双链分子可以同时包括DNA和RNA，例如dsD/R_NA或shD/ R-NA。具体地，由DNA链和RNA链形成的杂合多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸 显示更高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA 链(多核苷酸)构成的杂合型双链分子、在任何一条或两条单链(多核苷酸)上同时具有 DNA和RNA的嵌合型双链分子、或类似物，以提高双链分子的稳定性。由DNA链和 RNA链形成的杂合体可以是有义链为DNA而反义链为RNA的杂合体，或者相反，只要 它在引入到表达靶基因的细胞内时具有抑制靶基因表达的活性即可。优选地，有义链多 核苷酸是DNA，反义链多核苷酸是RNA。此外，嵌合型双链分子也可以是两条有义和反 义链均由DNA和RNA构成，或者有义链和反义链的任何一个由DNA和RNA构成，只 要它在引入到表达靶基因的细胞内时具有抑制靶基因表达的活性即可。为了提高双链分子的稳定性，分子优选地含有尽可能多的DNA，而为了诱导靶 基因表达的抑制，分子需要在一定范围内是RNA，以诱导充分的表达抑制。作为嵌合型 双链分子的优选实例，双链分子的上游部分区域(即有义或反义链内位于靶序列或其互 补序列侧翼的区域)是RNA。优选地，上游部分区域是指有义链的5’侧(5’端)和 反义链的3’侧(3’端)。也就是说，在优选实施方案中，反义链3’端侧翼的区域， 或者有义链5’端侧翼的区域和反义链3，端侧翼的区域均由RNA构成。例如，本发明 嵌合型或杂合型双链分子包括如下组合。5, -[—DNA—]-3,3' -(RNA)-[DNA]-5'反义链，有义链5'- (RNA)-[DNA]-3'3' -(RNA)-[DNA]-5'反义链，禾口有义链5'- (RNA)-[DNA]-3'
3' -(---RNA---)-5'反义链.上游部分区域优选地是由9-13个核苷酸构成的域，从双链分子有义链或反义链内的靶序列或与之互补序列的末端开始计数。而且，这些嵌合型双链分子的优选实 例包括这样的双链分子具有长度为19-21个核苷酸的有义链，其中多核苷酸的至少上 游半区(有义链的5’侧区和反义链的3’侧区)是RNA，另一个半区是DNA。在这 种嵌合型双链分子中，当整个反义链都是RNA时，抑制靶基因表达的效果会大大提高 (US20050004064)。在本发明中，双链分子可以形成发夹，例如短发夹RNA(ShRNA)和由DNA和 RNA构成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R_NA是一段RNA序列或RNA和DNA 的混合物，形成紧固的发夹转角，可通过RNA干扰沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA 包括位于单条链上的有义靶序列和反义靶序列，其中二者被环序列分开。一般地，发夹 结构被细胞机构切割成dsRNA或dsD/R-NA，dsRNA或dsD/R-NA随后与RNA诱导的 沉默复合体(RISC)结合。该复合体结合并切割与dsRNA或dsD/R-NA的靶序列匹配的 mRNAo针对C2orfl8基因的双链分子(例如"C2orfl8 siRNA")可用于降低该基因的表 达水平。这里，术语“siRNA”是指可阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。在本发明 的内容中，双链分子由针对C2orfl8基因的有义核酸序列和反义核酸序列构成。该双链分 子被构建成同时包含靶序列的有义和互补反义序列。双链分子可以是dsRNA，shRNA, dsD/RNA 或 shD/RNA。针对C2orfl8基因的双链分子与mRNA的靶区域杂交，即与通常为单链mRNA 转录本在相应于靶序列的区域结合，藉此干扰mRNA的翻译，最终降低或抑制由基因编 码的多肽的产生(表达)。因此，本发明的双链分子可以按照其在严格条件下与C2orfl8 基因mRNA特异杂交的能力加以定义。在本发明的内容中，双链分子的长度优选地小于500个，200个， 100个，50个，或25个核苷酸。更优选地，双链分子的长度为19-25个核苷 酸。C2orfl8双链分子的靶核酸序列的实例包括相应于C2orfl8靶序列的寡核 苷酸序列，例如 5 ‘ -GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3 ‘ (SEQ ID NO 7)或 5' -GCACGACAGTCAGCACAAG-3‘ (SEQ ID NO 8)。因此，举例而言，本发明提 供了具有由SEQ ID NO 7或8构成的寡核苷酸序列的双链分子。在双链分子的RNA区 域，靶序列中的核苷酸"t"应当用"U"代替。为了提高双链分子的抑制活性，可以在 反义链的3’端添加核苷酸〃 u〃。添加的〃 u〃的数目至少为2个，一般为2-10个， 优选地为2-5个。所添加的”U"在双链分子反义链的3’端形成单链。由任意核苷酸序列构成的环序列可以位于有义和反义序列之间，以便形成发夹 环结构。因此，本发明还提供了具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'的双链分子，其中[A] 是这样的寡核苷酸序列，其对应于与C2orfl8基因的mRNA或cDNA的靶序列特异性杂交 的序列。在优选实施方案中，[A]是相应于C2orfl8基因的靶序列的寡核苷酸序列；[B] 是由大约3个到大约23个核苷酸构成的核苷酸序列，[A']是由[A]的互补序列构成的寡 核苷酸序列。[A]区与[A’ ]区杂交，然后形成由[B]区构成的环。环序列的长度优选地 是3-23个核苷酸。环序列可以例如从如下序列构成的组中选出(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb 506 .html) CCC，CCACC，或 CCACACC JacqueJMetal., Nature 2002， 418 435-8.UUCG LeeNSetal.，Nature Biotechnology 2002，20: 500-5 ； Fruscoloni P etal.，Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4) 1639-44。UUCAAGAGA Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology2003, 4 457-67。' UUCAAGAGA(DNA 中的〃 ttcaagaga")‘是特别合适的环序列。而且，由23个核苷酸构成的环序列也提供活性siRNA(Jacque J-M et al., Nature 2002， 418 435-8)。适用于本发明内容的发夹双链分子的实例包括5 ‘ -GGAGCACAGCUUCCAGCAU-[B]-AUGCUGGAAGCUGUGCUCC
-3'(用于SEQ ID NO 7的靶序列)；和5 ‘ -GCACGACAGUCAGCACAAG-[B]-CUUGUGCUGACUGUCGUGC-3 ‘(
用于SEQ ID NO: 8的靶序列)。具体地，下面的双链分子[lh[13]包含在本发明中[1]包括有义链和反义链的双链分子，其中有义链包含相应于由SEQ ID NO: 7或8构成的靶序列的核苷酸序列，并且其中反义链包括与所述有义链互补的核苷酸序 列，其中所述有义链和所述反义链彼此杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子 在被弓丨入到表达C2orfl8基因的细胞内时可抑制该基因的表达。[2][1]的双链分子，其中所述靶序列包括来自由SEQ ID NO: 11构成的核苷酸序 列的大约19-大约25个连续的核苷酸。[3][2]的双链分子，其中所述双链分子是包括通过单链核苷酸序列连接起来的有 义链和反义链的单核苷酸转录本。[4][3]的双链分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是包含相应 于SEQID NO: 7或8的序列的寡核苷酸的有义链，[B]是由大约3个-大约23个核苷酸 构成的核苷酸序列，[A']是包含相应于[A]序列的互补序列的寡核苷酸的反义链。[5][3]的双链分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是相应于由作 为靶序列的由SEQIDNO : 7或8构成的序列的核糖核苷酸序列，[B]是由大约3个到大 约23个核苷酸构成的核苷酸序列，[A']是由[A]的互补序列构成的核糖核苷酸序列。[6][1]_[5]的双链分子，其包含RNA。[7][1]-[5]的双链分子，其包含DNA和RNA。[8][7]的双链分子，其是DNA多核苷酸和RNA多核苷酸的杂合体。[9][8]的双链分子，其中有义链和反义链分别由DNA和RNA构成。[10][7]的双链分子，其是DNA和RNA的嵌合体。[11][10]的双链分子，其中有义链中靶序列的5’端区域，和/或反义链中靶序 列的互补序列的3’端区域由RNA构成。[12][11]的双链分子，其中RNA区域由9_13个核苷酸构成。[13][1]_[5]的双链分子，其含有3’突出端。本发明的双链分子在下文中将更加详细地进行描述。合适的双链分子的寡核苷酸序列可以用从Ambion网址可得的计算机设计程序加以设计(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。该计算机程序根据如
下方案选择用于双链分子合成的核苷酸序列。靶位点选择1.从目标转录本的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA双核苷酸序列。记 录每一个AA的出现和其3’毗邻的19个核苷酸作为潜在靶位点。Tuschl等Genes Cev 1999，13(24) 3191-7不推荐针对5’和3’非翻译区(UTRs)和靠近起始密码子的区 域(75个核苷酸内)设计靶序列，因为这里可能富含调节性蛋白的结合位点。UTR结合 蛋白和/或翻译起始复合体可能干扰内切核酸酶复合体的结合。2.比较潜在靶位点与人类基因组数据库，并排除任何与其它编码序列具有显著 同源性的靶序列。同源性搜索可以用BLSAST实施(Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res 1997，25: 3389-402 ； J Mol Biol 1990，215 403-10.)，其可以在NCBI服务器上找到 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.选择合格的靶序列进行合成。在Ambion，优选地可以沿着基因的长度选择多 个靶序列以进行评估。可以使用将双链分子引入到细胞内的标准技术。例如，可以将C2orfl8的双链 分子以能够与mRNA转录本结合的形式直接引入到细胞内。在这些实施方案中，本发明 的双链分子通常如上文所述的反义分子那样被修饰。其它的修饰也是可能的，例如已显 示胆固醇偶联的双链分子可提高药理性质(Songet al.，Nature Med 2003，9 347-51)。可选择地，编码双链分子的DNA可以被携带在载体(下文也称作'SiRNA载 体')内。这些载体可以通过将靶C2orfl8基因序列克隆到具有操作连接的调节序列(例 如来自小核RNA (snRNA) U6的RNA聚合酶III转录单位或人类Hl RNA启动子)的表达 载体内来制备，调节序列以如下的方式位于序列的侧翼，其允许两条链表达(通过DNA 分子的转录)(Lee NSetal.，NatureBiotechnology 2002, 20:500-5)。例如，与 C2orfl8 基因mRNA反义的RNA分子被第一启动子(例如被克隆的DNA的3’ 一侧的启动子序 列)转录，而C2orfl8基因mRNA有义链的RNA分子由第二启动子(例如被克隆的DNA 的5’ 一侧的启动子序列)转录。有义链和反义链在体内杂交而产生双链分子构建体， 用于沉默C2orfl8基因的表达。或者，可利用两个构建体产生单链构建体的有义和反义 链。在这种情况下，具有二级结构(例如发夹)的构建体作为单个转录本被产生，该转 录本同时包括靶基因的有义和互补反义序列。具体地，本发明提供了载体，其具有含有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸的 组合中的任一个或两个，其中所述有义链核酸包括SEQ ID NOs: 7或8的核苷酸序列， 并且其中反义链包括与所述有义链互补的核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链的 转录本彼此杂交，形成所述双链分子，并且其中所述载体在引入到表达C2orfl8基因的细 胞内时可抑制所述基因的表达。 或者，本发明提供了载体，其具有含有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸的组 合中的任一个，其中所述有义链核酸包括SEQ ID NOs: 7或8的核苷酸序列，并且其中 反义链核酸包括与所述有义链互补的核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链的转录 本彼此杂交，形成双链分子，并且其中所述载体在被引入到表达C2orfl8基因的细胞内时 可抑制所述基因的表达。优选地，多核苷酸是长度为大约19-25个核苷酸的寡核苷酸(例如来自SEQID NO: 11的核苷酸序列的连续核苷酸)。更优选地，多核苷酸的组合包括 具有通过单链核苷酸序列连接的有义链和反义链的单核苷酸转录本。更优选地，多核苷 酸的组合具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是具有SEQ IDNO 7或8的核苷 酸序列；[B]为由大约3-大约23个核苷酸构成的核苷酸序列；[A']包括与[A]互补的 核苷酸序列。
为了将双链分子载体引入到细胞内，可以使用转染增强剂。FuGENE6(R0Che diagnostics), Lipofectamine 2000 (Invitrogen) , Oligofectamine (Invitrogen), 禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可用作转染增强剂。检测或诊断胰腺癌的方法在胰腺癌中被活化的数十个基因中，本发明着眼于一个新基因 C2orfl8 (GenBank 登录号No.NM_017877)，其编码一个多次跨膜蛋白质。在本文中它 可以和"ANT2BP" (ANT2-结合蛋白)和"PAMP“(胰腺癌线粒体蛋白)互换使用。 RT-PCR、northern印迹、以及使用特异针对C2orfl8的多克隆抗体的免疫组织化学分析证 实，它在胰腺癌细胞中过表达，在正常成人生命器官(心脏、肺、肾脏、肝脏和脑)中不 表达或非常有限地表达。因此，本发明的提供一种检测、诊断和/或确定受试者体内癌症(例如胰腺癌) 的存在或发生倾向的方法，该方法确定受试者来源生物样品(例如组织样品)中C2orfl8 的表达水平。C2orfl8的表达水平与正常对照水平相比的改变，例如增加，表明受试者罹 患或者具有发生癌症(例如胰腺癌)的危险。本发明涉及确定(例如测量)C2orfl8基因的表达水平。使用由GenBank 数据 库中已知序列记录所提供的信息，可以用本领域普通技术人员众所周知的技术检测和测 量C2orfl8基因。例如，序列数据库记录内相应于C2orfl8基因的序列可用于构建探针， 用来检测C2orfl8基因的相应RNA序列，例如在Northern印迹杂交分析中。探针典型地 包含C2orfl8序列的至少10个、至少20个、至少50个、至少100个或者至少200个核苷 酸。作为另一个实例，可使用序列构建引物来特异扩增C2orfl8核酸，例如在基于扩增 的检测方法(如基于反转录的聚合酶链式反应)中。作为另一个实例，针对C2orfl8的 抗体，例如抗_C20rfl8多克隆抗体或抗-C2orfl8单克隆抗体可用来进行免疫测定，例如 免疫组织化学分析、western印迹分析或ELISA等。而且，C2orfl8基因的转录产物可以通过基于扩增的检测方法(例如RT-PCR)用 引物进行定量。这些引物还可以根据基因的可得序列信息加以制备。例如，在实施例中 使用的引物(SEQ ID NOs: 3和4)可用于通过RT-PCR进行检测，但本发明并不仅限于 此。或者，可以检测翻译产物用于本发明的诊断。例如，可以确定C2orfl8蛋白的 量。用于确定作为翻译产物的蛋白质的量的方法包括使用特异识别该蛋白质的抗体或抗 体模拟物的免疫测定方法。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修 饰(例如嵌合抗体，scFv，Fab, F(ab' )2，Fv等)均可用于检测，只要该片段保留与 C2orfl8蛋白的结合能力即可。制备这些类型抗体用于检测蛋白的方法是本领域众所周知 的，并且本发明可以采用任何方法制备这些抗体和其等价物。作为另一种基于其翻译产物检测C2orfl8基因表达水平的方法，可以用针对C2orfl8蛋白的抗体或抗体模拟物通过免疫组织化学分析观察染色的强度。也就是，观察 到强染色表明蛋白的存在量增加，同时C2orfl8基因的表达水平高。而且，翻译产物可以根据其生物学活性加以检测。具体地说，在本文中， C2orfl8蛋白被证实参与癌细胞的增殖。因此，C2orfl8蛋白的细胞增殖活性可用作生物 样品中存在C2orfl8蛋白的指征。 然后，将C2orfl8基因在测试细胞群体(例如来自受试者的组织样品)中的表达 水平与参考细胞群体中该基因的表达水平进行比较。参考细胞群体包括一个或多个所比 较的参数已知的细胞，例如胰腺癌细胞，正常的胰腺细胞或正常的胰腺导管上皮细胞。测试细胞群体与参考细胞群体相比的基因表达水平是否指示癌症(例如胰腺癌) 或者其倾向，取决于参考细胞群体的组成。例如，如果参考细胞群体由正常细胞(非癌 症)构成，则测试细胞群体和参考细胞群体的基因表达水平的相似性表示测试细胞群体 不是癌症或者没有其危险。相反，如果参考细胞群体是由癌细胞构成的，则测试细胞群 体与参考细胞群体之间基因表达的相似性表示测试细胞群体含有癌细胞。如果C2orfl8基因在测试细胞群体中的表达水平与参考细胞群体中C2orfl8基因 的表达水平相比偏离超过1.1倍、超过1.5倍、超过2.0倍、超过5.0倍、超过10.0倍或更 多倍，则C2orfl8基因在测试细胞群体中的表达水平被认为“改变”或“不同”。测试细胞群体和参考细胞群体之间的差异基因表达可以相对于对照核酸(例如 管家基因)加以标准化。例如，对照核酸是已知不会因细胞的癌症或非癌症状态而改变 的核酸。可利用对照核酸的表达水平来将测试和对照细胞群体内的信号水平标准化。对 照基因的实例包括，但不仅限于，例如β-肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和核糖体蛋 白Ρ1。测试细胞群体可以和多个参考细胞群体进行比较。多个参考细胞群体中的各个 群体的已知参数可以是不同的。因此，测试细胞群体可以和已知含有例如胰腺癌细胞的 第一参考细胞群体比较，以及和已知为正常细胞(例如不含胰腺癌细胞)的第二参考细胞 群体比较。测试细胞群体可以包括来自已知含有或者疑似含有癌细胞的受试者的组织或 细胞样品。测试细胞群体可以从组织活检获得，例如身体组织或体液，例如生物液(例如 血液、痰、唾液)。例如，测试细胞群体可以是从疑似患有癌症(例如胰腺癌)的受试者 获得的胰腺组织纯化的。优选地，测试细胞群体包括上皮细胞。上皮细胞优选地来自已 知是或疑似是癌(例如胰腺癌)的组织。参考细胞群体中的细胞优选地来自和测试细胞群体相似的组织类型。任选地， 参考细胞群体是细胞系，例如胰腺癌细胞系或PDAC细胞系(即阳性对照)或正常非癌细 胞系(即阴性对照)。或者，对照细胞群体可以来自被测试的参数或条件已知的细胞的分 子信息数据库。被诊断的受试者优选地是哺乳动物。哺乳动物实例包括，但不仅限于，人类、 非人灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。或者，根据本发明，可以提供用于检查受试者状况的中间结果。这些中间结果 可以和额外的信息组合，以帮助医生、护士或其它从业人员确定受试者是否罹患癌症、 例如胰腺癌。
