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专利名称：依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法。
背景技术：
肝素类药物是抗凝血药的首选药物，使用历史已有70多年，除具有抗凝血、抗血栓作用外，还有降血脂等作用，但具有生物利用度低、副作用大等缺陷，限制了肝素在临床上的应用。近年来具有高抗栓活性和低出血副作用的新一代抗凝药物——低分子量肝素(LMWH)被开发上市。新一代抗凝药的抗血栓作用优于肝素，而抗凝血作用却低于肝素，并具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小、口服易吸收等特点。除用于治疗血栓病外，还可抑制动脉粥样硬化，抗肿瘤、抗炎等，且临床应用无需监护，用药便捷。
低分子量肝素(LMWH)(Robert J.Linhardt, PH.D.And Nur Sibel Guany, M.S,Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25 (3):5-16)是在分离普通肝素时得到的一些低分子量组分，或肝素裂解后产生的小分子片段，长度约普通肝素的1/3。LMWH分子量在3000-8000Da之间，平均分子量为5000Da左右。与普通肝素相比，通过体内、外实验发现，在同等剂量下，LMWH的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于普通肝素。
依诺肝素钠(Enoxaparin Sodium)作为其中的一种低分子肝素，占有低分子肝素60%以上的市场份额，是最为主要的低分子肝素。它通过对猪肠粘膜肝素的苄基酯衍生物进行碱解聚而获得。其中肝素苄基酯的制备中酯化程度的控制是生产工艺的关键。
肝素苄基酯的酯化程度直接影响依诺肝素成品中1，6_脱水结构、分子量及其分布、活性等关键指标的情况，其酯化率决定了后期降解的工艺参数，从而影响和制约依诺肝素钠的生产收率和产品成本，但目前还没有任何一种对肝素苄基酯的酯化率进行检测的方法面世，造成了酯化率控制的实施困难。发明内容
本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法。利用该方法可以简单、快速、准确地监测肝素苄基酯的酯化率，对下一步的降工艺解提供数据支持，从而实现控制依诺肝素钠成品的1，6脱水结构、分子量及其分布、活性等关键指标的目的。
本发明的技术任务是按以下方式实现的:依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于包括以下步骤:
(I)测试液配制
检测液:称取一定量的肝素苄基酯样品，将样品置于碱性环境下使其发生beta-消除反应以生成苯甲醇，反应一定时间后加入冰乙酸终止反应，并用超纯水稀释定各，备用;
对照液:称取一定量的苯甲醇标准品，加入超纯水溶解，备用；
(2)样品检测利用辛基硅胶柱，采用带紫外检测器的高效液相色谱仪对步骤(I)所述检测液和对照液做进样检测，并通过如下公式计算得到酯化率X:
权利要求
1.依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于包括以下步骤: (1)测试液配制 检测液:称取一定量的肝素苄基酯样品，将样品置于碱性环境下使其发生beta-消除反应以生成苯甲醇，反应一定时间后加入冰乙酸终止反应，并用超纯水稀释定容，备用；对照液:称取一定量的苯甲醇标准品，加入超纯水溶解，定容，备用； (2)样品检测 利用辛基硅胶柱，采用带紫外检测器的高效液相色谱仪对步骤(I)所述检测液和对照液做进样检测，并通过如下公式计算得到酯化率X:
2.根据权利要求1所述的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于，步骤(I)中检测液的配制过程为:称取0.5 1.0g肝素苄基酯样品于反应容器中，加入IOml的5mol/L的氢氧化钠溶液溶解，水浴控温60 70°C，反应120分钟，加入IOml冰乙酸终止反应，用超纯化水稀释定容至100ml，摇匀，备用。
3.根据权利要求1所述的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于，步骤⑵中高效液相色谱仪所用流动相为甲醇、乙腈的混合水溶液，甲醇、乙腈、超纯水的体积比为10: 20: 70。
4.根据权利要求1所述的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于，步骤(2)中高效液相色谱仪的紫外检测波长为256nm，流速为1.0±0.lml/min。
5.根据权利要求1所述的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于，步骤(2)中辛基硅胶柱的内径为4.6_，长为150_，每米检测柱的理论塔板数不低于20000。
全文摘要
本发明公开了一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，属于生物医药领域。该方法采用反相液相色谱法，利用带紫外检测器的高效液相色谱仪对肝素苄基酯在碱性环境下脱落生成的苯甲醇进行定量检测，并以此反映肝素苄基酯的酯化率，从而达到控制依诺肝素钠成品质量的目的。与现有技术相比，本发明的检测方法可以简单、快速、准确地监测肝素苄基酯的酯化率，从而降低依诺肝素钠成品的不合格风险和企业生产成本，具有很好的推广应用价值。
文档编号G01N30/02GK103175925SQ20131008828
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者周霞, 林勇 申请人:山东辰中生物制药有限公司