专利名称：一种基于γ-Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub>@Au复合纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种致病菌的快速检测方，尤其涉及一种基于r_ Fe2O3OAu复合纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法。
背景技术：
基本原理:单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。其主要的原理步骤:1.利用种子生长法制备了磁性r_ Fe2O3OAu核壳纳米粒子，通过修饰抗体实现表面功能化，将单克隆抗体偶联在磁珠表面，形成特异性免疫磁珠，并将多余活性位点封闭。2.将另一部分目标菌的特异性单克隆抗体采用一定的方法固定在固相载体表面，并将多余活性位点封闭。3.将制备的特异性免疫磁珠用于抓取富集目标菌，通过外加磁场将磁珠分离出来，此时，结合了目标菌的磁珠和没有结合目标菌的磁珠还是混在一起。4.将上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相载体表面，则抓取了目标菌的磁珠将与固相载体表面单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗可以将未发生结合的磁珠洗脱。5.再采用洗脱剂将固定载体上的结合的特异性纳米免疫磁珠洗下来，清洗掉离子、溶剂。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目标菌的磁珠。由于Fe2O3OAu具有顺磁和超顺磁特性，对于共振仪器非常敏感，相对于其他分子而言，微量的Fe2O3OAu能够大幅降低无菌的去离子水的自旋-晶格驰豫参数Tl和自旋-自旋弛豫时间T2，而无菌的去离子水在一定的均匀场强下，T1/T2是固定的。将洗脱液置于核磁共振仪中，与无菌的去离子水对照组进行对照。显著发生T1/T2值降低的说明有磁珠存在，从而间接说明食品样品中有致病菌检出。磁珠含量与T1/T2值降低呈正比。通过加标，可以定量检测目标菌。该方法中r_ Fe2O3OAu磁珠既是分离富集的手段，同时r_ Fe2O3OAu具有的顺磁和超顺磁特性，又可作为定量检测的探针。该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间，核磁共振检测只需几分钟。因此，用该方法可做大规模待检样本的阳性筛�。斐龅难粜匝剐栌梦⑸锱嘌腥分�。目前，国内外还没有文献报道这种方法，但是采用免疫磁珠进行致病菌的富集、目标物的富集等的报道还是很多的，但都没有采用核磁共振做进一步的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于r - Fe2O3OAu复合纳米粒子的NMR食源性致病菌快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价，该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。一种基于r - Fe2O3OAu的NMR纳米探针的核磁共振技术快速检测出食品中的有害致病菌的方法，核磁共振仪对顺磁、超顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与r_ Fe2O3OAu纳米粒子超顺磁免疫磁珠含量的相关性指标。不同的致病菌检出下限不同。该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分离，从核磁共振弛豫信号参数变化的角度，检测出样品中的有害致病菌；采用偶联了特异性单克隆抗体的超顺磁免疫磁珠，可以将样品中的特异性致病菌进行富集；由于核磁共振仪自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率对r_ Fe2O3OAu纳米粒子非常敏感，即在去离子水中，存在微量的超顺磁r - Fe2O3OAu纳米粒子，则水的自旋-晶格弛豫时间(Tl)和/自旋-自旋弛豫(T2)就会显著下降。在一定条件下，超顺磁免疫磁珠的顺磁特性使核磁共振的弛豫衰减信号T2/T1产生线性减小。通过定量检测出样品中的免疫磁珠含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与磁珠含量线性相关，拟合度较好。最终以超顺磁免疫磁珠与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。本发明是这样实现的，步骤如下:
1)检测目标菌的特异性免疫磁珠的制备；
2)将目标菌特异性单克隆抗体固定在固相载体表面；
3)免疫磁珠富集目标菌株，并分离:将第I步制得的免疫磁珠加入待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁�。虼胖榫突慵酱懦∫槐撸呱锨逡涸蚩梢苑掷氤龃胖槿舸煅局杏心勘昃虮淮胖樗患由倭课蘧娜ダ胱铀蛐纬赡勘昃拇胖樾匾海�
4)将富集的磁珠悬浊液加到第2步制作的固定了单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心；用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉；
5)之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠就是抓到目标菌的磁珠；