或者，本发明还可用于检测受试者来源组织中的癌性细胞，为医生提供有用的 信息，以确定受试者是否罹患癌症，例如胰腺癌。因此，本发明涉及确定(例如测量) 受试者来源样品(例如胰腺组织样品)中C2orfl8的水平。在本发明中，用于诊断癌症 (例如胰腺癌)的方法也包括用于测试或检测癌症(例如胰腺癌)的方法。或者，在本发 明中，诊断癌症还代表显示受试者中癌症的疑似、危险或可能性。监视和评估癌症治疗的效力C2orfl8基因在正�：桶┬韵赴洳钜毂泶铮虼嗽市矶园┲⒅瘟频墓探� 监视，其中上述用于诊断癌症的方法可适用于监视和评估治疗对癌症(例如胰腺癌)的效 力。具体地，治疗对癌症的效力可以通过确定来自接受治疗的受试者的细胞中C2orfl8基 因的表达水平进行评估。如果期望，在不同的时间点，治疗前、治疗中和/或治疗后， 从受试者获得测试细胞群体。C2orfl8基因的 表达水平可以例如按照上述的方法加以确 定。在本发明的内容中，优选地使用没有暴露于目标治疗的细胞内的C2orfl8基因表达 作为对照水平，与检测到的表达水平相比较。如果C2orfl8基因的表达水平与从正常细胞或含有非癌细胞(例如非胰腺癌细 胞)的细胞群体确定的对照水平进行比较，则表达水平相似表明目标治疗是有效的，表 达水平不同表明治疗的临床结果或预后不利。另一方面，如果比较是针对从癌细胞或含 有癌细胞(例如胰腺癌细胞)的细胞群体确定的对照水平，则表达水平不同表明是有效的 治疗，而表达水平相似表明临床结果或预后不利。而且，可以根据本发明的方法比较C2orfl8基因在治疗之前和之后的表达水平， 以评估治疗的效力。具体地，将治疗后来自受试者的生物样品中检测到的表达水平(即 治疗后水平)与来自同一受试者的在治疗开始前获得的生物样品中检测到的表达水平(即 治疗前水平)进行比较。治疗后水平与治疗前水平相比降低，表明目标治疗是有效的， 而治疗后水平与治疗前水平相比增加或相似则表明临床结果或预后不利。如这里所使用的，术语“有效”是指治疗导致受试者体内被病理上调基因的表 达降低，被病理下调基因的表达增加或者癌的大小、普遍性或转移潜力降低。当预防性 地应用感兴趣的治疗时，“有效”是指治疗可延缓或防止肿瘤的形成，或者延缓、防止 或减轻该疾病的至少一种临床症状。受试者体内肿瘤状况的评估可以用标准临床规程实 施。此外，治疗的有效性可以联合任何已知的用于诊断癌症的方法加以确定。癌症 可以通过例如鉴定症状性异常，例如体重减轻、腹痛、背痛、食欲不振、恶心、呕吐和 全身性不适、虚弱和黄疸，来加以诊断。用于检测、诊断或确定胰腺癌的试剂盒和试剂剂本发明提供了用于检测、诊断或确定癌症的试剂盒。优选地，所述癌症是胰腺 癌，更优选地是PDAC。具体地，试剂盒包括至少一种用于检测受试者来源生物样品中 C2orfl8的表达水平的试剂，该试剂可以从下组中选出(a)用于检测C2orfl8 mRNA的试剂；(b)用于检测C2orfl8蛋白的试剂；和(c)用于检测C2orfl8生物活性的试剂。用于检测C2orfl8 mRNA的合适试剂包括特异结合或鉴定C2orfl8mRNA的核酸，例如具有C20rfl8mRNA的一部分的互补序列的寡核苷酸。这些类型的寡核苷酸的 实例是对C2orfl8 mRNA特异的引物和探针。这些类型的寡核苷酸可以根据本领域众所 周知的方法加以制备。如果需要，用于检测C2orfl8 mRNA的试剂可以固定在固体基质上。另一方面，用于检测C2orfl8蛋白的合适试剂包括针对C2orfl8蛋白的抗体。 抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体，scFv， Fab, F(ab' )2，Fv等)均可用作所述试剂，只要该片段保留与C2orfl8蛋白的结合能力 即可。制备这些类型的用于检测蛋白质的抗体的方法是本领域众所周知的，本发明可以 采用任何方法制备这些抗体或其等价物。而且，可以通过直接连接或间接标记技术用信 号发生分子对抗体进行标记。用于标记抗体和检测抗体与其靶标的结合的标记和方法是 本领域众所周知的，本发明可以采用任何标记和方法。而且，生物活性可以通过例如测量由于在生物样品内表达的C2orfl8蛋白所导致 的促细胞增殖活性(cell proliferating activity)加以确定。例如，将细胞在受试者来源生物
样品的存在下培养，然后通过检测增殖速度或者通过测量细胞周期或集落形成能力，可 以确定生物样品的促细胞增殖活性。而且，试剂盒可以包含用于结合针对C2orfl8基因的探针或针对C2orfl8蛋白 的抗体的 固体基质和试剂，用于培养细胞的介质和容器，阳性和阴性对照试剂，和用于 检测针对C2orfl8蛋白的抗体的第二抗体。例如，从具有良好预后和不良预后的受试者 获得的组织样品可以用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可以进一步包括其它在商业 和用户角度看理想的材料，包括缓冲液、稀释剂、滤器、针头、针筒和带有使用说明的 药品说明书(package insert)(例如文字、磁带、CD-ROM等)。这些试剂等可以保存在 具有标签的容器内。合适的容器包括瓶子、小瓶和试管。容器可以用多种材料制成，例 如玻璃或塑料。作为本发明的一个实施方案，当试剂是针对C2orfl8mRNA的探针时，试剂可以 固定在固体基质(例如多孔条带(porous strip))上，形成至少一个检测位点。多孔条带的 测量或检测区可包括多个位点，每一个位点含有一种核酸(探针)。测试条带还可以含有 阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以位于与测试条带不同的条带上。任选 地，不同检测位点可以含有不同量的固定核酸，即，在第一检测位点有较高的量，在随 后的位点有较少的量。在添加测试样品时，显示可检测信号的位点的数目可提供样品中 存在的C2orfl8 mRNA量的定量指示。检测位点可以配置成任何适合的可检测的形状， 典型地呈横跨测试条带的横条(bar)或点(dot)状。或者，本发明提供了上述用于检测、诊断或确定胰腺癌存在或发生倾向的试 剂。筛选方法通过siRNA敲低过表达C2orfl8的细胞内的内源C2orfl8可显著抑制细胞生长， 提示C2orfl8在保持细胞活力中的至关重要作用。而且，进行免疫细胞化学分析和细胞 分级分离随后进行Western印迹分析的结果提示C2orfl8定位于线粒体，表明C2orfl8可 能参与细胞凋亡或细胞内的能量内稳平衡。这些关于C2orfl8功能和亚细胞定位的发现 提示，C2orfl8可能是用于胰腺癌治疗的有前途的分子靶点。
因此，本发明提供了筛选用于抑制过表达C2orfl8的细胞的增殖的候选剂和化合物的方法。细胞可以是癌细胞，具体地是胰腺癌细胞，更具体地是PDAC细胞。使 用C2orfl8基因、由该基因编码的多肽或其片段、或基因的转录调节区域，有可能筛选 可抑制该基因表达或由该基因编码的多肽的生物活性的作用剂或化合物。在本发明的内 容中，所述生物活性可以是细胞增殖活性。这些作用剂或化合物可以作为治疗或预防 C2orfl8相关疾病(例如癌症，如胰腺癌)的药物的候选作用剂或化合物。因此，本发明 进一步提供了使用C2orfl8基因、由该基因编码的多肽或其片段、或该基因的转录调节区 域来鉴定用于治疗或预防C2orfl8相关疾病(例如癌症，具体地胰腺癌，更具体地PDAC) 的候选作用剂或化合物的方法。通过本发明筛选方法鉴定的作用剂或化合物是可以抑制C2orfl8基因表达或基因 的翻译产物的活性的作用剂或化合物，并且是预期可有效治疗C2orfl8相关疾病(例如癌 症，具体地胰腺癌，更具体地PDAC)的作用剂或化合物。也就是说，通过本发明鉴定的 作用剂或化合物预期具有临床利益，并可进一步在动物模型或测试受试者中测试其阻止 过表达C2orfl8的细胞生长的能力。在本发明的内容中，待通过本筛选方法鉴定的作用剂或化合物可以是任何生物 制品、任何化合物或包括数种化合物的组合物。而且，根据本发明筛选方法暴露于细胞 或蛋白质的测试作用剂或化合物可以是单个化合物或多个化合物的组合。当在本方法中 使用多个化合物的组合时，各化合物可以顺次或同时被接触。在本发明的筛选方法中可以使用任何测试作用剂或化合物，例如细胞提取物、 细胞培养上清、发酵微生物产品、海洋生物提取物、植物提取物、纯化的或粗蛋白、 肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸构建体，例如反义RNA、双链分子、 siRNA,核酶等)和天然化合物。本发明的测试作用剂或化合物也可以用本领域已知的组 合库方法中的多种方法中的任一种获得，包括但不仅限于(1)生物文库，(2)空间可寻址的平行固相或溶液相文库，(3)需要去卷积的合成文库方法，(4)“ 一珠子一化合物(one-bead one-compound)“文库方法和(5)使用亲和色谱选择的合成文库方法。生物文库方法仅限于肽文库，而其它四种方法可用于肽、非肽寡聚体或化合 物小分子文库(Lam，Anticancer Drag Des 1997, 12:145-67)。用于合成分子库的方 法的实例可以在本领域技术中找到(DeWitt et al.，Proc Natl AcadSci USA 1993，90 6909-13 ； Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994，91 11422-6 ； Zuckermann et al., J Med Chem 37 2678-85，1994 ； Cho et al., Sciencel993, 261 1303-5; Carell et al.， Angew Chem Int Ed Engl 1994，33 2059 ； Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994， 33 2061 ； Gallop et al., J MedChem 1994，37 1233-51)。化合物库可以在溶液中存 在(见Houghten，Bio/Techniques 1992，13:412-21)，或在珠子(Lam，Nature 1991， 354 82-4)、芯片(Fodor，Nature 1993，364 555-6)、细菌(美国专利 5,223,409)、 孢子(美国专禾U 5,571,698 ； 5,403,484,和 5,223,409)、质粒(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA1992, 89 1865-9)或噬菌体(Scott and Smith, Science 1990，249 386-90 ；Devlin, Science 1990，249 404-6 ； Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87 6378-82 ； Felici, J Mol Biol 1991，222 301-10;美国专利申请 2002103360)上存在。
通过任何本发明筛选方法鉴定的化合物结构的一部分通过添加、删除和/或置 换加以改变而得到的化合物，均包含在通过本发明筛选方法获得的作用剂或化合物中。
而且，当被筛选的测试作用剂或化合物是蛋白质或编码蛋白质的DNA时，可 以确定蛋白质的全氨基酸序列从而推导编码该蛋白质的核酸序列，或者可以分析所得蛋 白质的部分氨基酸序列，以便根据该序列制备作为探针的寡聚DNA，并用该探针筛选 cDNA文库以获得编码该蛋白质的DNA。所得的DNA可用于制备测试作用剂或化合物， 作为治疗或预防癌症的候选物。
I.计算机模拟(In silico)筛选方法
可以利用具有所寻求性质的已知化合物的分子结构的信息，和/或被抑制的靶 分子(即C2orfl8)的分子结构的信息，来帮助构建测试化合物文库。的初步筛选适合于 进一步评估的测试化合物的方法之一，是对测试化合物与其靶标之间的相互作用进行计 算机建模。在本发明中，对测试化合物与C2orfl8之间相互作用的建模可提供对该相互 作用本身的细节的深入认识，并提示破坏该相互作用的可能策略，包括潜在的相互作用 分子抑制剂。
计算机建模技术为针对选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互 作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于从选定分子的χ-射线晶 体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新 化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以优化结合特异性提供了 可能。为了预测当分子和化合物之一或二者发生细小改变时分子-化合物相互作用是什 么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户 之间的用户友好的、菜单驱动的界面。
上文一般性描述的分子建模系统的一个实例由CHARMm和QUANTA程序， Polygen Corporation, Waltham, Mass组成。CHARMm实施能量最小化和分子动力学功 能。QUANTA实施构建、图形建�：头肿咏峁狗治�。利用QUANTA可进行分子相互行 为的互动性构建、修饰、和可视化分析。
大量文献回顾了与特定蛋白相互作用的药物的计算建模，例如Rotivinen，et al.Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166 (1988) ； Ripka, NewScientist 54—57 (Jun. 16, 1988) ； McKinlayandRossmann, Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29, 111-122(1989)； Perry and Davies, Prog Clin BiolRes.291 189-93 (1989) ； Lewis and Dean，Proc.R.Soc. Lond B Biol Sci.236，125-40 and 141-62(1989)；关于核酸组分模型受体的有 Askew，et al., J.Am.Chem.Soc.lll, 1082-90(1989)。
其它筛选和图形描述化合物的计算机程序可以从例如BioDesign，Inc., Pasadena, Calif., Allelix, Inc, Mississauga，Ontario, Canada,禾口 Hypercube，Inc., Cambridge, Ontario。见例如 DesJarlais et al. (1988) J.Med.Chem.31 722-9 ； Meng et al. (1992) J.Computer Chem.13 505-24; Meng et al. (1993) Proteinsl7 266-78; Shoichet et al. (1993) Science 259 1445-50 等公司获得。
一旦鉴定了 C2orfl8的假定抑制剂，便可采用组合化学技术，根据已鉴定假定抑制剂的化学结构构建任意数目的变异体。所得的假定抑制剂、或“测试作用剂”或“测 试化合物”文库可以用本发明的方法进行筛选，以鉴定可抑制C2orfl8的生物活性的测试 作用剂或化合物。
II.基于蛋白质的筛诜方法
根据本发明，C2orfl8基因的表达被提示对于过表达该基因的细胞(例如癌细 胞，具体地说胰腺癌细胞，更具体地说PDAC细胞)的生长和/或生存至关重要。因 此，我们考虑可抑制由该基因编码的多肽的表达或功能的作用剂或化合物可抑制该细胞 的生长和/或生存，从而可用于抑制细胞生长和治疗或预防癌症。因此，本发明提供了 使用C2orfl8多肽鉴定用于抑制细胞生长的候选作用剂或化合物，或者用于治疗或预防 C2orfl8相关疾病的候选作用剂或化合物的方法。在本发明中，待抑制生长的细胞的特征 是过表达C2orfl8，例如癌细胞，如胰腺癌细胞，具体地说是胰腺导管腺细胞。C2orfl8 相关疾病的特征是C2orfl8过表达，例如癌症，如胰腺癌，具体地说是PDAC。
除了 C2orfl8多肽之外，多肽的片段也可用在本发明的内容中，只要其保留天然 存在的C2orfl8多肽的至少一种生物学活性即可。
多肽或其片段可以进一步与其它物质连接，只要所得的多肽或片段保留原始肽 的至少一种生物活性即可。可用的物质包括肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然和合 成聚合物等。这些种类的修饰可以用于提供额外的功能或使多肽和片段稳定。
用于本方法的多肽或片段可以通过传统的纯化方法作为天然存在的蛋白质从自 然界中获得，或者通过根据所选氨基酸序列化学合成获得。例如，可适用于合成的传统 肽合成方法包括
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
2) The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976 ；
3) Peptide Synthesis (in Japanese), Marazen Co., 1975 ；
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese)，Marazen Co.，1985 ；
5) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese)， Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa，1991 ；
6)W099/67288 ；和
7) Barany G & Merrifield R.B.，Peptides Vol.2, “ Solid Phase Peptide Synthesis"， Academic Press, New York, 1980，100-118.
或者，蛋白质可以利用任何已知用于产生多肽的遗传工程方法获得(例如 Morrison J., J Bacteriology 1977, 132 349—51 ； Clark-Curtiss & Curtiss， Methods in Enzymology (eds.Wu et al.) 1983, 101 347-62) 例如，首先，制备多核苷酸，其以可表 达的形式编码目标蛋白(例如在调节序列包括启动子的下游)，将其转化进入合适的宿主 细胞，然后培养宿主细胞产生蛋白质。更具体地，通过将基因插入到用于表达表达外来 基因的载体内，例如pSV2neo，pcDNA I，pcDNA3.1, pCAGGS或pCD8，在宿主(例 如动物)细胞中表达编码C2orfl8多肽的基因。表达可使用启动子。任何通用的启动子 均可采用，包括例如 SV40 早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Geneticengineering, vol.3.Academic Press, London, 1982, 83-141), the EF- α 启动子(Kim et al., Gene 1990，91 217-23)，CAG 启动子(Niwa et al., Gene 1991，108 193)，RSV LTR 启动子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152 684-704), Sralpha 启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 1988，8 466)，CMV 中早期启动子(Seed et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1987，84: 3365-9)，SV40 晚期启动子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982, 1 385-94)，腺病毒晚期启动子(Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989，9 946)，HSV TK 启 动子等。可以根据任何方法将载体引入宿主细胞内表达C2orfl8基因，例如电穿孔方法 (Chu et al., Nucleic Acids Res 1987，15 1311-26)、磷酸钙方法(Chen et al., Mol Cell Bioll987, 7 2745-52)、DEAE 葡聚糖方法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 1984，12: 5707-17 ； Sussman et al., Mol Cell Biol 1984，4 1641-3)、脂转染方法(Derijard B，Cell 1994，7 1025-37) ； Lamb et al., Nature Genetics 1993，5 22—30 ； Rabindran et al., Science 1993，259 230-4)等。
C2orfl8蛋白还可以在体外采用体外翻译系统加以产生。
待与测试作用剂或化合物接触的C2orfl8多肽可以是例如纯化的多肽、可溶蛋白 或与其它多肽融合的融合蛋白。
II-1.鉴定与C2orfl8多flt结合的作用剂或化合物
与蛋白结合的作用剂或化合物很可能改变编码该蛋白的基因的表达或蛋白的生 物活性。因此，在一个方面中，本发明提供了筛选可抑制细胞生长和治疗或预防C2orfl8 相关疾病的作用剂或化合物的方法，其包括如下步骤
a)使测试作用剂或化合物与C2orfl8多肽或其功能片段接触；
b)检测多肽(或片段)与测试作用剂或化合物的结合；和
c)选择与多肽(或片段)结合的测试作用剂或化合物。
根据本发明，可以评估测试作用剂或化合物抑制细胞生长和治疗或预防C2orfl8 相关疾病的测试作用剂或化合物的治疗效果。因此，本发明还提供了筛选用于抑制细胞 生长和治疗或预防C2orfl8相关疾病的作用剂或化合物的方法，包括如下步骤
a)使测试作用剂或化合物与C2orfl8多肽或其功能片段接触；
b)检测多肽(或片段)与测试作用剂或化合物的结合；和
c)将b)的结合与测试作用剂或化合物的治疗效果相关联。
在本发明中，可以将治疗效果和测试作用剂或化合物的结合性质相关联。例 如，当测试作用剂或化合物与多肽(或片段)结合时，该测试作用剂或化合物可以被鉴定 或选择作为具有治疗效果的候选作用剂或化合物。或者，当测试作用剂或化合物不与多 肽(或片段)结合时，测试作用剂或化合物可以被鉴定为没有显著治疗效果的作用剂或化 合物。测试作用剂或化合物与C2orfl8多肽的结合可以例如通过使用针对多肽的抗体进 行免疫沉淀加以检测。因此，为了进行这种检测，优选地，用于筛选的C2orfl8多肽或 其功能片段含有抗体识别位点。用于筛选的抗体可以是识别本发明C2orfl8多肽的抗原 性区域(例如表位)的抗体，其制备方法是本领域众所周知的，并且任何方法均可在本发 明中用于制备这类抗体或其等价物。
或者，C2orfl8多肽或其功能片段可以被表达成融合蛋白，融合蛋白包括位于其 N或C端的具有特异性已经揭示的针对多肽N或C端的单克隆抗体的识别位点(表位)。 可以使用商业上可获得的表位-抗体系统(ExperimentalMedicine 1995，13 85-90)。商 品化的载体能够通过利用其多克隆位点表达与例如半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白，这样的载体可用于本发 明。而且，本领域还已知这样的融合蛋白，它们含有小得多的表位，可以通过这对该表 位的抗体进行免疫沉淀而检测到(ExperimentalMedicine 1995，13: 85-90)。这些表位由 数十个氨基酸构成，从而不改变C2orfl8多肽或其片段性质，它们也可用于本发明。实 例包括，但不限于，多聚组氨酸(His标签)、流感凝集物HA、人c-myc、FLAG、水泡 性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7标签)、人类单纯疱疹病毒糖蛋白 (HSV-标签)、E-标签(单克隆噬菌体上的表位)等。
谷胱甘肽S转移酶(GST)也是众所周知的可以通过免疫沉淀检测的融合蛋白的 配对物(counterpart)。当使用GST作为与C2orfl8多肽或其片段融合形成融合蛋白的蛋 白质时，融合蛋白可以用针对GST的抗体或特异结合GST的物质，即例如谷胱甘肽(例 如谷胱甘肽-Sepharose 4B)加以检测。
在免疫沉淀中，通过向C2orfl8多肽和测试作用剂或化合物的反应混合物添加 抗体(识别C2orfl8多肽或其自身的功能片段，或多肽或片段标记的表位)而形成免疫 复合物。如果测试作用剂或化合物具有结合多肽的能力，那么所形成的免疫复合物将由 C2orfl8多肽、测试作用剂或化合物和抗体构成。相反，如果测试作用剂或化合物没有这 种能力，那么所形成的免疫复合物仅包括C2orfl8多肽和抗体。因此，测试作用剂或化 合物与C2orfl8多肽的结合能力可以通过例如测量所形成免疫复合物的大小来检查。任 何用于检测物质大小的方法均可使用，包括色谱、电泳等。例如，当使用小鼠^G抗体 进行检测时，可以使用蛋白A或蛋白G sepharose定量所形成的免疫复合物。
关于免疫沉淀的更多细节，见例如Harlow etal.，Antibodies, Cold SpringHa rbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52。
而且，用于筛选可与之结合的测试作用剂或化合物的C2orfl8多肽或其功能片段 可以和载体结合。可用于结合多肽的载体实例包括不溶性多糖，例如琼脂糖、纤维素和 葡聚糖；以及合成树脂，例如聚丙烯酰胺、葡聚糖和硅胶；优选地，可以使用由上述材 料制备的商业可获得的珠子和平板(例如多孔板、生物传感器芯片等)。当使用珠子时， 可以将它们填充到柱子内。或者，在本领域还已知磁珠的使用，使用磁珠能够通过磁性 容易地分离结合在珠子上的多肽和测试作用剂或化合物。
多肽与载体的结合可以根据常规的方法进行，例如化学键合和物理吸附。或 者，多肽可以通过特异识别蛋白质的抗体结合于载体上。而且，多肽与载体还可以借助 相互作用的分子(例如亲和素和生物素的组合)来结合。
使用这些结合于载体的C2orfl8多肽或其功能片段的筛选方法包括例如如下步 骤使测试作用剂或化合物与载体结合的多肽接触，孵育混合物，清洗载体，和检测和 /或测量与载体结合的作用剂或化合物。结合可以在缓冲液中进行，缓冲液例如但不限于 磷酸缓冲液和Tris缓冲液，只要缓冲液不抑制结合即可。
使用这些载体结合的C2orfl8多肽或其功能片段的筛选方法的实例包括亲和色 谱。例如，C2orfl8多肽可以被固定在亲和柱的载体上，将含有至少一种测试作用剂或化 合物的溶液施加给柱子。在加载测试作用剂或化合物之后，清洗柱子，然后用合适的缓 冲液洗脱与多肽结合的测试作用剂或化合物。
使用表面等离子体共振现象的生物传感器可以用作检测或定量本发明结合作用剂或化合物的手段。当使用这种生物传感器时，C2orfl8多肽与测试作用剂或化合物的相 互作用可以作为表面等离子体共振信号实时得到观察，只需使用极少量的多肽，且无需 标记(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能用生物传感器例如BIAcore评估多肽与 测试作用剂之间的结合。
通过使分子暴露于固定在载体上的特定蛋白，从合成化合物中筛选或在天然物 质文库或随机噬菌体肽展示库中筛选与特定蛋白结合的分子的方法，或者基于组合化学 技术的高通量筛选方法(Wrighton et al.，Science 1996，273 458-64 ； Verdine, Nature 1996，384 11-3)来分离蛋白质以及化合物的方法，也是本领域技术人员公所周知的。 这些方法也可以用于筛选与C2orfl8蛋白或其片段结合的作用剂或化合物(包括激动剂和 拮抗剂)。
当测试作用剂或化合物是蛋白质时，本发明的方法可以使用例如West-Western 印迹分析Mkolnik etal.，Cell 1991，65:83-90)。具体地，与C2orfl8蛋白结合的蛋白质可以通过下述方式获得从预期表达至少一种与C2orfl8多肽结合的蛋白质的细胞、 组织、器官或培养细胞(例如胰腺癌细胞)制备第一 cDNA文库，用噬菌体载体(例如 ZAP)在LB-琼脂糖上表达由cDNA文库的载体所编码的蛋白质，将表达的载体固定在滤 膜上，使纯化并标记的C2orfl8多肽与上述滤膜反应，然后根据C2orfl8多肽的标记检测 表达C2orfl8多肽所结合的蛋白的噬菌斑。
标记物质，例如放射性同位素(例如4，14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I) >酶(例 如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β -半乳糖苷酶、α -葡萄糖苷酶)、荧光物质(例 如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、若丹明)和生物素/亲和素，可用于标记本发明方法中的 C2orfl8多肽。当蛋白质用放射性同位素标记时，检测或测量可以通过液体闪烁进行。或 者，当蛋白质用酶标记时，可以通过添加酶的底物用吸收光度计检测底物的酶学变化， 例如颜色产生，来检测或测量。此外，当使用荧光物质作为标记时，结合蛋白可以用荧 光光度计进行检测或测量。
而且，与蛋白结合的C2orfl8多肽可以通过利用特异结合C2orfl8多肽，或者特 异结合与C2orfl8多肽融合的蛋白或多肽(例如GST)的抗体进行检测和测量。在本发明 筛选中使用抗体的情况下，抗体优选地用上述的标记物质之一进行标记，并基于该标记 物质进行检测和测量。或者，可以使用针对C2orfl8多肽的抗体作为第一抗体，用标记 有标的底物的第二抗体进行检测。而且，在本筛选中与C2orfl8多肽结合的抗体可以用 蛋白G或蛋白A柱加以检测或测量。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂 交系统(〃 MATCHMAKER Two-Hybrid system “， “ MammalianMATCHMAKER Two-HybridAssayKit"， “ MATCHMAKER one-Hybridsystem" (Clontech) ； “ Hybri ZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene) ； thereferences“ Dalton et al., Cell 1992, 68: 597-612〃 和〃 Fields etal.，Trends Genet 1994，10: 286-92")。在双杂交系统中， C2orfl8多肽或其片段与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预 期表达至少一种与C2orfl8多肽结合的蛋白质的细胞制备cDNA文库，从而使该文库在表 达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后，将cDNA文库引入到上述酵母细胞中， 从检测到的阳性克隆分离文库来源的cDNA(当与C2orfl8多肽结合的蛋白在酵母细胞内表达时，两者的结合会激活报告基因，使阳性克隆可以被检测到)。由CDNA编码的蛋 白质可以通过将所上面分离到的CDNA引入到大肠杆菌中并表达该蛋白加以制备。
作为报告基因，除了 HB3基因之外，可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
由本筛选鉴定的作用剂或化合物是C2orfl8多肽激动剂或拮抗剂的候选物。术语 “激动剂”是指可通过与多肽结合激活多肽功能的分子。而术语“拮抗剂”是指可以通过与多肽结合抑制多肽功能的分子。而且，通过本筛选作为拮抗剂分离的作用剂或化合 物是可以在体内抑制C2orfl8多肽与分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白质)之间相互 作用的候选物。
II-2. iSi寸彻丨丨C2orfl8碰删編�：懾ぞ⑽�
根据本发明，证明了 C2orfl8基因的表达对过表达C2orfl8的细胞，例如癌细 胞，具体地胰腺癌细胞，更具体地PDAC细胞，的生长和/或生存至关重要。因此，可 阻碍或抑制C2orfl8基因翻译产物的表达或生物功能的作用剂或化合物被认为可用作抑制 细胞生长的候选作用剂或化合物，或者用于治疗或预防C2orfl8相关疾病的候选作用剂或 化合物。因此，本发明还提供了使用C2orfl8多肽或其片段来筛选用于抑制细胞生长的候 选作用剂或化合物或者用于治疗或预防C2orfl8相关疾病的候选作用剂或化合物的方法， 其包括如下步骤
a)使测试作用剂或化合物与C2orfl8多肽或其功能片段接触；和
b)检测步骤a)中多肽或片段的生物活性。
根据本发明，可以对抑制细胞生长的测试作用剂或化合物或者用于治疗或预防 C2orfl8相关疾病的候选作用剂或化合物的治疗效果进行评估。因此，本发明还提供了使 用C2orfl8多肽或其片段筛选可抑制细胞生长的候选作用剂或化合物或者用于治疗或预防 C2orfl8相关疾病的候选作用剂或化合物的方法，其包括如下步骤
a)使测试作用剂或化合物与C2orfl8多肽或其功能片段接触；和
b)检测步骤a)中多肽或片段的生物活性；和
c)将b)的生物活性与测试作用剂或化合物的治疗效果相关联。
在本发明中，治疗效果可以和C2orfl8多肽或其功能片段的生物活性相关联。 例如，当与不存在该测试作用利或化合物时检测到的水平相比，测试作用剂或化合物阻 碍或抑制C2orfl8多肽或其功能片段的生物功能时，测试作用剂或化合物可以被鉴定或选 择为具有治疗效果的候选作用剂或化合物。或者，当测试作用剂或化合物不妨碍或抑制 C2orfl8多肽或其功能片段的生物活性时，测试作用剂或化合物可以被鉴定为没有显著治 疗效果的作用剂或化合物。
任何多肽均可用于筛�。灰哂蠧2orfl8多肽的一种生物学功能，可以用作 本发明筛选方法的指标即可。因为C2orfl8多肽具有促进癌细胞之细胞增殖的能力，所 以可以用作筛选指标的C2orfl8多肽的生物学活性包括人类C2orfl8多肽的这种细胞增殖 活性。例如，可以使用人类C2orfl8多肽，也可以使用与其功能等价的多肽，包括其功 能片段。这些多肽可以被内源表达，或者由合适的细胞外源表达。
当待在本发明检测的生物活性是细胞增殖活性或抗细胞凋亡活性时，可以通过 例如如下方法进行检测制备表达C2orfl8多肽或其功能片段的细胞，在测试作用剂或化合物的存在下培养细胞，和确定细胞增殖的速度，测量细胞周期等，以及通过检测伤口 愈合活性，进行基质胶(Matrigel)侵袭测定和测量集落形成活性。
根据本发明的一个方面，筛选在上面的步骤(b)之后进一步包括步骤C)选择 与不存在该测试作用剂或化合物时检测到的生物活性相比，抑制多肽生物活性的测试作 用剂或化合物。