6)这部分磁珠，加入无菌的去离子水形成磁珠的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定，以无菌的去离子水为空白，测得的悬浊液的弛豫时间T1/T2相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有磁珠，从而间接证明样本中有目标致病菌，磁珠的量与T1/T2的下降呈正比，可以通过定量磁珠而间接定量出目标菌的量。所述NMR纳米探针为r- Fe2O3OAu材料，Y晶形的纳米粒径小于1000纳米。所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间特性参数的变化。所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间(Tl)和自旋-自旋弛豫时间(T2)。所述弛豫时间特性，Tl采用180° -T -90°脉冲方法测定，T2采用CPMG序列方法测定。本发明的有益效果:本发明提供一种客观的快速检测出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依赖于建立的可用于检测超顺磁免疫磁珠的核磁共振检测方法。该方法可以客观有效地对食品中有害致病菌进行检测，相比于致病菌的生物培养确认，该方法具有快速检测的优势，可以用于大规模样本的快速筛选。
具体实施例方式实例I
检验食品样本中测定其是否含有有害致病菌——李斯特菌。1.免疫磁珠制备:
r- Fe2O3纳米粒子可以采用化学共沉淀法制备，也可采用其他方法制备。如将ImL稀释后的r- Fe2O3与同体积0.1 mol/L柠檬酸钠混合，稀释到20mL，搅拌下加入过量80mmol/L NH2OH HCl溶液后再滴加0.1% (重量比)HAuCl4溶液2mL，反应I h后经洗涤分离即得到r_ Fe2O3OAu。免疫r- Fe2O3OAu制备:r- Fe2O3OAu浓缩后加入过量的李斯特菌抗体，孵育、洗涤后，加过量的BSA封闭表面活性空位，洗涤、重悬�。４嬖�4 °C待用。也可采用以下方法:采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰
(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入李斯特菌单克隆单抗，即将100 KL100只g/mL-单克
隆抗体通过共价偶联法固定在Au上并37°C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，I小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。2.单克隆抗体固定:可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5X5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2-4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入李斯特菌单克隆单抗，即将
100 ML 100 Mg/mL.单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板 上并37 °C孵育45 min。
加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。3.将食品样本进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样本。将第一步制得的免疫单克隆抗体磁珠加入后进行充分震荡数分钟。上磁力架分离磁珠，加少量无菌的去离子水得到磁珠的悬浊液。此时，如果待检样本中有目标李斯特菌，则通过免疫磁珠的特异性反应就达到了目标菌富集的目的。将此富集的磁珠悬浊液加到第2步所制备的单克隆抗体固定板上，则磁珠乳液中结合了李斯特菌的磁珠会进一步与固定板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合李斯特菌的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有结合了李斯特菌的磁珠。4.用洗脱液(甲醇等)将固定板上的结合了李斯特菌的磁珠洗脱下来。上磁力架，分离磁珠并清洗1-2次，将离子洗去。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司或miniNMR华东师范大学)测定溶液的Tl和T2。以无菌的去离子水为空白，溶液测得的Tl/T2与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有磁珠存在，从而说明样本中有李斯特菌，磁珠的量与T1/T2的下降值呈正比。下降的越多说明磁珠越多，从而间接说明李斯特菌越多，通过加标验证可以定量检测样本中目标菌的数目。
具体实施例方式实例2测定食品样品是否含有有害致病菌大肠杆菌0157:H7。1.r- Fe2O3纳米粒子可以采用化学共沉淀法制备，也可采用其他方法制备。如将ImL稀释后的r_ Fe2O3与同体积0.1 mol/L柠檬酸钠混合，稀释到20mL，搅拌下加入过量80 mmol/L NH2OH HCl溶液后再滴加0.1% (重量比)HAuCl4溶液2mL，反应I h后经洗涤分离即得到r_ [email protected]。免疫r- Fe2O3OAu制备:r_ Fe2O3OAu浓缩后加入过量的0157:H7抗体，孵育、洗涤后，加过量的BSA封闭表面活性空位，洗涤、重悬�。４嬖�4 °C待用。也可采用以下方法:采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，
二甲基亚砜稀释DSP)。加入0157:H7单克隆单抗，即将100 ML 100 Rg/mL.单克隆抗体
通过共价偶联法固定在Au上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，I小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。2.单克隆抗体固定:可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5X5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2-4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入0157:H7单克隆抗体，即将