而且，通过与对不表达C2orfl8细胞的效果相比较，可以确认候选作用剂或化合 物对C2orfl8的特异性。如果候选作用剂或化合物能够在表达C2orfl8的细胞中起效，而 在不表达C2orfl8的细胞中不起效，则候选作用剂或化合物对C2orfl8具有特异性。通过 本筛选分离的作用剂或化合物是C2orfl8多肽拮抗剂的候选作用剂或化合物，因此是抑制 多肽与分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白质)之间的体内相互作用的候选作用剂或化 合物。
除了细胞增殖活性或抗细胞凋亡活性之外，C2orfl8蛋白还具有对ANT2蛋白的 结合活性。因此，本发明还提供了用于筛选可抑制C2orfl8与ANT2之间结合的作用剂 或化合物的方法。可抑制C2orfl8与ANT2之间结合的作用剂或化合物预期可以抑制癌 细胞的增殖，因此可用于治疗或预防癌症。因此，本发明还提供了用于筛选可抑制癌细 胞增殖的候选作用剂或化合物的方法，和用于筛选用于治疗或预防癌症的候选作用剂或 化合物的方法。
更具体地，该方法包括如下步骤
(a)在测试作用剂或化合物的存在下，使C2orfl8蛋白与ANT2蛋白接触；
(b)检测C2orfl8与ANT2蛋白之间的结合水平；
(c)比较C2orfl8和ANT2蛋白之间的结合水平与不存在该测试作用剂或化合物 时检测到的水平；和
(d)选择可降低C2orfl8和ANT2蛋白之间结合水平的测试作用剂或化合物作为 可抑制C2orfl8与ANT2蛋白之间结合的作用剂或化合物，即可用于抑制癌细胞增殖和治 疗或预防癌症的候选作用剂或化合物。
根据本发明，可以对测试作用剂或化合物对抑制细胞生长的治疗效果或者候选 作用剂或化合物对治疗或预防C2orfl8相关疾病的治疗效果进行评价。因此，本发明还 提供了用于筛选可抑制癌细胞增殖的候选作用剂或化合物的方法，和用于筛选用于治疗 或预防癌症的候选作用剂或化合物的方法。更具体地，该方法包括如下步骤
(a)在测试作用剂或化合物的存在下，使C2orfl8蛋白与ANT2蛋白接触；
(b)检测C2orfl8与ANT2蛋白之间的结合水平；
(c)比较C2orfl8和ANT2蛋白之间的结合水平与不存在该测试作用剂或化合物 时检测到的水平；和
(d)将C)的结合水平与测试作用剂或化合物的治疗效果相关联。
在本发明中，可以将治疗效果和C2orfl8与ANT2蛋白的结合水平相关联。例 如，当与不存在测试作用剂或化合物时检测到的水平相比，测试作用剂或化合物降低 C2orfl8与ANT2蛋白的结合水平时，测试作用剂或化合物可以被鉴定或选择作为具有治 疗效果的候选作用剂或化合物。或者，当与不存在测试作用剂或化合物时检测到的水平 相比，测试作用剂或化合物没有降低C2orfl8与ANT2蛋白的结合水平时，测试作用剂或化合物可以被鉴定或选择作为没有显著治疗效果的候选作用剂或化合物。
在本发明的内容中，两个蛋白的“结合的抑制”是指至少降低蛋白质之间的结 合。因此，在一些情况下，样品中结合对的百分比与合适(例如没有用测试作用剂处理 的)的对照样品相比将会降低。结合蛋白的量可以是对照样品中结合蛋白的量的例如 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 25%, 10%, 5%, 1 %或者更少(例如 0% )。
这里，C2orfl8蛋白和ANT2蛋白可以包括如上所述的这些蛋白的功能等价物。 用于筛选的C2orfl8或ANT2蛋白或其功能等价物可以通过本领域技术人员众所周知的 方法作为重组蛋白或天然蛋白加以制备。蛋白质可以通过任何已知的用于产生肽的遗 传工程方法获得(例如 Morrison J.，JBacteriology 1977，132 349-51 ； Clark-Curtiss & Curtiss, Methods inEnzymology (eds.Wu et al.) 1983, 101 347-62)。例如，重组蛋白可以 通过如下方法加以制备将编码该蛋白的DNA (例如具有SEQ ID NO: 11 (用于C2orfl8) 或25(用于ANT2)的核苷酸序列的DNA)插入到合适的表达载体内，将载体引入到合适 的宿主细胞，在合适的培养介质中温育宿主细胞，获得宿主细胞的提取物，然后对提取 物进行色谱分离，例如离子交换色谱、反相色谱、凝胶过滤或利用固定有针对该蛋白质 的抗体柱的亲和色谱，或者通过多个上述柱子的组合，纯化出蛋白质。
另外，当可用于本发明内容的蛋白质在宿主细胞内(例如动物细胞和大肠杆 菌)作为与谷胱甘肽S转移酶蛋白的融合蛋白或者作为附加了多个组氨酸的重组蛋白表 达时，所表达的重组蛋白可以用谷胱甘肽柱或镍柱纯化。在纯化融合蛋白之后，如果需 要，还可能通过用凝血酶或因子-Xa切割除去除目标蛋白之外的区域。
天然蛋白可以通过本领域技术人员已知的方法加以分离，例如通过使亲和柱与 表达该蛋白质的组织或细胞提取物接触，其中在亲和柱中结合有与如上所述的C2orfl8或 ANT2蛋白结合的抗体。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或任何修饰抗体，只要它 结合C2orfl8或ANT2蛋白即可。
C2orfl8或ANT2蛋白或其功能等价物也可以利用体外翻译系统在体外产生。
进一步，C2orfl8或ANT2蛋白的部分肽也可以用于本发明，只要它们保留彼此 之间的结合活性即可。这些部分肽可以通过遗传工程方法、已知的肽合成方法、或者用 合适的肽酶消化天然C2orfl8或ANT2蛋白来产生。对于肽合成，可以使用例如固相合 成或液相合成。可用于合成的传统肽合成方法包括
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
2) The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976 ；
3) Peptide Synthesis (日文)，Marazen Co.，1975 ；
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese)，Marazen Co.，1985 ；
5) Development of Pharmaceuticals (second volume)(曰 文)， Vol.14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；
6)W099/67288 ；和
7) Barany G.& Merrifield R.B., Peptides Vol.2, “ Solid Phase Peptide Synthesis"，Academic Press, New York, 1980，100-118.
多肽或其片段可以进一步与其它物质相连，只要该多肽或片段保留其原来的彼 此之间结合的能力即可。可用的物质包括肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然和合成聚合物等。可以实施这些类型的修饰以赋予多肽额外的功能或使和片段稳定。
在测试作用剂或化合物存在下进行接触的C2orfl8和ANT2多肽或其功能等价物 可以是，例如，纯化的多肽、可溶蛋白或与其它多肽融合的融合蛋白。
本发明的筛选方法提供了高效而快速的鉴定方法，可以鉴定很可能干扰C2orfl8 与其结合配偶ANT2之间的结合的测试作用剂或化合物。一般地，任何可以确定测试作 用剂或化合物干扰这种结合的能力的方法均适用于本发明。例如，可以采用ELISA形 式的竞争和非竞争性抑制测定。应当进行对照实验以确定系统的最大结合能力(例如使 C2orfl8与ANT2接触，并确定与C2orfl8结合的ANT2的量)。
作为鉴定可抑制蛋白间结合的作用剂或化合物的方法，可以使用本领域技术人 员众所周知的许多方法。这些鉴定可以作为体外测定系统实施，例如在细胞系统中实 施。更具体地，首先，C2orfl8或其配偶体ANT2与支持物结合，然后使另一蛋白与测试 作用剂或化合物一起与之接触。接着，温育混合物，清洗，并检测和/或测量与支持物 结合的另一蛋白。
可用于结合蛋白质的支持物的实例包括不溶性多糖，例如琼脂糖、纤维素和葡 聚糖；和合成树脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅橡胶(silicon)；优选地可以使用由 上述材料制成的商业可获得的珠子和平板(例如多孔板、生物传感器芯片等)。当使用珠 子时，可以将它们填充到柱子内。或者，磁珠的使用也是本领域已知的，使用磁珠能够 容易地通过磁力分离结合在珠子上的蛋白质。
蛋白与支持物的结合可以根据常规的方法进行，例如化学键合和物理吸附。或 者，可以通过特异识别该蛋白的抗体使蛋白与支持物结合。此外，还可以借助相互作用 的分子，例如亲和素与生物素的组合，来实现蛋白与支持物的结合。
蛋白间的结合在缓冲液中实施，缓冲液例如但不仅限于，磷酸盐缓冲液和Tris 缓冲液，只要该缓冲液不抑制蛋白间的结合即可。
在本发明中，可以使用利用表面等离子体共振现象的生物传感器作为检测或定 量结合蛋白的装置。当使用这种生物传感器时，蛋白之间的相互作用可以作为表面等离 子体共振信号实时地得到观察，仅需使用极少量的多肽并且无需标记(例如BIAcore， Pharmacia)。因此，有可能使用生物传感器例如BIAcore评估C2orfl8与ANT2之间的结口 O
或者，可以标记C2orfl8或ANT2，而且结合蛋白的标记物可以用来检测或测量 结合蛋白。具体地说，在预标记某种蛋白质之后，在测试作用剂或化合物的存在下使被 标记的蛋白与其它的蛋白接触，然后在清洗之后根据标记物检测或测量结合蛋白。
放射性同位素(例如3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 1311)、酶(例如碱性磷酸 酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶)、荧光物质(例如荧光素异 硫氰酸酯(FITC)、荧光黄、德州红(Texas red)、绿色荧光蛋白和若丹明)、磁珠(例如 DYNABEADS )、量热标记(calorimetric label)(例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚 苯乙烯、聚丙烯、乳胶(latex)等)球珠)、和生物素/亲和素等标记物质，可用于在本 发明方法中标记蛋白。如下专利教导了这些标记的使用，包括美国专利3,817,837、 3,850,752、3,939,350、3,996,345, 4,277,437、4,275,149 和 4,366,241。然而，本发明并不 仅限于此，任何可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测到的标记均可使用。
当蛋白用放射性同位素标记时，检测或测量可以通过液体闪烁实施。或者，用 酶标记的蛋白质可以通过添加酶的底物用吸收光度计检测底物的酶学变化，例如颜色产 生，加以检测或测量。而且，在使用荧光物质作为标记的情况下，结合蛋白可以用荧光 光度计加以检测或测量。
而且，本筛选方法中的结合还可以用针对C2orfl8或ANT2的抗体加以检测或测 量。例如，在使固定在支持物上的C2orfl8与测试作用剂或化合物和ANT2接触之后， 温育混合物并清洗，并可以用针对ANT2的抗体进行检测或测量。或者，可以将ANT2 固定在支持物上，并可以使用针对C2orfl8的抗体作为检测抗体。
当在本筛选中使用抗体时，抗体优选地用上面提到的一种标记物质标记，并根 据该标记物质进行检测或测量。或者，针对C2orfl8或ANT2的抗体可以用作第一抗体， 然后用标记有标记物质的第二抗体检测第一抗体。而且，在本发明筛选中与蛋白结合的 抗体可以用蛋白G或蛋白A柱加以检测或测量。
或者，在本发明鉴定方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系 统(〃 MATCHMAKERTwo-Hybridsystem"，“ MammalianMATCHMAKERTwo-Hybrid Assay Kit “， “ MATCHMAKER one-Hybridsystem “ (Clontech) ； “ HybriZAP Two-Hybrid Vector System “ (Stratagene)；参考文献"Dalton and Treisman, Cell 1992, 68: 597-612〃， “ Fields and Sternglanz, Trends Genet 1994, 10: 286-92〃)。在双 杂交系统中，例如，C2orfl8与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。 ANT2与VP16或GAL4转录激活区融合，在测试作用剂或化合物的存在下也在酵母细胞 中表达。或者，可以将ANT2和SRF结合区或GAL4结合区融合，而将C2orfl8与VP16 或GAL4转录激活区融合。当测试作用剂或化合物不抑制C2orfl8和ANT2间的结合时， 两者的结合激活报告基因，使阳性克隆可以被检测。作为报告基因，除了 HB3基因之 外，也可以使用例如Ade2基因、LacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
这里，C2orfl8与ANT2间的结合水平还可以作为C2orfl8与ANT2结合后发生 的任何变化而被测量。具体地，这种筛选可以通过使测试作用剂或化合物与表达C2orfl8 和ANT2的细胞(例如J82或UMUC细胞)接触来实施。例如，可以检测对细胞增殖的 抑制，以确定测试作用剂或化合物对C2orfl8与ANT2结合的影响。
1.竞争测定模式
竞争测定可以用于筛选本发明的测试作用剂或化合物。例如，竞争ELISA形 式可以包括与固体支持物结合的C2orfl8 (或ANT2)。 结合的C2orfl8 (或ANT2)与 ANT2(或C2orfl8)和测试作用剂或化合物温育。经过足够长时间以允许测试作用剂或 化合物和/或ANT2 (或C2orfl8)与C2orfl8 (或ANT2)结合之后，对底物进行清洗，除 去未结合的材料。然后确定与C2orfl8结合的ANT2的量。这可以用多种本领域已知的 方法中的任何一种实现，例如通过使用标记有可检测标签的ANT2(或C2orfl8)物质，或 者通过使经过清洗的底物与针对ANT2 (或C2orfW)的被标记抗体接触。与C2orfl8 (或 ANT2)结合的ANT2 (或C2orfl8)的量与测试作用剂或化合物干扰C2orfl8与ANT2结合 的能力成反比。Harlow & Lane，Antibodies, ALaboratory Manual (1988)中介绍了包括抗 体和标签在内的标准方法。
在一种变化形式中，用亲和标签标记C2orfl8(或ANT》。然后将被标记的 C2orfl8 (或ANT2)与测试作用剂或化合物和ANT2 (或C2orfl8) —起温育，然后免疫沉 淀。然后用针对ANT2 (或C2orfl8)的抗体对免疫沉淀物进行Western印迹。与前面的 竞争试验形式相同，被检测与C2orfl8 (或ANT2)结合的ANT2 (或C2orfl8)的量与测试 作用剂或化合物干扰C2orfl8与ANT2结合的能力成反比。
2.非竞争测定樽式
对于构建为不易用例如在本文中描述的竞争性测定进行筛选的形式的测试作用 剂或化合物文库，非竞争结合测定也可以用于初始筛选。这种文库的一个实例是噬菌体 展示文库(见例如 Barrett etal.，Anal Biochem 1992，204 357-64)。
使用噬菌体库是因为能够快速产生工作量的多种不同重组肽。噬菌体文库不适 合进行本发明的竞争测定，但可以有效地以非竞争模式进行筛�。范闹种刈殡淖魑� 与C2orfl8或ANT2结合的测试作用剂或化合物。对于在非竞争模式中鉴定的测试作用剂 或化合物，随后可以用本领域众所周知的任何方法来制备，并进一步用竞争测定模式进 行筛选。噬菌体和细胞展示文库的制备和筛选是本领域众所周知的，在例如下列文献中 有讨论Ladner et al.，WO 88/06630 ； Fuchs et al.，Biotechnology 1991，9 1369-72 ； Gowardetal., TIBS 1993，18: 136-40 ； Charbit etal., EMBO J 1986，5 3029-37; Cull etal., PNAS USA 1992, 89: 1865-9; Cwirla etal.，PNAS USA 1990, 87: 6378-82。
非竞争性测定的一个实例遵循与上面关于竞争测定所说明的相类似的程序，只 是不添加其中一种组分(C2orfl8或ANT》。然而，由于非竞争模式确定与C2orfl8或 ANT2结合的测试作用剂或化合物，需要为每种候选物确定测试作用剂或化合物与同时 C2orfl8和ANT2结合的能力。因此，例如，可以通过下述方法测定测试作用剂或化合 物与固定的C2orfl8的结合清洗掉未结合的测试作用剂或化合物；从支持物上洗脱结 合的测试作用剂或化合物，随后通过例如质谱、蛋白质定量(Bradford或Lowry测定或确 S^Onm吸光度)对洗脱物进行分析。或者，可以省略洗脱步骤，测试作用剂或化合物 的结合可以通过监视支持物表面上有机层的光谱性质来测定。监视表面光谱性质的方法 包括，但不仅限于，吸光度、反射、透射、双折射、折射系数、衍射、表面等离子体共 振、椭圆光度(ellipsometry)、共振镜技术(resonantmirror techniques)、光栅耦合波导技术 (grating coupled waveguide techniques)和多普勒共振光谱，所有这些都是本领域技术人员 已知的。本测定中也可以使用标记的测试作用剂或化合物，以免除对洗脱步骤的需要。 在这种情况下，在清洗掉未结合的材料后，与支持物结合的标记物的量与测试作用剂或 化合物的结合成正比。
已经开发了许多众所周知的机器人系统用于溶液相化学。这些系统包括自动化 工作站，例如由Takeda Chemicanndustries，LTD. (Osaka, Japan)开发的自动化合成装置 和许多利用机器人臂的机器人系统(Zymate II，ZymarkCorporation，Hopkinton, Mass.； Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.),它们模拟由化学家实施的人工合成操作。 上述的任何装置均适用于本发明。本领域技术人员显然能够想到对这些装置进行什么 性质的修改和如何实施这样的修改(如果有的话)，使它们能够像本文中描述地那样运 行。此外，相关领域技术人员大量的组合库本身是可以商业获得的(见例如ComGenex， Princeton, N.J.，Asinex, Moscow, Ru，Tripos, Inc., St.Louis, MO, ChemStar, Ltd,Moscow，RU，3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences，Columbia，MD，寸乂 O
根据本发明的一个方面，本筛选方法必需的组分可以作为试剂盒提供，用于筛 选可抑制C2orfl8和ANT2间结合的作用剂或化合物，或可抑制胰腺癌细胞增殖的作用剂 或化合物，或用于治疗或预防胰腺癌的作用剂或化合物。试剂盒可以包含例如C2orfl8多 肽或其功能等价物，和/或ANT2多肽或其功能等价物。进一步，试剂盒可以包括对照 作用剂(阳性和/或阴性)、可检测的标签、反应缓冲液、细胞培养介质、筛选所需的容 器、用于实施本方法的使用说明(例如文字、磁带、VCR、CD-ROM等)等。组分和试 剂可以包装在不同的容器内。
III.基于核苷酸的筛诜方法
III-I.使用C2orfl8基因的筛选方法
如上面所详细说明的，通过控制C2orfl8基因的表达水平，可以控制细胞生长或 C2orfl8相关疾病的发生和进展。因此，可以使用C2orfl8基因的表达水平作为指标进行 筛�。ǹ捎糜谝种葡赴せ蛑瘟苹蛟し繡2orfl8相关疾病的候选作用剂或化合物。 在本发明的内容中，这种筛选可以包括例如如下步骤
a)使测试作用剂或化合物与表达C2orfl8基因的细胞接触；
b)检测C2orfl8基因的表达水平；和
C)选择与不存在测试作用剂或化合物时检测到的水平相比可降低C2orfl8基因的 表达水平的测试作用剂或化合物。
根据本发明，可以评估测试作用剂或化合物对抑制细胞生长的治疗效果或者候 选作用剂或化合物对治疗或预防C2orfl8相关疾病的治疗效果。因此，本发明还提供了 用于筛选可抑制癌细胞增殖的候选作用剂或化合物的方法，和用于筛选用于治疗或预防 C2orfl8相关疾病的候选作用剂或化合物的方法。
在本发明的内容中，这种筛选可以包括例如如下步骤
a)使测试作用剂或化合物与表达C2orfl8基因的细胞接触；
b)检测C2orfl8基因的表达水平；和
c)将b)的表达水平与测试作用剂或化合物的治疗效果相关联。
在本发明中，可以将治疗效果和C2orfl8基因的表达水平相关联。例如，当与 不存在测试作用剂或化合物时检测到的水平相比，测试作用剂或化合物可降低C2orfl8基 因的表达水平时，测试作用剂或化合物可以被鉴定或选择作为具有治疗效果的候选作用 剂或化合物。或者，当与不存在测试作用剂或化合物时检测到的水平相比，测试作用剂 或化合物不降低C2orfl8基因的表达水平时，测试作用剂或化合物可以被鉴定或选择作为 没有显著治疗效果的作用剂或化合物。
更具体地，所述表达水平可以通过从下组选出的方法进行检测
(a)检测编码C2orfl8多肽或其功能等价物的mRNA的量；
(b)检测C2orfl8多肽或其功能等价物的量；和
(c)检测C2orfl8多肽或其功能等价物的生物活性。
优选地，表达C2orfl8多肽的细胞的细胞增殖活性可以作为所述生物活性被检 测。
在本发明中，细胞的特征是过表达C2orfl8，例如癌细胞，如胰腺癌细胞，胰腺 导管腺癌(PDAC)细胞。C2orfl8相关疾病的特征是过表达C2orfl8，例如癌症，如胰腺 癌，具体地胰腺导管腺癌(PDAC)。可以通过使表达C2orfl8基因的细胞与测试作用剂或 化合物接触，然后检测C2orfl8基因的表达水平，来鉴定可抑制C2orfl8基因表达的作用 剂或化合物。自然，也可以使用表达该基因的细胞群体代替单个细胞来实施鉴定。与不 存在测试作用剂或化合物时的表达水平相比，存在测试作用剂或化合物时检测到表达水 平降低，表明测试作用剂或化合物是C2orfl8基因的抑制剂，提示该测试作用剂或化合物 有可能用于抑制癌症，因此是治疗或预防癌症的候选作用剂或化合物。
基因的表达水平可以通过本领域技术人员周知的方法进行估计。C2orfl8基因的 表达水平可以用例如在“实施例”中说明的方法来确定。
用于这种鉴定的细胞或细胞群体可以是任何细胞或任何细胞群体，只要它表达 C2orfl8基因即可。例如，细胞或细胞群体可以是或者含有衍生自组织的上皮细胞。或 者，细胞或细胞群体可以是或者含有衍生自癌性细胞的永生细胞，包括来自胰腺癌，例 如PDAC，的永生细胞。表达C2orfl8基因的细胞包括例如从癌症建立的细胞系(例如 MIA_PaCA2)。而且，细胞或细胞群体可以是或者含有被C2orfl8基因转染的细胞。
本方法允许筛选各种作用剂或化合物，并且特别适合于鉴定功能核酸分子，包 括反义RNA、siRNA等。
III-2.使用C2orfl8基因转录调节区域的筛选方法
根据另一个方面，本发明提供了包括如下步骤的方法
a)使测试作用剂或化合物与引入了载体的细胞接触，其中该载体由C2orfl8基因 的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因构成；
b)检测所述报告基因的表达或活性；和
c)选择与不存在测试作用剂或化合物时检测到的水平相比，可降低所述报告基 因的表达或活性的测试作用剂或化合物。
根据本发明，可以评估测试作用剂或化合物对抑制细胞生长的治疗效果或者治 疗或预防C2orfl8相关疾病的候选作用剂或化合物的治疗效果。因此，本发明还提供了 用于筛选可抑制癌细胞增殖的候选作用剂或化合物的方法，和用于筛选用于治疗或预防 C2orfl8相关疾病的候选作用剂或化合物的方法。
在本发明的内容中，这种筛选可以包括例如如下步骤
根据另一个方面，本发明提供了包括如下步骤的方法
a)使测试作用剂或化合物与引入了载体的细胞接触，其中该载体由C2orfl8基因 的转调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因构成；
b)检测所述报告基因的表达或活性；和
c)将b)的表达水平与测试作用剂或化合物的治疗效果相关联。
在本发明中，可以将治疗效果和所述报告基因的表达或活性相关联。例如，当 与不存在测试作用剂或化合物时检测到的水平相比，测试作用剂或化合物可降低所述报 告基因的表达水平时，测试作用剂或化合物可以被鉴定或选择作为具有治疗效果的候选 作用剂或化合物。或者，当与不存在测试作用剂或化合物时检测到的水平相比，测试作 用剂或化合物不会降低所述报告基因的表达水平时，测试作用剂或化合物可以被鉴定或选择作为没有显著治疗效果的作用剂或化合物。
合适的报告基因和宿主细胞是本领域众所周知的。筛选所需的报告构建体可以 用C2orfl8基因的转录调节区域制备，可以根据基因的核苷酸序列信息从基因组文库获得 含有转录调节区域的核苷酸节段，作为上述C2orfl8基因的转录调节区域。
转录调节区域可以是例如C2orfl8基因的启动子序列。筛选所需的报告构建体可 以通过将报告基因序列连接于C2orfl8基因的转录调节区域来制备。这里的C2orfl8基因 的转录调节区域是如下的区域，从起始密码子到上游至少500bp，优选地上游lOOObp， 更优选地上游5000或lOOOObp。含有转录调节区域的核苷酸节段可以从基因组文库中 分离或者可以通过PCR扩增。鉴定转录调节区域的方法以及测定规程是众所周知的 (Molecular Cloningthird edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。 用含有所述报告构建体的载体转染宿主细胞，并通过本领域众所周知的方法检测报告基 因的表达水平或活性(例如使用光度计、吸收光度计、流式细胞仪等)。这里所定义的 “降低表达水平或活性”优选为比不存在化合物时使报告基因的表达水平或活性降低至少10%，更优选地降低至少25%，50%或75%，最优选地降低至少95%。
当使用与C2orfl8基因的调节序列(例如启动子序列)可操作连接的报告基因转 化细胞时，通过鉴定报告基因产物的表达水平可以鉴定测试作用剂或化合物是抑制还是 提高C2orfl8基因的表达。
作为报告基因，可以使用例如本领域众所周知的例如Ade2基因、IacZ基因、 CAT基因、萤光素酶基因、HIS3基因等。检测这些基因表达的方法是本领域众所周知 的。
III-3.选择适合于特定个体的治疗剂或化合物
不同个体的遗传构成上的差异会导致他们代谢各种药物的相对能力不同。对于 在受试者体内被代谢后发挥抗肿瘤作用剂或化合物功能的作用剂或化合物，它们可以通 过诱导受试者细胞中的基因表达模式的变化，使癌症状态的特征向非癌症状态的基因表 达模式特征改变，从而显示自身的存在。因此，利用C2orfl8基因，本文中公开了它在 癌性和非癌性细胞间具有差异表达，可以在来自所选受试者的测试细胞群体中对假定的 治疗或预防性癌症抑制剂进行检测，以确定该作用剂或化合物是否适合于在该受试者体 内抑制癌症。
为了鉴定适合于特定受试者的癌症抑制剂，将来自受试者的测试细胞群体暴露 于候选治疗剂或化合物，并确定C2orfl8基因的表达。在本发明方法的内容中，测试细 胞群体含有表达C2orfl8基因的癌细胞。优选地，测试细胞是上皮细胞。
具体地，可以将测试细胞群体在候选治疗剂或化合物的存在下温育，测量测试 细胞群体中C2orfl8基因的表达水平，并与一个或多个参考序型进行比较，例如癌性参考 表达序型、非癌性参考表达序型或不存在该治疗剂或化合物时的参考表达序型。
与治疗剂或化合物接触的测试细胞群体中与含有癌细胞的参考细胞群体或不存 在该作用剂或化合物的参考细胞群体相比，C2orfl8基因的表达水平降低表明该治疗剂或 化合物在该测试细胞群体所来源的受试者体内具有治疗潜力。
用于抑制细胞生长或治疗或预防癌症的组合物
通过本发明任何筛选方法鉴定的作用剂，针对C2orfl8基因的双链分子，和针对C2orfl8多肽的抗体，可抑制或阻碍C2orfl8基因的表达，或C2orfl8多肽的生物活性， 从而抑制细胞增殖。因此，本发明提供了用于抑制细胞生长的组合物或用于治疗或预防 C2orfl8相关疾病的组合物，该组合物包括通过本发明任何筛选方法鉴定的作用剂，例如 针对C2orfl8基因的双链分子，或针对C2orfl8多肽的抗体，肽模拟物、化合物或其组 合。在本发明中，细胞的特征是过表达C2orfl8，例如癌细胞，如胰腺癌细胞，具体地是 胰腺导管腺癌(PDAC)细胞。C2orfl8相关疾病的特征是过表达C2orfl8，例如癌症，如 胰腺癌，具体地是胰腺导管腺癌(PDAC)。本组合物可用于治疗或预防C2orfl8相关疾 �。绨┲ⅲ咛宓厥且认侔鏟DAC。
组合物可以作为药物用于人类和其它哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、家 兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩。
在本发明的内容中，用于本发明在下文详述的活性成分(包括筛选到的作用 剂、反义核酸、双链分子、抗体等)的合适药物制剂包括适合于口服、经直肠、经鼻、 局部(包括含服和舌下)、阴道或肠胃外(包括肌肉内、皮下和静脉内)给药的制剂，或 者通过吸入或吹入给药的制剂。优选地，给药是静脉内给药。制剂可以任选地包装成离 散的剂量单位。
适合于口服给药的药物制剂包括胶囊、微胶囊、扁胶囊和药片，分别含有预定 量的活性成分。合适的制剂还包括粉末、酏剂、颗粒、溶液、悬浮液和乳剂。活性成分 任选地作为大丸剂、药糖剂或糊剂施加。或者，根据需要，药物组合物可以非口服，处 于用水或任何其它可药用的液体配制的无菌溶液或悬浮液的注射剂形式。例如，本发明 的活性成分可以和可药用的载体或介质，具体地说，无菌水、生理盐水、植物油、乳化 剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定化剂、调味剂、赋形剂、载体(vehicle)、防腐剂、粘合 剂等混合成普遍接受的药物实践所需的单位剂量形式。这种制备物中所含活性成分的量 可以在指定的可得范围内实现合适的剂量。
可以掺混在药片和胶囊中的添加剂的实例包括，但不仅限于，粘合剂例如明 胶、玉米淀粉、黄芪胶(tragacanthgum)和阿拉伯胶；赋形剂例如结晶纤维素；膨胀剂例 如玉米淀粉、明胶和褐藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁；甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精；和 调味剂例如薄荷、红珠树油(Gaultheriaadenothrix oil)和樱桃(cherry)。药片可以通过压 缩或成形(任选地与一种或多种制剂成分一起)制成。压缩药片可以通过在合适的机械 内以自由流动形式，例如粉末或颗粒，压缩活性成分，并任选地与粘合剂、润滑剂、惰 性稀释剂、润滑、表面活性或分散剂混合，来制备。成形药片的制备可以通过在合适的 机械内成形用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物。药片可以根据本领域众所周知的方 法包衣。任选地还可以配制药片使活性成分在体内缓慢地或可控地释放。药片的包装可 以含有供每个月服用一片的片剂。而且，当单位剂量形式是胶囊时，除了上面的成分之 外，还可以进一步含有液体载体，例如油。
口服液体制备物可以处于例如水性或油性的悬浮液、溶液、乳液、糖浆或酏剂 (elixir)的形式，或者可以制备为干燥产品，用于在使用前用水或其它合适的载体重建。 这种液体制备物可以含有常规的添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水载体(其可以包括 食用油)或防腐剂。
用于肠胃外给药的制剂包括水成或非水成无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂(bacteriostats)和使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；并且水成和 非水成无菌悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。制剂可以以单位剂量或多剂量容器形式存 在，例如密封的安瓿和小瓶(vial)，并可以保存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即 将使用前添加无菌液体载体，例如盐、注射用水。或者，制剂可以被制备成用于连续灌 注。临时使用(Extemp0rane0us)的注射溶液或悬浮液可以用前述种类的无菌粉末、颗粒 或药片制备。
而且，用于注射的无菌组分可以遵循正常的适合于注射的药物实施方法使用溶 媒(例如无菌水)加以制备。生理盐水、葡萄糖和其它等渗液体，包括辅助剂，例如 D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，也可用作注射用水溶液。这些可以和合适 的增溶剂，例如醇如乙醇；多元醇(polyalcohols)如丙二醇和聚乙二醇；和非离子表面活 性剂如聚山梨醇酯80 (TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可以用作油质液体，其可以和作为增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲 醇联用，并可以和如下物质一起配制，例如缓冲剂如磷酸盐缓冲剂和乙酸钠缓冲剂；镇 痛剂如盐酸普鲁卡因；增溶剂如甲醇和苯酚；和/或抗氧化剂。所制备的注射剂可以被 填充到合适的安瓿中。
用于直肠给药的制剂包括具有标准载体例如可可脂或聚乙二醇的栓剂。用于在 口腔局部给药(例如向颊或舌下)的制剂包括锭剂(lozenges)，其含有的活性成分置于增 味基料(base)如蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶内；和糖锭剂(pastilles)，其含有的活性成分 置于基料如明胶、甘油、蔗糖或阿拉伯树胶中。为了活性成分的鼻内给药，可以使用液 体喷雾剂或可分散的粉末或者液滴的形式。液滴可以用水或非水基料制备，基料中还含 有一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。