100 PL 100 Pg/mL.单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。
加入牛血清蛋白将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。3.将食品样本进行预处理，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样本。将第一步制得的免疫单克隆抗体磁珠加入后进行充分震荡数分钟。上磁力架分离磁珠，加少量水得到磁珠的乳液。此时，如果待检样本中有目标大肠杆菌0157:H7，则通过免疫磁珠的特异性反应就达到了目 标菌富集的目的。将此富集的磁珠悬浊液加到第2步所制备的单克隆抗体固定板上，则磁珠悬池液中结合了大肠杆菌0157:H7的磁珠会进一步与固定板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将未结合大肠杆菌0157:H7的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有结合了大肠杆菌0157:H7的磁珠。4.用洗脱液(甲醇等)将固定板上的结合了大肠杆菌0157:H7的磁珠洗脱下来。上磁力架，分离磁珠并用无菌的去离子水清洗1-2次，将离子、溶剂洗去。得到的溶液，用核磁共振仪(匪R20，纽迈公司或miniNMR华东师范大学)测定溶液的Tl和T2，以去离子水为空白，溶液测得的T1/T2与空白比较，有显著差异，说明溶液中有磁珠存在，从而说明样本中有大肠杆菌0157:H7，磁珠的量与T1/T2的下降值呈正比。下降的越多说明磁珠越多，从而间接说明大肠杆菌0157:H7越多，通过加标验证可以定量检测样本中目标菌的数目。
权利要求
1.一种基于r_ Fe2O3OAu复合纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征步骤如下: 1)检测目标菌的特异性免疫磁珠的制备； 2)将目标菌特异性单克隆抗体在固相载体上的固定； 3)免疫磁珠富集目标菌株，并分离:将第I步制得的免疫磁珠加入待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁�。虼胖榫突慵酱懦∫槐撸呱锨逡涸蚩梢苑掷氤龃胖椋舸煅局杏心勘昃虮淮胖樗患由倭课蘧娜ダ胱铀蛐纬赡勘昃拇胖樾匾海� 4)将富集的磁珠悬浊液加到第2步固定了单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉； 5)之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠就是抓到目标菌的磁珠； 6)这部分磁珠，加入无菌的去离子水形成磁珠的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定，在固定场强下，无菌的去离子水的T1/T2是一个恒定值，以无菌的去离子水为空白，测得的悬浊液的弛豫时间T1/T2相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有磁珠，从而间接证明样本中有目标致病菌，磁珠的量与T1/T2的下降呈正比，可以通过加标定量磁珠而间接定量出目标菌的量。
2.根据权利要求1所述的基于r_Fe2O3OAu复合纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述NMR纳米探针为r_ Fe2O3OAu材料，即以金为壳层材料的磁性核壳复合纳米粒子材料，r晶形的纳米粒径小于1000纳米。
3.根据权利要求1所述的基于r-Fe2O3OAu复合纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间特性参数的变化。
4.根据权利要求1所述的基于r_Fe2O3OAu复合纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述NMR弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间(Tl)和自旋_自旋弛豫时间(T2)。
5.根据权利要求1所述的基于r_Fe2O3OAu复合纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述弛豫时间特性，Tl采用180° - T -90°脉冲方法测定，T2采用CPMG序列方法测定。
全文摘要
一种基于γ[email protected]复合纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法法，属于食品安全致病菌快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于食品液体样本中致病菌的核磁共振检测方法，利用γ[email protected]复合纳米材料制备免疫磁珠针对性地富集目标菌株，利用γ[email protected]的顺磁和超顺磁特性对核磁共振衰减信号的弛豫时间的影响，检测出样本中是否含有目标致病菌。不同的具体的对应关系为顺磁免疫磁珠，在一定条件下显示出线性关系，即免疫磁珠含量大，样品的T2/T1值越�。谝欢ǚ段芄欢考觳饽勘昃�。该方法可以用于食品样本中有害致病菌的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。
文档编号G01N24/08GK103091347SQ201310032120
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者张锦胜, 唐群, 赖卫华 申请人:南昌大学
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