为了通过吸入给药，组合物被方便地用吹药器(insufflator)、喷雾器、加压包装 或其它输送气溶胶喷雾的便利装置给药。加压包装可以包括合适的推进剂，例如二氟二 氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的场 合，剂量单位可以通过提供计量输送阀门加以确定。
或者，为了通过吸入或吹入给药，组合物可以采用干粉组合物的形式，例如活 性成分与合适粉末基料例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以按照单位剂量形 式处于例如胶囊、针剂、凝胶或气泡(blister)包装内，并在吸入器或吹药器的帮助下施 加该粉末。
其它的剂型包括释放治疗剂的可植入装置和贴剂(adhesive patch)。
如果期望，可以将上述制剂进行调整以适于恒定地释放活性成分再加以采用。 药物组合物还可以含有其它活性成分，例如抗微生物剂、免疫抑制剂或防腐剂。
应当理解，除了上面具体提到的成分之外，本发明的制剂还可以包括其它在本 领域中关于该具体剂型的传统作用剂，例如适合于口服的制剂可以包括增味剂。
优选的单位剂量制剂是含有有效剂量的每种本发明活性成分或其合适组分的制 剂，它们在下文“治疗C2orfl8相关疾病的方法” 一节中有叙述。
I.含有双链分子的组合物
本发明提供了用于阻止细胞生长和/或治疗或预防C2orfl8相关疾病的组合物， 其包括任何上述的或者通过上述本发明筛选方法筛选出的双链分子。本发明的双链分子可以适用于抑制细胞生长和预防或治疗C2orfl8相关疾病。
在一个实施方案中，包含本发明一种或多种双链分子的组合物可以被包裹在输 送囊泡(delivery vehicle)，例如脂质体中，载体和稀释剂及其盐内用于施加给受试者， 和/或可以以可药用的剂型提供。用于输送核酸分子的方法在下列文献中有介绍 Akhtar S & Juliano RL.Trends Cell Biol.l992May ； 2(5) 139-44. ； Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics, ed.Akhtar, 1995 ； Maurer N, et al.， Mol Membr Biol.l999Jan-Mar ； 16(1) 129-40. ； Hofland & Huang.Handb Exp Pharmacol. 1999137 165-192。 它进一步介绍了用于输送核酸分子的一般方法(US 6,395,713和WO 199402595)。这些规程可以用于输送几乎任何双链分子。双链分子可以通过多种本领 域技术人员已知的方法施用给细胞，包括但不仅限于，包裹在脂质体内，通过离子电 渗，或者通过掺入到其他囊泡内，例如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(见例如 Gonzalez H, etal.，Bioconjug Chem. 1999 Nov-Dec ； 10(6) 1068-74. ； WO 03/47518 和 WO 03/46185)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)和PLCA微球(见例如US 6,447,796 和US 2002130430)、生物可降解的纳米胶囊和生物粘性的微球，或者通过蛋白质性载体 (W020005372》。在另一个实施方案中，本发明的双链分子还可以制备或者与聚乙烯亚 胺及其衍生物络合，例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚 乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。在一个实施方 案中，本发明的双链分子如US20030077^9所述地加以制备(即基于液体的制剂)，本文 引用其全部内容作为参考。
本发明的双链分子还可以和其它治疗化合物一起施加给受试者，以提高整体的 治疗效果。使用多种化合物治疗病症可以提高有益的效果，同时降低副作用的发生。
在另一个实施方案中，本发明还提供了本发明双链分子在制造用于治疗或预防 表达C2orfl8基因的癌症的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及使用可抑制细胞内 C2orfl8基因表达的双链分子制造用于治疗表达C2orfl8基因的癌症的药物组合物，该分 子包括彼此杂交形成双链分子并且靶定SEQ ID NO 7或8的序列的有义链和与之互补的 反义链。
在另一个实施方案中，本发明还提供了本发明的双链核酸分子在治疗或预防表 达C2orfl8基因的癌症中的用途。或者，本发明进一步提供了用于制造治疗表达C2orfl8 基因的癌症的药物组合物的方法或过程，其中该方法或过程包括制备药物或生理可接受 的载体与抑制细胞内C2orfl8基因表达的双链分子的步骤，该分子包括有义链和与之互补 的反义链，它们彼此杂交形成该双链分子并靶定SEQ ID NO: 7或8的序列作为活性成 分。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于制造用于治疗表达C2orfl8基因的癌 症的药物组合物的方法或过程，该方法或过程包括将活性成分与药物或生理可接受的载 体掺混的步骤，其中该活性成分是可抑制细胞内C2orfl8基因表达的双链核酸分子，该 分子包括有义链和与之互补的反义链，它们彼此杂交形成该双链核酸分子并靶定SEQ ID NO 7或8的序列。
II.包括反义核酸的组合物
相应于C2orfl8基因核苷酸序列的反义核酸可用于降低在癌细胞中被上调的基因的表达水平，并可用于抑制细胞生长和癌症治疗，因此也包含在本发明内。反义核酸起 作用的方式是通过与C2orfl8基因的核苷酸序列或与之相应的mRNA结合，抑制该基因的 转录或翻译，促进mRNA的降解，和/或抑制由该基因编码的蛋白质的表达。因此，结 果，反义核酸抑制C2orfl8蛋白在癌细胞内发挥功能。这里，词组“反义核酸”是指特 异和靶序列杂交的核苷酸，不仅包括与靶序列完全互补的核苷酸，也包括具有一个或多 个核苷酸错配的核苷酸。例如，本发明的反义核酸包括与C2orfl8基因或其互补序列在至 少15个连续核苷酸的跨度上具有至少70%或者更高，优选地至少80%或者更高，更优选 地至少90%或者更高的同源性的多核苷酸。本领域已知的算法可用于确定这种同源性。
本发明的反义核酸通过与基因的DNA或mRNA结合，抑制它们的转录或翻译， 促进mRNA的降解，和抑制蛋白质的表达，最终抑制蛋白质发挥功能，从而对产生由 C2orfl8基因编码的蛋白的细胞发挥作用。
本发明的反义核酸可以通过与合适的对核酸无活性的基料混合而制成外用制备 物，例如擦剂或糊药。
另外，如果需要，本发明的反义核酸可以通过添加赋形剂、等渗剂、增溶剂、 稳定化剂、防腐剂、镇痛剂等被制备成药片、粉末、颗粒、胶囊、脂质体胶囊、注射 剂、溶液、滴鼻液和冻干剂。还可以使用负载有反义核酸的介质(antisense-mounting medium)以增加持久性和膜渗透性。实例包括但不仅限于脂质体、聚_L_赖氨酸、脂 质、胆固醇、Iipofectin或它们的衍生物。这可以通过已知的方法加以制备。
本发明的反义核酸可抑制C2orfl8蛋白的表达并可用于抑制该蛋白质的生物活 性。此外，可以使用表达抑制剂，包括本发明的反义核酸，因为它们能够抑制C2orfl8蛋 白的生物活性。
本发明的反义核酸包括经过修饰的寡核苷酸。例如，硫代寡核苷酸可用于为寡 核苷酸提供核酸酶抗性。
在另一个实施方案中，本发明还提供了本发明反义核酸在制造用于治疗表达 C2orfl8基因的癌症的药物组合物中的用途。
在另一个实施方案中，本发明还提供了本发明反义核酸在治疗或预防表达 C2orfl8基因的癌症中的用途。
或者，本发明进一步提供了用于制造用于治疗表达C2orfl8基因的癌症的药物组 合物的方法或过程，其中该方法或过程包括将药物或生理可接受的载体与作为活性成分 的本发明反义核酸一起配制的步骤。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于制造用于治疗表达C2orfl8基因的癌 症的药物组合物的方法或过程，其中该方法或过程包括混合活性成分与药物或生理可接 受的载体的步骤，其中该活性成分是本发明的反义核酸。
III.包含抗体的组合物
在癌症中过表达的C2orfl8基因的基因产物的功能可以通过施用与该基因产物结 合或者以其他方式抑制其功能的化合物加以抑制。这种化合物可以包括例如针对C2orfl8 多肽的抗体，该抗体可以用作细胞生长抑制剂或用于治疗或预防C2orfl8相关疾病的药物 组合物的活性成分。
本发明涉及针对由C2orfl8基因编码的蛋白质的抗体或抗体片段的用途。如这里所讨论的，术语“抗体”是指上述意思。
抗体可以通过与多种分子，例如聚乙二醇(PEG)偶联进行修饰。本发明包括此 类经过修饰的抗体。经过修饰的抗体可以通过抗体的化学修饰而获得。这些修饰方法是 本领域的常规方法。
或者，用于本发明的抗体可以是嵌合抗体，具有针对C2orfl8多肽的来自非人类 抗体的可变区和来自人类抗体的恒定区，或者是人源化抗体，其由来自非人类抗体的互 补决定区(CDR)、框架区(FR)和来自人类抗体的恒定区构成。这些抗体可以通过使用 已知的技术加以制备。人源化可以通过用啮齿动物的一个或多个CDR序列替代人类抗体 的相应序列来实现(见例如Verhoeyen etal.，Science 1988，239 1534-6) 因此，这些 人源化抗体是嵌合抗体，其中完整人可变区的很小一部分被替换成来自非人类物种的相 应序列。
还可以使用完全人抗体，其包括人类可变区以及人类框架区和恒定区。这些抗 体可以用各种本领域已知的技术产生。例如，体外方法涉及使用在噬菌体上展示的人 类抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom etal.，J MolBiol 1992，227:381-8)。类似 地，可以通过将人类免疫球蛋白座位引入到转基因动物例如小鼠体内来制备人类抗体， 这样的动物中内源免疫球蛋白基因被部分或者完全失活。该方法在例如下列美国专利中 有介绍Nos.6,150,584 ； 5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ；和 5,661,016。
当所得的抗体要施加给人类(抗体治疗)时，优选地使用人类抗体或人源化抗体 以减少免疫原性。
如上所得的抗体可以被纯化成均质。例如，抗体的分离和纯化可以根据用于 一般蛋白的分离和纯化方法来实施。例如，抗体可以通过适当地选择和组合使用柱色 谱加以分离和纯化，例如亲和色谱、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电 夕永、等电聚焦等(Antibodies A LaboratoryManuaLEd Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)),但是并不仅限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。 可以使用的蛋白A柱的实例包括例如Hyper D，POROS和Sepharose F.F. (Pharmacia)。
除了亲和之外，色谱的实例包括例如离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤、反 才目色谱、吸附色谱等(Strategies for Protein Purification andCharacterization A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。色 谱程序可以通过液相色谱，例如HPLC和FPLC实施。
在另一个实施方案中，本发明还提供了本发明抗体在制造用于治疗表达C2orfl8 基因的癌症的药物组合物中的用途。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于治疗或预防表达C2orfl8基因的癌症 的本发明抗体。或者，本发明进一步提供了制造用于治疗表达C2orfl8基因的癌症的药 物组合物的方法或过程，其中该方法或过程包括将药物或生理可接受的载体与作为活性 成分的本发明抗体配制的步骤。
在另一个实施方案中，本发明还提供了制造用于治疗表达C2orfl8基因的癌症的 药物组合物的方法或过程，其中该方法或过程包括将活性成分与药物或生理可接受的载 体混合的步骤，其中该活性成分是本发明的抗体。
抑制细胞牛长的方法
通过siRNA抑制胰腺癌细胞系中的内源C2orfl8可导致过表达C2orfl8的细胞的 生长被显著抑制，这提示了 C2orfl8在保持这些细胞生存力中的至关重要的作用。因此， 本发明涉及通过抑制C2orfl8的表达和/或C2orfl8蛋白的活性而抑制细胞生长。C2orfl8 的表达是被，例如，特异靶定C2orfl8基因的双链分子所抑制的。C2orfl8靶序列包括例 如SEQ ID NO: 7或8的核苷酸。在本发明中，细胞的特征是过表达C2orfl8，例如癌细 胞，如胰腺癌细胞，具体地PDAC细胞。
这些修饰方法可以离体或者在体外实施(例如通过将细胞与作用剂一起培养)， 或者在体内实施(例如通过向受试者施加作用剂)。这些方法涉及施加蛋白质，或蛋白质 的组合，或者核酸分子，或者核酸分子的组合，作为治疗手段来对抗C2orfl8基因的异常 表达或者其基因产物的异常活性。
因此，可用于本发明内容的作用剂包括例如
(i)由C2orfl8基因编码的多肽或其类似物、衍生物、片段或同源物；
(ii)C2orfl8基因或基因产物的抗体或其片段；
(iii)反义核酸或“功能异常(dysfunctional)，，的核酸(即由于C2orfl8基因核酸 内的异源插入)；(siRNA)
(iv)双链分子，例如小干扰RNA(SiRNA)；或
(ν)调节剂(即可改变C2orfl8多肽与其结合配偶体之间相互作用的抑制剂、拮 抗剂)。
利用功能异常反义分子通过同源重组“敲除”多肽的内源功能(见例如 Capecchi, Science 1989, 244 128892)。
水平增加可以通过如下的方法容易地检测到定量细胞内的肽和/或RNA， 并在体外测定RNA或肽的水平、结构和/或所表达肽的活性(或表达被改变的基因的 mRNA)。本领域众所周知的方法包括，但不仅限于，免疫测定(例如通过Western印迹分 析、免疫沉淀随后进行十二烷基硫酸钠6DS)聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)、 RT-PCR和/或杂交测定以检测mRNA的表达(例如Northern测定、点印迹、原位杂交等 ο
根据本发明的一个方面，可以使用通过本发明筛选到的作用剂。可以使用本领 域技术人员众所周知的方法施加这些作用剂。如果所述作用剂可以由DNA编码，则可以 将DNA插入到用于表达该DNA的载体内，并将该载体施加给细胞。为了将双链分子的 载体引入到细胞内，可以使用转染增强剂。FuGENE6 (Roche diagnostics)，Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen),禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可用 作转染增强剂。
治疗C2orfl8相关疾病的方法
治疗、减轻或预防C2orfl8相关疾病包括任何下列步骤例如手术除去过表达 C2orfl8的细胞、抑制癌性细胞的生长、退化或萎缩肿瘤、诱导缓解或抑制癌症发生。 C2orfl8相关疾病的有效治疗可降低患有C2orfl8相关疾病的个体的死亡率，改善其预 后，降低血液中肿瘤标志的水平，和减轻与C2orfl8相关疾病相伴的可检测症状。
通过siRNA敲低过表达C2orfl8基因的细胞系内的内源C2orfl8可导致细胞生长被显著抑制，提示C2orfl8在维持这些细胞生存能力方面起着至关重要的作用。因此， 本发明涉及通过抑制C2orfl8的表达和/或C2orfl8蛋白的活性来治疗或预防C2orfl8相 关疾病。C2orfl8的表达被，例如，特异靶定C2orfl8基因的双链分子所抑制。C2orfl8 靶序列包括例如SEQ IDNO 7或8的核苷酸。而且，C2orfl8的活性被抗_C2orfl8抗 体或肽模拟物所抑制。在本发明中，C2orfl8相关疾病的特征是过表达C2orfl8，例如癌 症如胰腺癌，具体地PDAC。
在本发明中，抑制性核酸可以作为裸核酸、或者与输送试剂结合、或者作为表 达该抑制核酸的重组质粒或病毒载体施用给受试者。
用于和本发明抑制核酸联合施用的合适的输送试剂包括Miras TnmsitTKO亲脂试 剂；Iipofectin ； Iipofectamine ； cellfectin ；或聚阳离子(例如聚赖氨酸)，或脂质体。优选的输送试剂是脂质体。
脂质体可以辅助将抑制性核酸输送到特定的组织，例如视网膜或肿瘤组织，还 可以增加抑制性核酸的血液半衰期。适用于本发明的脂质体用常规的囊泡形成性脂质形 成，此类脂质一般包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。一般对如下的因素的 考虑指导脂质的选择，例如期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期。已知有多 种方法用于制备脂质体，例如在下列文献中所述Szoka et al.，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 467 ；和美国专利Nos.4,235,871 ； 4,501,728 ； 4,837,028 ；和5,019,369，本文引 用其全部内容作为参考。
优选地，包裹本发明抑制性核酸的脂质体包括配体分子，其能够将脂质体输送 到癌症部位。与肿瘤细胞中普遍存在的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原结合的单克隆 抗体，是优选的。
特别优选地，包裹本发明抑制核酸的脂质体被修饰，从而避免被单核巨噬细胞 和网状内皮系统清除，例如通过具有与结构表面结合的调理作用抑制�？�。在一个实施 方案中，本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制�？楹团涮�。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制�？橥ǔＪ怯胫侍迥そ岷系拇笮颓� 水性聚合物。如在本说明书中所使用的，例如，当调理作用抑制�？榛У鼗蛭锢淼卮� 接在膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)插入膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直 接结合，则调理作用抑制模块与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物 形成保护性表层，显著地减少单核巨噬细胞系统(“MMS” )和网状内皮系统(” RES” ) 对脂质体的摄入；在例如美国专利第4,920,016号中对此有记载，后者的全部公开内容援 引并入本说明书。因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制模块修饰过的脂质体 能够保留在血液循环中的时间显著更长。出于以上理由，上述脂质体有时也被称为“隐 形”(stealth)脂质体。
已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管系统供给的组织中。因 此，在以这样的微血管系统缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率 地蓄积。参见 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18:6949-53。此外，由于 RES的摄入的减少，防止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体 的毒性。因此，用调理作用抑制�？樾奘蔚谋痉⒚鞯闹侍迥芄唤痉⒚鞯乃春怂岱� 子输送至肿瘤细胞。
适用于修饰脂质体的调理作用抑制�？橛叛∥肿恿吭�500 约40,000道尔 顿、更优选约2,000 约20,000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸 酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺 胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalcohols)，诸如化学结合有羧基或氨基的聚 乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG、或甲 氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与 聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑 制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛 酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡 糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通过与碳酸的衍生物反应而 连接了羧基的羧基化多糖类或寡糖。
优选地，调理作用抑制�？槭荘EG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物 修饰的脂质体有时称作“PEG化脂质体”。
调理作用抑制�？榭梢酝ü矶喙际踔械娜魏我恢纸岷系街侍迥ど�。例 如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结 合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右 旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na(CN)BH3和混合溶剂，如60°C的四氢 呋喃与水的30 12比例混合物。
上文讨论了表达本发明的双链核酸分子的载体。这样的表达至少一种本发明的 双链核酸分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂组合施用，所述合适的投递 试剂包括 Miras Transit LTl 亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin> 聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体。将表达本发明的抑制性核酸分子的重组病毒载体输送到患者 的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。
本发明的抑制性核酸可以通过任何适合于将抑制性核酸输送到癌症部位的方法 施加给受试者。例如，抑制核酸可以通过基因枪、电穿孔施用，或者通过合适的肠胃外 或肠道(enteral)途径施用。合适的肠道给药途径包括口服、直肠或鼻内给药。
合适的非消化道施用途径包括静脉内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动 脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿 瘤周围和肿瘤内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输 注(例如利用浸透压泵)，直接施用到癌症区域或其附近，例如借助导管或其它放置装置 (例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的视网膜片剂(retinal pellet)或栓剂或植入 物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链核酸分子或载体施用到癌症部位或其附近。
本发明的抑制性核酸可以以单剂量或者多剂量施用。当本发明的抑制性核酸通 过输注施用时，输注可以是单个持续剂量或者可以通过多次输注输送。优选地将作用剂 直接注射到位于癌部位处或其附近的组织内。尤其优选地，将作用剂多次注射到癌部位 处或附近的组织内。
本领域的技术人员还可以容易地确定用于将本发明的抑制性核酸施用于给定受 试者的合适剂量方案。例如，抑制性核酸可以一次性地，例如作为单次注射或沉积，施用给受试者癌症部位处或其附近。或者，抑制性核酸可以每天一次或两次施用给受试 者，历时大约3-大约观天，更优选地大约7-大约10天。在优选的剂量方案中，抑制 性核酸每天一次注射到癌症部位处或其附近，历时7天。当剂量方案涉及多次施用时， 应当理解施用给受试者的抑制性核酸的有效量可以包括在整个剂量方案期间施用的抑制 性核酸的总量。
分别以基因和基因产物的表达水平或生物活性增加(相对于没有罹患该疾病或 病症的受试者)为特征的疾病或病症可以用拮抗(即减少或抑制)该过表达基因的活性的 治疗方法进行治疗。拮抗活性的治疗方法可以治疗性或预防性施用。
因此，可以在本发明内容中使用的治疗方法包括例如
(i)由C2orfl8基因编码的多肽或其类似物、衍生物、片段或同源物；
(ii)C2orfl8基因或基因产物的抗体或其片段；
(iii)反义核酸或“功能异常(dysfunctional)，，的核酸(即由于在该过表达基因核 酸内的异源插入)；(SiRNA)
(iv)双链分子，例如小干扰RNA(SiRNA)；或
(ν)调节剂(即可改变过表达多肽与其结合配偶之间相互作用的抑制剂、拮抗 剂)。
功能异常反义分子用于通过同源重组“敲除”多肽的内源功能(见例如 Capecchi, Science 1989, 244 128892)。
水平增加可以通过如下的方法容易地检测到定量肽和/或RNA，通过获得受 试者组织样品(例如来自活组织检查)并在体外测定其中RNA或肽的水平、结构和/或 所表达肽的活性(或表达被改变的基因的mRNA)。本领域众所周知的方法包括，但不 限于，免疫测定(例如通过Western印迹分析、免疫沉淀随后进行十二烷基硫酸钠6DS) 聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)、和/或杂交试验以检测mRNA的表达(例如 Northern测定、点印迹、原位杂交等)。
预防给药发生在疾病明显临床症状显现之前，从而使疾病或病症被防止或者进 程延迟。在本发明的内容中，预防是任何可降低疾病的病死率负担或发病率的活动。预 防可以在一级、二级和三级预防水平上发生。一级预防避免疾病的发生，二级和三级水 平的预防涵盖旨在防止疾病进展和症状出现，以及通过恢复功能降低已经建立的疾病的 负面影响和减少疾病相关并发症的活性。因此，本发明包括广泛的旨在减轻C2orfl8相 关疾�。绨┲⑷缫认侔咛宓厮礟DAC，的严重程度的治疗方法。
本发明的治疗方法可以包括使细胞与可调节C2orfl8基因产物一种或多种活性的 作用剂接触的步骤。可调节蛋白活性的作用剂实例包括，但不仅限于，核酸、蛋白质、 这些蛋白的天然存在的同源配体、肽、肽模拟物和其它小分子。
因此本发明提供了通过降低C2orfl8基因表达或基因产物活性用于治疗或减轻受 试者体内癌症症状或者预防癌症的方法。本方法具体适合于治疗或预防C2orfl8相关疾 �。绨┲⑷缫认侔咛宓厮礟DAC。
合适的治疗剂可以预防性或治疗性施用给罹患或者具有发生C2orfl8相关疾病的 危险(易感)的受试者。这些受试者可以通过使用标准的临床方法加以鉴定，或者通过 检测C2orfl8基因的异常表达水平(“上调”或“过表达”)或基因产物的异常活性加以鉴定。
根据本发明的一个方面，通过本方法筛选得到的作用剂可以用于治疗或 预防癌症。本领域技术人员众所周知的方法可以用于施用这些作用剂给受试者， 例如作为动脉内、静脉内或经皮注射或者作为鼻内、经支气管、肌肉内或口服给 药。如果所述作用剂由DNA编码，则可以将DNA插入到用于基因治疗的载体内， 并将载体施用给受试者以实施治疗。为了将双链分子的载体引入到细胞内，可以 使用转染增强剂。FuGENE6 (Rochediagnostics)，Lipofectamine 2000 (Invitrogen)， Oligofectamine (Invitrogen)禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可以有用地作为转染增强 剂。
用于给药的剂量和方法随着待治疗患者的体重、年龄、性别、症状、病症和给 药方法而不同；然而本领域的技术人员可以常规地选择合适的剂量和给药方法。
例如，尽管与C2orfl8多肽结合并调节多肽活性的作用剂的剂量取决于前述的 各种因素，但是当正常成年人(60kg体重)口服时，剂量一般为每天大约O.lmg-大约 IOOmg,优选地每天大约l.Omg-大约50mg，更优选地每天大约l.Omg-大约20mg，。
当以注射的形式向正常成年人(60kg体重)肠胃外施用作用剂时，尽管不同的 患者、靶器官、症状和给药方法会出现一些差异，但是方便的是静脉内注射每天大约 O.Olmg-大约30mg，优选地每天大约O.lmg-大约20mg，更优选地每天大约O.lmg-大约 IOmg的剂量。在其它动物的情况下，合适的剂量可以同归转化成60kg体重加以计算。
类似地，本发明的药物组合物可以用于治疗或预防癌症。本领域技术人员众所 周知的方法可用于将组合物施用给受试者，例如作为动脉内、静脉内或者经皮注射，或 者作为鼻内、经支气管、肌肉内或经口给药。
对于每种前述病症，组合物，例如多肽和有机化合物，可以经口或者通过注射 给药，剂量范围为每天大约0.1-大约250mg/kg。成年人的计量范围一般为大约5mg-大 约17.5g/日，优选地大约5mg-大约IOg/日，最优选地大约IOOmg-大约3g/日。药片 或其它单位剂量形式的以离散单位提供的药物可以方便地含有在这种剂量下或者作为多 次剂量下有效的量，例如含有大约5mg_大约500mg，通常大约IOOmg-大约500mg的单 位。
所用的剂量取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重和性别，待治疗的确切 病症和其它严重程度。同时，给药的途径也随着病症及其严重程度而不同。在任何情况 下，合适的和最佳的剂量可以由本领域技术人员通过考虑上述因素常规地计算出来。
具体地，针对C2orfl8基因的反义核酸可以通过直接施用到患病部位或者通过注 射到血管内从而到达患病部位而施用给患者。
本发明反义核酸衍生物的剂量可以根据患者的病症和所用的期望量而合适地进 行调节。例如，可以施用的剂量范围是0.1-100mg/kg，优选地0.1-50mg/kg。
[发明模式1]
下面，本发明将参考实施例进行更加详细的介绍。然而，下面的材料、方法和 实施例仅仅是举例说明本发明的多个方面，并不意图对本发明的范围进行限制。因此， 与这里所述相似或等价的方法和材料也可以用于实施或测试本发明。
一般方法
1.细胞系和临床样品
PDAC 细胞系 MIA_PaCa2 和 Panc-I，禾PNIH3T3，HEK-293T 和 COS7 细胞购自 ATCC (美国典型培养物保藏中心)。PDAC细胞系KLM-1，PK-59，PK-45P, SUIT-2 和PK-I由东北大学(仙台，日本)生物医学研究细胞资源中心提供。所有的Panc-1， KLM-1, PK-59, PK-45P, SUIT-2 禾Π PK-I 细胞系均在 RPMI-1640 (Invitrogen， Carlsbad, CA)中生长，所有的 COS-7，NIH3T3, HEK-293,禾Π MIA_PaCa2 细胞系均 在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM) (Invitrogen)中生长。所有细胞系均在补充有 10%胎牛血清(FBS)和抗生素/抗真菌剂溶液的合适培养基中单层生长，并且保持在 37°C含有5% C02的气氛中。冷冻的并且石蜡包埋的PDAC组织从手术样品获得，手术 样品是在获得了合适的知情同意后在大阪癌症和心血管疾病医学中心切除的。本研究使 用这些临床样品得到了东京大学医学科学研究所IRB和大阪癌症与心血管疾病医学中心 IRB的批准。
2.半定量 RT-PCR
来自胰腺癌组织的PDAC细胞和正常导管上皮细胞的纯化如前所述(Nakamura T，et al.0ncogene.2004 Mar 25 ； 23(13) 2385-400.)。对来自纯化 PDAC 细胞和正常胰 腺导管上皮细胞的RNA用基于T7的体外转录(Epicentre Technologies, Madison, WI) 进行两轮RNA扩增，合成单链cDNA。用Trizol试剂(Invitrogen)根据制造商推荐的程 序提取来自人类胰腺癌细胞系的总RNA。所提取的RNA用DNase I (Roche Diagnostic, Basel, Switzerland)处理，并用 oligcKdT)引物和 Superscript II 反转录酶(Invitrogen)反 转录成单链cDNA。制备每种单链cDNA的合适稀释物用于随后的PCR扩增，通过监视 α -微管蛋白(TUBA)作为定量对照物。使用如下的引物序列
5' -AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3‘ 6EQIDN0:1)禾口
5' -CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3‘ 6EQ ID NO 2)用于 TUBA，
5 ‘ -GGTAGCTCAGTCATAAAACACCG-3 ‘ (SEQ ID NO 3)禾口
5 ‘ -GTCTCTCCATCATCCTCACTGTC-3 ‘ (SEQ ID NO 4)用于 C2orfl8(NM_017877)。
所有的反应涉及在 GeneAmp PCR system 9700 (ΡΕ Applied Biosystems, Foster,CA)上进行最初94°C变性2η ι，随后经过23个循环(对于TUBA)或28个循环(对于 C2orfl8)94°C 30s, 55°C 30s,和 72°C 30s。
3.Northern 印迹分析
用Trizol试剂(Invitrogen)从14个胰腺癌细胞系提取总RNA，并进行Northern 印迹分析。用DNase I (Nippon Gene)处理后，用mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare， Piscataway, NJ)根据制造商的方案纯化mRNA。取1微克来自胰腺癌细胞的每种mRNA 以及从正常成人心脏、肺、肝脏、肾脏、骨髓和胰腺分离的mRNA(BD Biosciences，Palo Alto, CA)在变性琼脂糖凝胶上进行分析，并转移到尼龙膜上。将该癌症膜和人多组 织印迹(Clontech，PaloAlto，CA)与 32P-标记的 C2orf 18 cDNA 杂交 16 小时，其中 32P-标 记的 C2orfl8cDNA 是用 Afcga Label 试剂盒(GE Healthcare)标记的。用引物 5 ‘ -GGTAG CTCAGTCATAAAACACCG-3 ‘ 6EQ ID NO 3)和 5 ‘ —GTCTCTCCATCATCCTCACTGT C-3 ‘ (SEQ ID NO 4)制备C2orfl8 cDNA的-个232bp PCR产物作为探针。预杂交、杂交和清洗的实施按照制造商的使用说明。印迹在-80°C放射自显影10天。
4.C2orf_a,器侧一料口免趣织、仆岸械
由Sigma-Aldrich日本(石狩，日本)制备了分别对应于C2orfl8蛋白(Genbank 登录号NP_060347，SEQ ID NO 12)密码子70-86和密码子351-371区域的两条 肽(CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)禾口 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQID NO 6),用它们的混合物免疫两只家兔。免疫血清在装填有可偶联每种肽抗原的 Affi-Gel 10活化亲和介质(Bio-Rad Laboratories，Hercules, CA)的亲和柱上根据基本的 方法学进行纯化。来自PDAC的常规组织切片从手术样品获得，手术样品是在Osaka癌 症与心血管疾病医学中心在获得了合适的知情同意的前提下切除的。将切片脱蜡，并在 pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中在108°C下高温灭菌15η ι。在过氧化物酶阻断试剂(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)中温育30分钟以灭活内源过氧化物酶活性。用胎牛血清温 育封闭之后，将切片用兔抗_C20rfl8多克隆抗体(1 1500稀释)在室温下温育1小时。 用PBS清洗后，用过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白(Envision kit，Dako Cytomation)进 行免疫检测。最后，反应物用3，3' - 二氨基联苯胺(DakoCytomation)显影。用苏木 精进行复染。
5.C2orfl8特异的小干扰RNA(siRNA)表汰构津体
为了下调PDAC细胞内的内源C2orfl8表达，使用psiU6BX3.0载体表 达针对靶基因的短发夹RNA，如前所述(Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1) 105-12.)。U6启动子被克隆到基因特异序列的上游(来自靶转录 本的19-nt序列与该序列的反向互补物被一个短接头TTCAAGAGA分开)，以 5个胸腺嘧啶作为终止信号，并有一个neo盒子用于遗传霉素(Invi-trogen)筛 选。C2orfl8 的靶序列是 5 ‘ -GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3 ‘ (SEQID NO 7) (#196)，5 ‘ -GCACGACAGTCAGCACAAG-3 ‘ (SEQ ID NO 8) (#574)和 5 ‘ -GTGACTTCCTCTTTATGGA-3 ‘ (SEQ ID NO 9) (#3254)，阴性对照的靶序列是 5' -GAAGCAGCACGACTTCTTC-3 ‘ 6EQ ID NO 10) (siEGFP)。将人 PDAC 细胞 系，MIA_PaCa2和Panc-I细胞，涂布在ΙΟ-cm平板上，并分别用#196，#574，#32 或siEGFP siRNA表达载体用FuGENE6 (Roche)根据制造商的使用说明进行转染。细胞 用 0.8mg/ml (用于 MIA_Paca2)，或 1.0mg/ml (用于 Panc-Ι)遗传霉素(Invitrogen)进行 筛选。在转染7天后收集细胞，通过用上述引物进行则RT-PCR对C2orfl8的敲低效果 进行分析。在含有遗传霉素的合适培养基中培养9天后，将细胞用100%甲醇固定，用 0.1%结晶紫-H20染色，进行集落形成测定。
在3- ，5-二甲基-2-噻唑)_2，5_ 二苯基溴化四唑(MTT)测定中，在转染 11天后，用细胞计数试剂盒_8(DOJINDO，熊本，日本)测量细胞存活能力。用酶标仪 550 (Bio-Rad)测量490nm吸光度，以630nm吸收作为参考。
siRNA 序列
[表1]
权利要求
1.一种检测或诊断受试者中癌症的方法，包括确定受试者来源的生物样品中C2orfl8 的测试表达水平的步骤，其中所述水平与C2orfl8正常对照水平相比的增加表明所述受试 者罹患癌症或者具有发生癌症的危险，其中C2orfl8的测试表达水平通过选自下组的任何 一种方法确定(a)检测C2orfl8 的 mRNA，(b)检测由C2orfl8编码的蛋白，和(C)检测由C2orfl8编码的蛋白的生物活性。
2.权利要求1的方法，其中所述增加对应于比所述正常对照水平高至少10%的测试 C2orfl8表达水平。
3.权利要求1的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
4.权利要求1的方法，其中通过检测C2orfl8探针与所述受试者来源生物样品的基因 转录本的杂交来确定C2orfl8表达水平。
5.权利要求1的方法，其中通过检测针对由C2orfl8基因编码的蛋白质的抗体的结合 来确定C2orfl8表达水平。
6.权利要求5的方法，其中所述抗体识别由氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)构成的C2orfl8表位。
7.权利要求1的方法，其中受试者来源的生物样品是活组织检查。
8.一种筛选用于治疗或预防癌症的候选作用剂或能够抑制癌细胞生长的C2orfl8多肽 激动剂或拮抗剂的候选物的方法，所述方法包括如下步骤a)使测试作用剂与由C2orfl8编码的多肽接触；b)检测所述多肽与所述测试作用剂之间的结合活性；和c)选择结合该多肽的测试作用剂。
9.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选作用剂的方法，所述方法 包括如下步骤a)使测试作用剂与表达C2orfl8的细胞接触；b)检测步骤a)中细胞内的C2orfl8表达水平；和c)选择与不存在该作用剂时检测到的C2orfl8的表达水平相比，降低步骤a)的细胞 中C2orfl8的表达水平的测试作用剂。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞包括胰腺癌细胞。
11.一种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法 包括如下步骤a)使测试作用剂与由C2orfl8编码的多肽接触；b)检测步骤a)的多肽的生物活性；和c)选择与不存在该测试作用剂时检测到的生物活性相比，抑制步骤a)的多肽的生物 活性的测试作用剂。
12.权利要求11的方法，其中该生物活性是细胞增殖活性。
13.—种筛选用于治疗或预防癌症或抑制癌细胞生长的候选作用剂的方法，所述方法 包括如下步骤a)使测试作用剂与引入了如下载体的细胞接触，该载体包括C2orfl8基因的转录调节 区和在所述转录调节区控制下表达的报告基因；b)检测所述报告基因在步骤a)的细胞内的表达或活性水平；和c)选择与不存在该测试作用剂时的水平相比，降低所述报告基因在步骤a)的细胞中 的表达或活性水平的测试作用剂。
14.权利要求8，9，10或13中任一项的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
15.一种鉴定可抑制C2orfl8与ANT2之间结合的作用剂的方法，所述方法包括如下 步骤a)使选自下组的第一多肽i)包含氨基酸序列SEQID NO 12的多肽；ii)包含氨基酸序列SEQID NO : 12的多肽，其中添加、替换、删除或插入了一个 或多个氨基酸，条件是该多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO : 12组成的多肽等价的对 ANT2的结合活性；iii)包含与由氨基酸序列SEQID NO 12构成的多肽具有至少大约80%同源性的氨 基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由氨基酸序列SEQID NO: 12构成的多肽等价的 对ANT2的结合活性；和iv)由在严格条件下与由核苷酸序列SEQID NO: 11构成的多核苷酸杂交的多核苷 酸编码的多肽，条件是该多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO 12组成的多肽等价的对 ANT2的结合活性；在作用剂的存在下与选自下组的第二多肽接触i)包含氨基酸序列SEQID NO 26的多肽；ii)包含氨基酸序列SEQID NO : 26的多肽，其中添加、替换、删除或插入了一个 或多个氨基酸，条件是该多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO : 26构成的多肽等价的对 C2orfl8的结合活性；iii)包含与由氨基酸序列SEQID NO 26构成的多肽具有至少大约80%同源性的氨 基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由氨基酸序列SEQID NO: 26构成的多肽等价的 对C2orfl8的结合活性；iv)由在严格条件下与由核苷酸序列SEQID NO: 25构成的多核苷酸杂交的多核苷 酸编码的多肽，条件是该多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO 26构成的多肽等价的对 C2orfl8的结合活性；b)检测所述第一多肽与第二多肽之间的结合水平；c)比较所述第一和第二多肽的结合水平与不存在该作用剂时检测到的结合水平；和d)选择降低所述第一和第二多肽间结合水平的作用剂。
16.一种抑制受试者中癌细胞生长的方法，包括向所述受试者施用双链分子的步骤， 其中所述双链分子降低C2orfl8的表达水平。
17.权利要求16的方法，其中所述双链分子包含C2orfl8的有义核酸和反义核酸。
18.权利要求17的方法，其中该双链分子包括相应于由SEQID NO 7或8构成的序 列的核苷酸序列作为靶序列。
19.权利要求18的方法，所述双链分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是相应于由SEQIDNO : 7或8构成的序列的核苷酸序列，[B]是由大约3个到大约23个 核苷酸构成的核苷酸序列，而[A']是由[A]的互补序列构成的核苷酸序列。
20.权利要求16的方法，其中将所述双链分子与转染增强剂一起施用给受试者。
21.权利要求16的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
22.一种用于治疗或预防癌症的组合物，所述组合物包括药学有效量的针对C2orfl8 的双链分子作为活性成分，和可药用的载体。
23.权利要求22的组合物，其中该双链分子包括由SEQID NO 7或8构成的核苷酸 序列作为靶序列。
24.权利要求22的组合物，其中该双链分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中 [A]是相应于核苷酸序列SEQ ID NO 7或8的核苷酸序列，[B]是由大约3个到大约23 个核苷酸构成的核苷酸序列，而[A']是与[A]互补的核苷酸序列。
25.一种用于治疗或预防癌症的组合物，包括药学有效量的编码针对C2orfl8的双链 分子的载体作为活性成分，和可药用载体。
26.权利要求22或25的组合物，其中所述癌症是胰腺癌。
27.—种双链分子，包括有义链和反义链，其中该有义链包含相应于由SEQID NO: 7或8构成的靶序列的核苷酸序列，并且其中该反义链包含与所述有义链互补的核苷酸序 列，其中所述有义链和所述反义链彼此杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子 在被引入到表达C2orfl8基因的细胞内时抑制所述基因的表达。
28.权利要求27的双链分子，其中所述有义链的长度为大约19个-大约25个核苷酸。
29.权利要求28的双链分子，其中所述双链分子是单个核苷酸转录本，其包含通过单 链核苷酸序列连接的有义链和反义链。
30.权利要求29的双链分子，其中所述双链分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'， 其中[A]是由SEQ ID NO: 7或8构成的核苷酸序列，[B]是由大约3个到大约23个核苷 酸构成的核苷酸序列，而[A']是与[A]互补的核苷酸序列。
31.一种载体，包括含有有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸的组合中的任一个或二 者，其中所述有义链核酸包含核苷酸序列SEQIDNO : 7或8，并且所述反义链核酸包含 与所述有义链互补的序列，其中所述有义链和所述反义链的转录本彼此杂交形成双链分 子，并且其中所述载体在被引入到表达C2orfl8基因的细胞内时抑制细胞增殖。
32.载体，包括含有有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸的组合中的任一个，其中所 述有义链核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO : 7或8，并且所述反义链核酸包含与所述有义 链互补的序列，其中所述有义链和所述反义链的转录本彼此杂交形成双链分子，并且其 中所述载体在被引入到表达C2orfl8基因的细胞内时抑制细胞增殖。
33.权利要求31的载体，其中所述转录本进一步包含连接所述有义链和所述反义链的 单链核苷酸序列。
34.权利要求33的载体，其中所述多核苷酸具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中 [A]是由SEQ ID NO : 7或8构成的核苷酸序列，[B]是由大约3个到大约23个核苷酸构 成的核苷酸序列，而[A']是与[A]互补的核苷酸序列。
35.一种与C2orfl8蛋白结合的抗体。
36.权利要求35的抗体，其中该抗体识别由氨基酸序列CRAAGQSDS SVDPQQPF (SFQ ID NO 5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)构成 的C2orfl8表位。
37.一种用于检测受试者体内的癌症的作用剂，其包括权利要求35的抗体。
全文摘要
本文描述了用于检测或诊断发生癌症(特别是胰腺癌)的倾向的客观方法。在一个实施方案中，该诊断方法涉及利用抗-C2orf18抗体确定C2orf18表达水平的步骤。本发明进一步提供了筛选可用于治疗C2orf18相关疾病(例如癌症，如胰腺癌)的治疗剂的方法，抑制细胞生长和治疗或减轻其症状的方法。本发明还提供产品，例如多核苷酸、多肽、和载体双链分子、抗体、载体和由它们构成的组合物。
文档编号G01N33/15GK102026672SQ20098011719
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月10日 优先权日2008年3月12日
发明者中川英刀, 中村佑辅, 中鹤修一 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司
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